UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS CURSO DE GRADUAO EM MEDICINA ICB INSTITUTO DE CINCIAS BIOLGICAS DEPARTAMENTO DE BIOQUMICA E IMUNOLOGIA

Trabalho de Bioqumica

Outubro 2011

Gabriela Maria Mendona Chaves Gabriela Mendes Xavier Gabriela Neves Vaz Galileu Chagas Loureno Geander Gaburro Bacheti Giovanna Vieira Moreira Guilherme Garcia Pessoa

Relatrio referente s aulas prticas AP2

Trabalho apresentado disciplina de bioqumica do curso de graduao da Faculdade de Medicina da Universidade Federal de Minas Gerais como requisito parcial para obteno de nota. Professores: Ronaldo Nagem Fabiana Machado

Maio / 2011 Departamento de Bioqumica e Imunologia ICB Instituto de Cincias Biolgicas Curso de Graduao em Medicina

Introduo Algumas protenas assumem, na clula, funo cataltica, aumentando a velocidade de determinadas reaes metablicas. Tratam-se de ENZIMAS , que , como catalisadores biolgicos, apresentam reao uma via alternativa. Possuem alta especificidade com seus substratos, sendo indispensveis na maioria das reaes metablicas. Tais protenas atuam ligando-se ao substrato atravs de varias interaes no covalentes, tais como foras de Van der Waals, fora eletroesttica e pontes de hidrognio. Ao serem formadas, tais interaes liberam energia, que tambm atuam na diminuio da energia de ativao, e criam modificaes conformacionais no substrato de forma a induzilo para um estado favorvel formao de produto. Alguns fatores podem influenciar na ao enzimtica, como: temperatura, pH, termolabilidade, concentrao enzimtica e concentrao de substratos. Em nossa segunda aula prtica trabalhamos com esses polipeptdeos afim de conhecer e confirmar tais caractersticas bsicas . Alm disso , aprendemos a manipul-los experimentalmente.

Objetivos Manipular experimentalmente solues de enzimas Identificar experimentalmente as propriedades de termolabilidade e especificidade Manipular reaes catalisadas por enzimas com a finalidade de determinar semi-quantitativamente a influncia da concentrao de enzimas, da temperatura e do pH na atividade enzimtica O significado das operaes realizadas

Experimento I Influncia da temperatura sobre a atividade enzimtica Procedimentos Colocamos, em trs tubos de ensaio, 1ml de soluo de pepsina e 1ml de HCl 0,01N. Um dos tubos, o tubo 1, foi colocado em banho de gelo; o tubo 2 permaneceu temperatura ambiente; o tubo 3 foi colocado em banho maria a 37C. Aps 5 minutos, adicionamos aos trs tubos fragmentos de fibrina corada pelo vermelho congo e recolocamos os mesmo nas respectivas temperaturas por cerca de 45 minutos. Aps esse tempo, agitamos os tubos para observar os resultados.

Resultado A soluo do tubo 3 assumiu uma colorao mais intensa e homognea, em tom de bord escuro. J na soluo do tubo 2, a colorao verificada no era to homognea e forte quanto a do tubo 3. No tubo 1, houve precipitao dos fragmentos de fibrila vermelho congo e sua colorao era de carter mais brando, praticamente incolor, em relao aos demais tubos.

Concluso A hidrlise do substrato foi mais intensa no tubo 3, indicando que a atividade enzimtica mais efetiva a 37C, temperatura a qual foi submetido esse tubo. Logo, conclui-se que enzimas possuem uma atividade mais acentuada em determinada temperatura, denominada temperatura tima.
Atividade enzimtica

Temperatura tima (tubo 3)

Grfico 1.0 Atividade enzimtica da pepsina em funo da temperatura. Em destaque, temperatura tima desta enzima.

T (C)

Experimento II Influncia do pH sobre a atividade enzimtica Procedimentos Separamos dois tubos de ensaio. No tubo 1, colocamos 1 mL de pepsina, 1mL de HCl 0,01N e 1 mL de gua destilada, o que resultou em um pH aproximado de 1,5. No tubo 2, foram colocados 1 mL de pepsina, 1mL de HCl 0,01N, 1 mL de tampo 0,1 M e pH 8, o que resultou em um pH aproximadamente 7. Depois, adicionamos aos dois tubos de ensaio fragmentos de fibrina vermelho congo e os colocamos em banho maria a 37C., por 60 minutos. Aps o tempo decorrido os tubos foram agitados para observao dos resultados.

Resultado No tubo 1 a hidrlise da fibrina ocorreu com maior intensidade. Logo, o lquido presente no tubo passou de incolor para uma colorao vermelho intenso. No entanto, no tubo 2 ocorreu uma hidrlise de menor intensidade ficando o lquido praticamente incolor.

Concluso Ao adicionarmos a quantidade indicada de HCl no tubo 1 juntamente com a enzima pepsina, obtivemos um pH de aproximadamente 1,5; pH timo da enzima em questo. Logo, a atividade enzimtica foi mais eficaz no tubo 1 em comparao com o tubo 2, que possua um pH em torno de 7,0.
Atividade enzimtica

Tubo 1

Tubo 2

Grfico 2.0 Atividade enzimtica da enzima pepsina em funo do pH. Em destaque, pH timo desta enzima.

1,5

pH

Experimento III Especificidade enzimtica Procedimentos Coletamos 1mL de saliva. Separamos quatro tubos de ensaio e colocamos: no tubo 1, 1mL de sacarase e 1mL de sacarose a 1%; no tubo 2, 1mL de sacarase e 1 mL de amido a 1%; no tubo 3, 1mL de saliva e 1mL de sacarose a 1%; no tubo 4, 1mL de saliva e 1mL de amido a 1%. Os quatro tubos foram deixados por 20 minutos temperatura ambiente e, aps adicionar a cada um 1mL de reagente de Benedict, foram aquecidos at a ebulio. Aps esse procedimento, observamos os resultados.

Resultado 1o - 1mL de sacarase + 1mL de sacarose a 1% + 1mL do reagente de Benedict: soluo marrom esverdeada. 2o - 1mL de sacarase + 1mL de amido a 1% + 1mL do reagente de Benedict: soluo azul. 3o - 1mL de saliva + 1ml de sacarose a 1% + 1mL do reagente de Benedict: soluo azul. 4o 1mL de saliva + 1mL de amido a 1% + 1mL do reagente de Benedict: soluo marrom amarelada.

Concluso O reagente de Benedict geralmente usado para detectar a presena de acares, sendo que, quando h atividade enzimtica a soluo muda de cor. Como as solues no 1 e 4 tubos passaram de azul para verde e posteriormente para uma colorao marrom tijolo, conclui-se que a sacarase hidrolisa a sacarose, mas no o amido. J a amilase salivar hidrolisa o amido, mas no a sacarose. Isso comprava a especificidade enzimtica.

Experimento IV Termolabilidade Procedimentos Colocamos em dois tubos 1mL de sacarase e 1mL de gua destilada. O tubo 1, foi fervido diretamente na chama e resfriado sob gua corrente. Depois, adicionamos aos dois tubos 1mL de sacarose a 1% e os deixamos incubados em banho maria, a 37C, por 10 minutos. Decorrido esse tempo, adicionamos aos tubos 1mL do reagente de Benedict e os aquecemos at a ebulio. Aps esse procedimento, observamos os resultados.

Resultado Ao final do experimento, a colorao do tubo 1 permaneceu azul e a do tubo 2 passou de azul para esverdeado.

Concluso S houve atividade da enzima sacarase no tubo 2. Isso foi observado pela colorao laranjaacobreada da soluo desse tubo, que indica a reduo do Cu+ a Cu+ do reagente de Benedict, que ocorre devido presena de acar redutor. Os acares redutores nesse experimento eram a glicose e a frutose, resultantes da degradao da sacarose pela ao da sacarase. No tubo 1 no houve reao entre enzima e substrato, pois ao ferver a soluo contendo a enzima, houve desnaturao desta e consequente perda de sua atividade. A no ocorrncia da reao comprovada pela cor da soluo com adio do reagente de Benedict aps o aquecimento, que fica azul e no laranja-acobreado.

Experimento V Influncia da concentrao da enzima Procedimento Separamos sete tubos de ensaio e colocamos sacarase, gua destilada e sacarose, em cada um deles, da maneira descrita na tabela:
Tubos 1 2 3 4 5 Sacarase 0,2mL 0,5mL 1mL _ 1mL gua destilada 0,8mL 0,5mL _ 1mL 1mL Sacarose a 1% 1mL 1mL 1mL 1mL _ (Tabela 1.1)

Incubamos todos os tubos em banho maria, a 37C, por 10 minutos. Aps esse tempo, adicionamos 1mL do reagente de Benedict em cada tubo, que depois foram aquecidos at a ebulio. Aps esse procedimento, observamos os resultados.
Resultado Tubos 1 2 3 4 5 Sacarase 0,2 mL 0,5 mL 1 mL _ 1 mL gua destilada 0,8 mL 0,5mL _ 1 mL 1mL Sacarose a 1% 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL _ Colorao adquirida Esverdeada Esverdeada+ Esverdeada++ Verde-azulado Azulada (Tabela 1.2)

Obs.: os sinais de + indicam a intensidade da colorao adquirida.

Concluso Neste experimento, houve reduo do cobre nos tubos 1, 2 e 3, j que em todos eles havia sacarose, um acar que hidrolisado em monossacardeos redutores, e a enzima sacarase. Porm, atravs da interpretao dos dados da tabela 1.2 e dos resultados experimentais, verificou-se variao no grau de reduo do cobre em cada tubo, expressado pela variao na intensidade da colorao obtida em cada um deles. Era esperado que a colorao do tubo 4 fosse mais azulada por no ocorrer reduo da sacarose, uma vez que est ausente a sacarase. Algumas hipteses podem explicar o ocorrido: Troca de numerao dos tubos; Pipetagem errada dos reagentes no tubo 4; Contaminao ou lavagem inadequada dos instrumentos; Aquecimento inadequado dos tubos; Apesar da alterao no resultado do tubo 4 conclumos que a concentrao de enzimas influencia na intensidade da catlise e consequentemente na colorao final das solues.

Consideraes Finais A partir dessa atividade prtica compreendemos como a concentrao das enzimas, temperatura, especificidade e pH influenciam nas reaes catalisadas. Percebemos tambm que na realizao da prtica nem sempre os resultados esperados so obtidos devido a combinao de vrios fatores.

Questes 1. Fazer um grfico mostrando a atividade enzimtica em funo da concentrao de enzima.

2. Fazer um grfico terico da atividade enzimtica em funo da temperatura e indicar no mesmo a parte observada experimentalmente.
Temperatura tima (tubo 3)

Atividade enzimtica

T (C)

3. Fazer um grfico terico da atividade enzimtica em funo do pH e indicar no mesmo a parte observada experimentalmente.
Atividade enzimtica

Tubo 1

Tubo 2

4. Das propriedades estudadas neste trabalho prtico, aquela que mais caracterstica da catlise enzimtica : temperatura. 5. Explicar por que o 1, aquecimento at a pH fervura determina perda de 7 atividade das enzimas. 5 Com o aumento da temperatura a protena perde a sua estrutura tridimensional e desnatura-se. Essa desnaturao afeta as interaes fracas de forma que a conformao protica sofre uma perda abrupta de estrutura em determinada faixa de temperatura, o que sugere que o desenovelamento um processo cooperativo: a perda de estrutura em uma parte da protena desestabiliza as outras partes. O aumento da temperatura pode ser, ate certo ponto , benfico para a atuao enzimtica pois pode criar um meio com uma temperatura tima para a atividade da enzima. No entanto, o aquecimento excessivo pode acarretar em quebra de ligaes no covalentes que estabilizam a molcula da enzima , tais como pontes de hidrognio, ligaes de Van der Waals, interaes eletrostticas, e so responsveis por dar forma a mesma. Como na bioqumica, a forma das biomolculas determinam suas funes, esse fenmeno causa perda da atividade cataltica, caracterizando, pois, uma desnaturao enzimtica. 6. Citar as enzimas, seus respectivos substratos e produtos que foram utilizados neste trabalho prtico.

Enzimas Sacarase Pepsina Amilase Salivar

Substratos Sacarose Protena Glicognio e Amido

Produtos Glicose e Frutose Proteoses e Peptonas Maltose