Академический Документы
Профессиональный Документы
Культура Документы
Условие: Даны количество биополимера (ДНК или олигонуклеотид) или объем и концентрация
реакционной смеси, коэффициент избытка радиоактивного препарата, его удельная и объемная
активности и время хранения. В более сложных вариантах задачи вместо количества или
концентрации даны оптическая плотность и коэффициент экстинции. Определить необходимый для
проведения реакции объем радиопрепарата (пояснение: как правило нужное количество
радиопрепарата перед реакцией лиофильно высушивается, так что его объем не влияет на объем
реакционной смеси).
(конкретный пример 1): Какой объем препарата α-32P-ATP с начальными удельной активностью 1000
Ci/mmol и объемной активностью 20 µCi/µl нужно взять в реакцию мечения фрагмента ДНК методом
достройки 5’-выступающих концов ДНК-полимеразой, если при достройке каждого из концов ДНК
включается 2 молекулы ATP. Объем реакционной смеси составляет 50 µl, концентрация ДНК - 2 µM,
молярный избыток α-P32-ATP должен составлять 1.5. Срок хранения радиоактивного препарата
составлял 28.5 суток. Теоретическая (максимальная) удельная активность P32 составляет 9200
Ci/mmol, T1/2 = 14.3 суток. Считать, что в результате радиоактивного распада содержащая
распавшийся атом молекула также распадается.
(конкретный пример 2): Какой объем препарата γ-P32-ATP с начальными удельной активностью 1000
Ci/mmol и концентрацией 20 µCi/µl нужно взять в реакцию мечения с использованием
полинуклеотидкиназы 0.004 о.е. 260A олигонуклеотида с 260ε = 200 о.е./мкмоль, если молярный
избыток γ-32P-ATP по отношению к олигонуклеотиду должен составлять 1.5. Срок хранения
радиоактивного препарата составлял 7 суток. Теоретическая (максимальная) удельная активность 32P
составляет 9200 Ci/mmol, T1/2 = 14.3 суток. Считать, что в результате радиоактивного распада
содержащая распавшийся атом молекула также распадается.
Условие (вариант 1): При определении эффективности включения радиоактивной метки в продукт
ферментативной реакции студент использовал счетчик Гейгера. Измерив радиоактивность аликвоты
образца, нанесенной на целлюлозу, до и после отмывки невключившегося радиопрепарата, он
получил значения C0 и C1 CPS соответственно, на основании чего студент определил эффективность
включения как C1/C0. Прав ли он (объясните), а если нет, то какова реальная эффективность
включения? Предельное значение CPS (CPS следующих подряд без пауз импульсов) использованного
счетчика составляет Cmax, импульсы считать равномерно распределенными во времени.
Условие (вариант 2): Измерив радиоактивность образца, нанесенного на целлюлозу, с
использованием двух разных счетчиков Гейгера (с различными предельными значениями CPS),
студент получил разные значения. Почему? Какое значение он получил на счетчике с пределом
Cmax2 CPS, если на счетчике с пределом Cmax1 CPS получилось C1 CPS? Импульсы считать
равномерно распределенными во времени.
Условие (вариант 3): Руководитель попросил студента определить среднюю радиоактивность N
образцов с использованием счетчика Гейгера, измеряя радиоактивность каждого образца отдельно.
Для экономии времени студент поместил все образцы на детектор счетчика одновременно и разделил
результат на количество образцов, получив при этом Cstud CPS. Правильно ли он поступил (почему)?
Какое значение он бы получил, если бы послушался руководителя, при условии, что образцы были
абсолютно одинаковыми. Предел использованного счетчика составляет Cmax CPS, импульсы считать
равномерно распределенными во времени.
Условие: Оценить суммарное количество (по массе) ДНК плазмиды, содержащей вставку, выделенное
из бактериальной культуры, по результатам окрашивания EtBr геля агарозы после аналитического
электрофореза продуктов гидролиза части препарата эндонуклеазой рестрикции, вырезающей вставку
из состава плазмиды. Длина плазмиды (pBlueScript) без вставки 3000 н.п. На гель наносили 1/60
выделенной плазмиды по массе. В качестве маркера используется гидролизат плазмиды pQpR’(длина
интактной плазмиды около 7000), содержащий фрагменты следующих длин: 1326 919 762 587 540
504 458 434 307 267 234 213 184 124 88 80 54 52 21 18. Электрофорез <дата>, препарат <№>.
Схема решения: Для ПРИБЛИЗИТЕЛЬНОЙ(!) оценки количества ДНК следует прежде всего выбрать
среди фрагментов маркера тот, интенсивность которого наиболее близко соответствует интенсивности
фрагмента анализируемого препарата. Массу выбранного фрагмента легко определить, зная
суммарную массу гидролизата (указана на фото электрофореза) и длину выбранного фрагмента,
поскольку все фрагменты содержатся в гидролизате в эквимолярных количествах и масса каждого
пропорциональна его длине. После определения таким образом примерной массы вырезаемого
эндонуклеазой фрагмента остается только определить массу полной плазмиды, которая во столько же
раз больше массы фрагмента, во сколько длина исходной плазмиды больше длины фрагмента.
Следует учесть, что в некоторых препаратах вырезается несколько фрагментов, - для расчета можно
использовать любой из них. Полученную массу плазмиды следует умножить на 60, т.к. анализу
подвергали 1/60 препарата. Следует еще раз отметить, что оценка по интенсивности окраски EtBr
является весьма приблизительной (погрешность может достигать сотен %) и никакое сравнение
интенсивностей, кроме выявления примерно одинаковых, без применения специальных методов
регистрации невозможно.
Условие (вариант 1): При проведении электрофореза в камере длиной L1 см в течение T1 час при
напряжении V1 V длина миграции лидирующего красителя составила X1 см. Какое время необходимо
вести электрофорез в камере длиной L2 см при напряжении V2 V если длина миграции лидирующего
красителя должна составить X2см ?.
Условие (вариант 2): При проведении электрофореза в камере длиной L1 см в течение T1 час при
напряжении V1 V длина миграции лидирующего красителя составила X1 см. Какое напряжение
необходимо установить в камере длиной L2 см чтобы лидирующий краситель мигрировал за то же
время на X2 см ?
Условие (вариант 3): При проведении электрофореза в камере длиной L1 см в течение T1 час при
напряжении V1 V длина миграции лидирующего красителя составила X1 см. Какое расстояние
пройдет лидирующий краситель за то же время в камере длиной L2 см при напряжении V2 V?
Схема решения: Учитывая, что пройденное красителем расстояние равно произведению времени на
скорость миграции, а скорость миграции пропорциональна напряженности эл. поля, а она, в свою
очередь, определяется отношением напряжения к длине камеры, решение данной задачи сводится к
расчету соответствующих пропорций.
Схема решения: Для вычисления концентраций в зонах после их полного формирования (достижения
равновесия) следует использовать зависимость соотношения концентраций анионов в соседних зонах
от их подвижностей и подвижности катиона. Можно поочередно определить концентрации зон,
начиная с ближайшей к зоне лидирующего аниона, концентрация которого считается неизменной. На
самом деле порядок и число зон не влияют на их концентрации, которые зависят только от
соотношения подвижностей аниона, составляющего зону, и лидирующего (почему?). После
определения равновесной концентрации ширину зоны легко определить, зная исходную ширину и
концентрацию, и учитывая, что ширина (пропорциональная объему при неизменном сечении) обратно
пропорциональна концентрации (следствие закона сохранения вещества ).
Условие (вариант 1): pKa одноосновной кислоты составляет 4.0. Каков будет средний заряд молекулы
этой кислоты (в зарядах электрона) при pH 3.0? pH 4.0? pH 5.0? pH 6.0?
Условие (вариант 2): Вещество содержит две ионогенные группы: кислоту с pKa 3.0 и основание с
pKa 7.0. При каком pH это вещество не будет иметь заряда? Какова при этом степень диссоциации
ионогенных групп?
Условие (вариант 3): При проведении электрофореза содержащего 2 ионогенные группы (кислоту с
pKa 4.0 и основание с pKa 7.0) вещества при pH 7.0 в камере длиной 40 см в течение 4 час при
напряжении 120 V длина миграции анионов составила 30 см. Сколько времени надо вести
электрофорез при 90 V для достижения той же длины миграции при pH 8.0? pH 6.0?
Условие (вариант 1): Определить время, в течение которого можно вести электрофорез в
горизонтальном аппарате с буфером TBE (50mM Tris pKa = 8.3, 40mM H3BO3 pKa1 ~ 8.5; pH буфера =
8.5) при токе 20mA (0.02A) при условии изменения pH электродных камер не более чем на a) 1.0 b)
2.0. Объем каждой электродной камеры считать равным 0.3 л. Число Фарадея = 96500 A*сек / г-экв.
Условие (вариант 2): Определить время, в течение которого можно вести электрофорез в
горизонтальном аппарате с буфером TAE (40mM Tris pKa = 8.3, 20mM CH3COOH pKa = 4.75; pH
буфера = 8.3) при токе 50mA (0.05A) при условии изменения pH электродных камер не более чем на a)
1.0 b) 2.0. Объем каждой камеры считать равным 0.3 л. Число Фарадея = 96500 A*сек / г-экв..
Условие (вариант 3): Определить время, в течение которого можно вести электрофорез в
горизонтальном аппарате с буфером TSE (30mM Tris pKa = 8.3, 50mM HOCH2CH(NH2)COOH
(Serine) pKa1 = 9.21, pKa2 = 2.20; pH буфера = 8.6) при токе 50mA (0.05A) при условии изменения pH
электродных камер не более чем на a) 1.0 b) 2.0. Объем каждой электродной камеры считать равным
0.6 л. (Число Фарадея = 96500 A*сек / г-экв. ).
Условие (вариант 4,5,6): Более сложные варианты задач полностью аналогичны 1, 2, 3, за
исключением того, что задан только начальный состав, но не начальный pH буфера. Последний
также необходимо определить.
Условие: Для полного осаждения частиц в роторе Beckman SW 65 Ti (Swing bucket, rmin=41.2mm,
rmax=89.0mm) из полностью заполненной пробирки требуется 1 час при 30000 об/мин. Определить
коэффициент седиментации частиц в S. Сколько времени потребуется для полного осаждения частиц
в роторе Beckman SW 55 Ti (Swing bucket, rmin=60.8mm, rmax=108.5mm) при 40000 об/мин?
Схема решения: Применив формулу, связывающую радиус частицы на заданный момент времени с
начальным радиусом, угловой скоростью и коэффициентом седиментации, к частице, которая в
начальный момент времени находилась на поверхности образца ( r0 = rmin ), и которая за время
центрифугирования согласно условию тоже достигла дна ( r1 = rmax ), легко получить коэффициент
седиментации (обратите внимание, что по условию задачи его нужно выразить в Сведбергах ). Тот
же подход используется и при решении второй части задачи, только теперь неизвестно время при
известном коэффициенте седиментации.
Схема решения: Применив формулу, связывающую радиус частицы на заданный момент времени с
начальным радиусом, угловой скоростью и коэффициентом седиментации, к частице с б'ольшим S,
которая в начальный момент времени находилась на поверхности образца ( r0 = rmin ), и которая за
время центрифугирования согласно условию тоже достигла дна ( r1 = rmax ), легко получить время,
необходимое для полной седиментации более тяжелых частиц. Затем с использованием той же
зависимости необходимо определить минимальный радиус, имея который (или б'ольший) легкие
частицы также успеют достигнуть дна за время центрифугирования. Считая пробирку
цилиндрической (пренебрегая закруглением дна), можно оценить долю попадающих в осадок легких
частиц, как отношение объемов (или высот ) соответствующих цилиндров: объема, из которого
частицы успеют достигнуть дна к общему объему пробирки.
Задача 06a (хроматография: основные понятия)
Условие: Объем удержания и ширина пика для веществ A и B с коэффициентами распределения KDA =
0.6 и KDB = 1.4 составили соответственно VRA = 2.4 мл, WA = 0.2 мл, VRB = 5.2 мл, WB = 0.3 мл.
Определить объем носителя (мертвый объем) и объем сорбента использованной хроматографической
системы, а также коэффициент разделения и степень разделения веществ.
Схема решения: Как следует из названия, для решения данной задачи необходимы лишь выражения,
определяющие соответствующие "основные понятия", а также выражение VR(i) = V0 + KD(i)VS . При
известных KD и VR для двух разных веществ V0 и VS не составляет труда определить, решив
элементарную систему двух линейных уравнений. KC = KD(2) / KD(1) (или наоборот ) по
определению. Вся необходимая информация для вычисления степени разделения RS (в соответствии с
определением) в условии задачи также имеется.
Схема решения: Фактически в условии даны координаты максимумов (время удержания) и ширины
пиков по уровню 0.5макс., т.е. имеется вся необходимая информация для вычисления степени
разделения RS (в соответствии с ее определением). Используя информацию о том, что Nэфф для
обоих веществ одинаковы, можно легко вычислить свободный объем системы (V0), приравняв
соответствующие выражения для Nэфф(1) и Nэфф(2) и решив получившееся уравнение относительно
V0 .После этого останется только подставить найденное значение в выражение для Nэфф любого из
веществ. Зная RS и Nэфф, можно определить Kc, используя выражение зависимости RS от Nэфф.