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1. En qu se basan las separaciones por Cromatografa de Lquidos de Alta Resolucin HPLC 2.

Qu tipos de cromatografa se pueden llevar a cabo en un equipo HPLC

Hay cinco mtodos cromatogrficos:

Cromatografa de Reparto:
o o

Cromatografa en fase normal. Cromatografa en fase reversa.

Cromatografa inica. Cromatografa de Exclusin. Cromatografa de adsorcin.

3. Defina los sig. Trminos: a) Cromatografa en fase normal, b)cromatografa en fase inversa, c)Cromatografa isocrtica, d) cromatografa por gradiente: a) Cromatografa de fase normal: La cromatografa de fase normal o "Normal phase HPLC" (NP-HPLC) fue el primer tipo de sistema HPLC utilizado en el campo de la qumica, y se caracteriza por separar los compuestos en base a su polaridad. Esta tcnica utiliza una fase estacionaria polar y una fase mvil apolar, y se utiliza cuando el compuesto de inters es bastante polar. El compuesto polar se asocia y es retenido por la fase estacionaria. La fuerza de absorcin aumenta a medida que aumenta la polaridad del compuesto y la interaccin entre el compuesto polar y la fase estacionaria polar (en comparacin a la fase mvil) aumenta el tiempo de retencin.La fuerza de interaccin no slo depende de los grupos funcionales del compuesto de inters, sino tambin en factores estericos de forma que los ismeros estructurales a menudo se pueden diferenciar el uno del otro. La utilizacin de disolventes ms polares en la fase mvil disminuye el tiempo de retencin de los compuestos mientras que los disolventes ms hidrofbicos tienden a aumentar el tiempo de retencin. b) Cromatografa de fase inversa: La HPLC de fase reversa (RP-HPLC) consiste en una fase estacionaria apolar y una fase mvil de polaridad moderada. Una de las fases estacionarias ms comunes de este tipo de cromatografa es la silica tratada con RMe2SiCl, dnde la R es una cadena alquil tal como C18H37 o C8H17. El tiempo de retencin es mayor para las molculas de naturaleza apolar, mientras que las molculas de carcter polar eluyen ms rpidamente.

El tiempo de retencin aumenta con la adicin de disolvente apolar a la fase mvil y disminuye con la introduccin de disolventes ms hidrofobicos. La cromatografa de fase reversa es tan utilizada que a menudo se lo denomina HPLC sin ninguna especificacin adicional. La cromatografa de fase reversa se basa en el principio de las interacciones hidrofbicas que resultan de las fuerzas de repulsin entre un disolvente relativamente polar, un compuesto relativamente apolar, y una fase estacionaria apolar. La fuerza conductora en la unin del compuesto a la fase estacionaria es la disminucin del rea del segmento apolar del analito expuesto al disolvente.Este efecto hidrofbico est dominado por la disminucin de laenerga libre de la entropa asociada con la minimizacin de la interfase compuesto-disolvente polar. El efecto hidrofbico disminuye con la adicin de disolvente apolar a la fase mvil. Esto modifica el coeficiente de particin de forma que el compuesto se mueve por la columna y eluye. Las caractersticas del compuesto de inters juegan un papel muy importante en la retencin. En general, un compuesto con una cadena alquil larga se asocia con un tiempo de retencin mayor porque aumenta la hidrofobicidad de la molcula. Aun as, las molculas muy grandes pueden ver reducida la interaccin entre la superficie del compuesto y la fase estacionaria. El tiempo de retencin aumenta con el rea de superficie hidrofbica que suele ser inversamente proporcional al tamao del compuesto. Los compuestos ramificados suelen eluir ms rpidamente que sus ismeros lineales puesto que la superficie total se ve reducida. Aparte de la hidrofobicidad de la fase inmvil, otras modificaciones de la fase mvil pueden afectar la retencin del compuesto; por ejemplo, la adicin de sales inorgnicas provoca un aumento lineal en la tensin superficial, y como que la entropa de la interfase compuesto-disolvente est controlada precisamente por la tensin superficial, la adicin de sales tiende a aumentar el tiempo de retencin. Otra variable importante es el pH puesto que puede cambiar la hidrofobicidad del compuesto. Por este motivo, la mayora de mtodos utilizan un tampn como el fosfato de sodio para controlar el valor del pH. Estos tampones controlan el pH, pero tambin neutralizan la carga o cualquiera resto de silica de la fase estacionaria que haya quedado expuesta y actan como contraiones que neutralizan la carga del compuesto. El efecto de los tampones sobre la cromatografa puede variar, pero en general mejoran la separacin cromatogrfica. Las columnas de fase reversa se echan a perder con menor facilidad que las columnas de silica normales. Aun as, muchas columnas de fase reversa estn formadas por silica modificada con cadenas alquil y no se deben utilizar nunca con

bases en medio acuoso puesto que stas podran daar el esqueleto de silica subyacente. Las columnas se pueden utilizar en cidos en medio acuoso pero no deberan estar expuestas demasiado tiempo al cido porque puede corroer las partes metlicas del aparato de HPLC. c) Cromatografa isocrtica: condiciones experimentales constantes, lo que significa composicin constante de la fase mvil ( polaridad constante) lo que equivale a temperatura constante en cromatografa de gases (separacin isoterma; Elucin isocrtica; Utiliza una fase mvil de composicin constante d) Cromatografa gradiente; Dos o mas disolventes de polaridad distinta cuya relacin cambia a lo largo de la elucin cromatogrfica

4. Describir los componentes bsicos de un sistema HPLC y por lo menos 4 tipos de detectores que se utilizan Componentes bsicos en un equipo de HPLC: De forma esquemtica los componentes bsicos son: Sistema de suministro, Inyector Columna Detector Registrador Bombeo y conducciones de la fase mvil

SISTEMA SUMINISTRO DE LA FASE MVIL: Se trata de un reservorio o varios reservorios para los disolventes. Sirve para desgasificar y eliminar partculas en suspensin de los disolventes que interfieren formando burbujas en los sistemas de deteccin. SISTEMA DE BOMBEO DE LA FASE MVIL: Se usan bombas para impulsar a la fase mvil y deben cumplir los siguientes requisitos:

Deben vencer altas presiones. Proporcionar caudales estables entre 0,1 y 10mL/min. Deben estar libres de pulsaciones y tener volmenes muertos pequeos. Deben estar construidas de materiales resistentes a la presin y a las agresiones qumicas. Fcil manejo y mantenimiento.

Se utilizan tres tipos de bombas :


Bombas recprocas Bombas de desplazamiento Bombas neumticas.

INYECTORES: Son los encargados de introducir la muestra en la cabeza de la columna de forma reproducible y adecuada. Hay dos tipos de inyectores

Septum: Inyecta la muestra mediante una jeringa. Se usa poco y no permite mucha presin. Bucle de muestreo: Este dispositivo normalmente se encuentra integrado en el equipo cromatogrfico y existen bucles intercambiables que permiten la eleccin de tamaos de muestra.

PRECOLUMNAS Se colocan delante de la columna para eliminar la materia en suspensin y los contaminantes de los disolventes. La composicin del relleno debe ser semejante al

de la columna. Aunque el tamao de partcula es mayor para minimizar la cada de presin. En muchas ocasiones se usan para aumentar la vida de la columna. COLUMNA: Normalmente son de acero inoxidable de dimetro interno uniforme aunque en ocasiones se encuentran tubos de vidrio de paredes resistentes. La mayora de las columnas de cromatografa de lquidos tienen una longitud entre 10 y 30 cm. Generalmente son rectas y se pueden alargar, si es necesario, acoplando dos o ms columnas. El dimetro interno de las columnas es a menudo de 4 a 10 mm y los tamaos de las partculas de los rellenos ms comunes son 3, 5 y 10 m. Los empaquetados ms comunes son de partculas de slice pero tambin se usa la almina, polmeros porosos y resinas de intercambio inico. La columna ms utilizada es la de 25 cm de longitud y 4,6 mm de dimetro interno, empaquetada con partculas de 5 m. Estas columnas tienen de 40.000 a 60.000 platos/metro. Desde hace poco, se han empezado a fabricar columnas de alta resolucin ms rpidas, las cuales tienen menores dimensiones que las anteriormente descritas. Estas columnas pueden tener dimetros internos que oscilan entre 1 y 4,6 mm y se rellenan con partculas de 3 o 5 m.A menudo su longitud es de 3 a 7,5 cm. Pueden tener hasta 100.000 platos/metro y presentan la ventaja de la rapidez y del mnimo consumo de disolvente caracterstica muy importante ya que los disolventes de alta pureza que se requieren en cromatografa de lquidos son muy caros. DETECTORES: A diferencia de la cromatografa de gases, en HPLC no existen detectores tan universalmente aplicables, ni tan fiables tampoco. En lo que si coinciden cromatografa de gases y HPLC, son las cualidades enumeradas en los detectores de cromatografa de gases. En HPLC existen dos tipos bsicos de detectores:

Los basados en una propiedad de la disolucin: Que corresponden a una propiedad de la fase mvil, como el ndice de refraccin, la constante dielctrica, la densidad... Los basados en una propiedad del soluto: Es decir, responden a alguna de las propiedades del soluto, como la absorbancia UV, fluorescencia, intensidad de difusin, que no son propias de la fase mvil.

En la siguiente tabla se presentan los detectores ms comunes empleados en HPLC y algunas de sus propiedades ms importantes:

Detectores ms comnmente usados en HPLC. Paso a hacer una breve descripcin de algunos de ellos:

Detectores de Absorbancia: Miden la absorbancia de los efluyentes de una columna cromatogrfica. Muchos detectores de absorbancia son dispositivos de doble haz, uno de los haces pasa por la cubeta de flujo y el otro a travs de un filtro que reduce su intensidad. Para comparar las intensidades de los dos haces se usan detectores fotoelctricos contrastados. En cualquier caso, el cromatograma consiste en una representacin en funcin del tiempo del logaritmo del cociente de las dos seales transducidas. Tambin se utilizan instrumentos de un solo haz, en cuyo caso, las medidas de intensidad del disolvente se almacenan en la memoria de un ordenador y al final se recuperan para el clculo de la absorbancia. Detectores de Fluorescencia: La fluorescencia es detecta por medio de un detector fotoelctrico colocado perpendicularmente respecto al haz de excitacin. Los detectores ms sencillos utilizan una fuente de excitacin de mercurio, y uno o ms filtros para aislar la radiacin fluorescente.

Detectores de ndice de refraccin: Los detectores de ndice de refraccin tienen la ventaja de que responden a casi todos los solutos. Es decir, son detectores universales anlogos a los detectores de llama en cromatografa de gases. Se aade que son fiables, no dependen del caudal, son muy sensibles a los cambios de temperatura, y se han de mantener a una temperatura constante. Por otra parte, no son tan sensibles como la mayora de los otros detectores, y por lo general no se pueden utilizar en la elucin con gradiente. Detector de dispersin de luz: El efluyente de la columna pasa a un nebulizador donde se convierte en una fina niebla gracias a un flujo de nitrgeno o aire. Estas finas gotitas pasan por un tubo de conduccin a una determinada temperatura de forma que se evapora la fase mvil y se originan partculas de analito. Estas partculas pasan a travs de un lser y por un fotodiodo de silicio se detecta la radiacin dispersada perpendicularmente al flujo. Su principal ventaja es que resulta ser ms sensible que el detector de ndice de refraccin. Detectores Electroqumicos: Actualmente hay varios tipos de detectores electroqumicos, que se basan en cuatro mtodos: amperometra, voltamperometra, coulombimetra, conductimetra. Detectores por espectrometra de masas: Consiste en el acoplamiento de la cromatografa de lquidos con la espectrometra de masas. De forma general se pueden obtener tanto cromatogramas a tiempo real como reconstruidos por ordenador hasta los espectros de los picos eluidos.

5. Cul es la ingestin diaria recomendada (IDR) de Ac, Ascrbico en su bebida comercial y qu contenido de cafena tiene reportado. Realice clculos para que al preparar su muestra, sta se interpole en la mitad de la curva de calibracin