余 　冰等 　与肝癌细胞系 Hep G2 特异性结合单链抗体的筛选与序列分析 　第 3 期 ・179 ・

・
肿瘤免疫学・

①
与肝癌细胞系 HepG2 特异性结合单链抗体的筛选与序列分析
②
余 　冰 　倪 　明 　雷 　萍 　李文涵 　朱慧芬 　张 　悦 　唐珍洁 　程 　欣 　沈关心
( 华中科技大学同济医学院免疫学系 ,武汉 430030)

　　中国图书分类号 　R733 　　文献标识码 　A 　　文章编号 　10002484 X( 2005) 0320179204

[ 摘 　要 ] 　目的 : 从人源噬菌体抗体库中筛选与肝癌细胞系 Hep G2 特异性结合的单链抗体 ,为寻找肝癌细胞表面特异性
标志及靶向研究奠定基础 。方法 : 以正常肝细胞系 L02 为阴性筛选细胞 ,以肝癌细胞系 Hep G2 为阳性筛选靶细胞 ,从人源噬菌
体抗体库 ( Griffin. 1 Library) 经三轮筛选后 ,阳性菌质粒 PCR 确定其中含有单链抗体基因的克隆 ,通过细胞 ELISA 及 FCM 筛选特
异性的单链抗体噬菌体 ,通过 ABI3730 全自动荧光测序仪测序 ,并通过 GeneBank 比对进行同源性分析 , IPTG 诱导可溶性单链
抗体表达 ,并检测其与肝癌细胞株结合的特异性 。结果 : 获得了 2 个特异性较高的阳性噬菌体单个克隆 。经 DNA 测序后 , 在
Genebank 中与人的免疫球蛋白库进行比对 ,并用 IMGTΠV2Quest 软件进行分析 ,确定为 2 个插入序列不同的单链抗体片段 。经
细胞 ELISA 证明其阳性克隆菌培养上清可与肝癌细胞株特异性结合 。获得的序列成功登陆 Genebank , 序列号为 AY6864982
AY686499 。结论 : 从人源噬菌体抗体库中筛选到与肝癌细胞系 Hep G2 特异性结合的具有功能活性的单链抗体 ,为进一步寻找
肝癌细胞表面特异性抗原及靶向研究奠定了基础 。
[ 关键词 ] 　人源噬菌体抗体库 ; 单链抗体 ; 阴性筛选 ; 阳性筛选 ; 生物淘洗

Identification and sequence analysis of scFvs binding specifically to HepG2

YU Bing , NI Ming , L EI Ping , LI Wen2Han , ZHU Hui2Fen , ZHANG Yue , TANG Zhen2Jie , CHENG Xin , SHEN
Guan2Xin . Department of Immunology , Tongji Hospital , Tongji Medical College , Huazhong University of Science and
Technology , Wuhan 430030 , China
[ Abstract ] 　Objective : To identify the specific antibodies binding to Hep G2 by biopanning from a large human naive scFv phage li2
brary. To find a potential direct and broadly applicable route to identify human antibodies suitable for antitumor therapy study.Methods :A large
human naive scFv phage library was used to search for specific targets by biopanning with hepatocellular carcinomas cell line , Hep G2 , and
counter2selecting with a liver cell line , L02. After three rounds of biopanning , single clones bound selectively to Hep G2 cells. PCR was carried
out for identification of the positive clones which combined with scFv gene sequence. High affinity and specificity positive clones were identified
by ELISA and FCM assay. DNA sequencing of positive clones were analyzed by using Applied Biosystem Automated DNA sequencers 3730 ,
and their homologous sequences were searched in GeneBank and analyzed by using IMGTΠV2Quest tools. The expression of positive scFv anti2
body fragments were induced by IPTG and their binding activity to Hep G2 were detected by ELISA. Results :Two different positive clones were
chosen and were regarded as target of Hep G2. The functional variable region sequences were identified by IMGTΠV2Quest tools. Conclusion :
The phage library biopanning combined with expression cloning permits identification of specific antibody ligand to Hep G2 and affords experi2
ment evidence to search for applicable route for antitumor therapy study.
[ Key words] 　Large human naive scFv phage library ;scFv ;Counter2selecting ;Positive2selecting ;Biopanning

　　噬菌体抗体库技术可不经免疫获得人源化抗 胞系 Hep G2 特异结合的单链抗体 ,为进一步寻找肝

体
[1 ]
。自 1993 年以来 ,相继有利用活细胞筛选的成 癌细胞表面特异性抗原奠定基础 。
[225 ]
功报道 , 获得的抗体可与天然状态的膜分子结
1 　材料与方法
合 ,具有极大的优越性 。本实验利用人正常肝细胞
111 　材料 　人源噬菌体抗体库 ( Griffin11 Library)
[6 ]
系 L02 和 肝 癌 细 胞 系 Hep G2 从 人 源 单 链 抗 体 库
由英国剑桥大学 Winter 教授惠赠 : 噬菌体抗体库滴
Griffths11 进行阴性和阳性筛选
[6 ]
, 拟获得与肝癌细
度为 1 ×10 pfuΠml , - 70 ℃保存 , 宿主菌 TG1 , 用于
12

噬菌体颗粒扩增 ; 大肠杆菌 HB2151 , 用于抗体可溶

①本课题受国家重点基础研究发展规化基金资助 (2002CB513109)
②华中科技大学同济医院感染科 ,武汉 430030
性表达 。辅助噬菌体 M13 K07 购自 Pharmacia 公司 ;
作者简介 : 余 　冰 (1971 年 - ) , 男 , 博士生 , 主要从事肝病及肿瘤免 鼠抗 M13 单克隆抗体购自 Amersham 公司 ; 羊抗鼠
疫学方面研究 ; IgG 购 自 Kirkegaard perry Laboratories ; 荧 光 标 记
通讯作者 : 沈关心 (1952 年 - ) ,男 , 教授 , 主要从事移植免疫 、
肿瘤免 ( FITC) 的羊抗鼠 IgG 抗体购自北京中山公司 ; 抗 C2
疫方面研究 ,E2mail :guanxin- shen608 @hotmail . com 。 myc 抗体购自 Santa Cruz Biotechnology 。
 ・180 ・ 中国免疫学杂志 2005 年第 21 卷

112 　方法 体 。将获得的 OD405 ～ OD630 平均值进行分析 , 对比

11211 　细胞株及细胞培养 　人肝癌细胞株 Hep G2
及正常肝细胞系 L02 加含 10 % FCS 的 RPMI1640 培
养液置于 37 ℃、
5 %的 CO2 、
饱和湿度的温箱中培养 。
11212 　辅助噬菌体的制备及抗体库的扩增 　方法
参照 Griffine. 1 噬菌体抗体库操作手册 , 包括 : 辅助
噬菌体 M13 K07 扩增并定量稀释到 1 ×10 pfuΠml ,
12
L02 和 Hep G2 细胞与单克隆噬菌体结合差异 , 取与
Hep G2 结合特异性高的克隆行 FCM 检测 。
11217 　单链抗体 DNA 序列测定及核苷酸序列分析
　将筛选出的单克隆菌交上海博亚生物公司采用通
用引物 LMB3 测序 , 所得序列在 GeneBank 中与人的
免疫球蛋白库进行比对 , 并用 IMGTΠV2Quest 软件进

分装后置 4 ℃保存 ; Griffin11 Library 抗体库的扩增和 行可变区序列分析 。

滴定 ,保存液滴度达到 1 ×10 pfuΠml 。 11218 　可溶性抗体片段的制备及细胞 ELISA 　将获
12

11213 　噬菌体抗体库的筛选 　取人源噬菌体抗体 得的阳性噬菌体按 1∶ 200 比例感染处于对数生长期

12
库 1 ml ( 1 ×10 pfu) , 先 后 用 含 10 % FCS 的 RPMI 的大肠杆菌 HB2151 ,铺 TYE 平板后挑取单克隆 。将
1640 和 215 mmolΠL EDTA 处理 , 以减少细胞表面的 处于对数生长期的单克隆菌用终浓度为 1 mmolΠL
6
非特异性结合 。经处理的噬菌体加入到一管 1 ×10 的 IPTG 诱 导 表 达 可 溶 性 抗 体 片 段 。结 合 细 胞
L02 细胞中 ,离心沉淀细胞 。取上清重悬另一管 1 × ELISA 检测同前 ,一抗采用抗 C2myc 抗体 , 二抗为荧
6
10 L02 细胞 , 离心 , 得到递减的噬菌体上清 。将此 光标记 ( FITC) 的羊抗鼠 IgG 抗体 。
6
上清与 5 ×10 的 Hep G2 细胞常温下混合 ,离心沉淀
2 　结果
细胞后用含 100 mmolΠL 柠檬酸 (pH 212) 的 PBS 洗提
与细 胞 结 合 的 噬 菌 体 , 110 molΠL 的 Tris2HCL ( pH 211 　噬菌体淘洗产率 　每轮淘洗均投入约 1 ×10
12

715) 中和 。用洗提的噬菌体感染处于对数生长期的 的噬菌体 ,洗脱的噬菌体产率显示第三轮与第二轮

大肠杆菌 TG1 并涂布于含 1 % ( WΠV) 葡萄糖和 100 的回收率相近 ,说明经过筛选后阳性克隆已得到富
μgΠml 氨苄西林的 2 ×TY 琼脂平板 。所得到的菌落 集 ,见表 1 。
被扩增并用于制备下一轮筛选用噬菌体 。共进行三 212 　多克隆噬菌体与细胞结合特性 　将每轮经筛
轮筛选 。 选扩增后的多克隆噬菌体进行细胞 ELISA 检测 , 结
11214 　多克隆噬菌体与细胞结合的 ELISA 及 FCM 果见图 1 ,流式检测结果见图 2 。两种检测结果均显
检测 　取经每轮筛选扩增后的多克隆噬菌体 ,6 % 示经筛选扩增后的多克隆噬菌体与 Hep G2 结合明
6
BSA 封闭 ,加入 1 ×10 Hep G2 细胞 ,4 ℃混匀 1 小时 , 显增高 ,表明经过筛选后阳性克隆已得到有效富集 。
离心 ,洗涤液 ( 含 4 %FBS 的 PBS) 重悬细胞 , 洗涤 3 213 　含噬菌粒载体的单克隆菌质粒与 PCR 扩增产
次 ,先后加入一抗 ( 鼠抗 M13 抗体 ) 、 二抗 ( 羊抗鼠 物鉴定结果 　第三轮筛选后的 31 个阳性菌 ,经质粒
IgG) 反应 。洗涤后加入 TMB 混合底物溶液 ,2 molΠL 提取后行 PCR 扩增 , 经凝胶电泳可见 12 个克隆片
硫酸终止反应 ,取经酶标仪检测 OD405 ～OD630 的平均 段为 1 kb 左右 ,符合抗体片段的理论值见图 3 。
值 ,阴性对照采用辅助噬菌体 M13 K07 , 空白对照为
未加噬菌体组 。FCM 检测步骤同细胞 ELISA , 二抗 表 1 　各轮筛选过程中噬菌体的回收率
Tab11 　The recovery rate of phage in every round biopanning
采用荧光标记 ( FITC) 的羊抗鼠 IgG 代替酶标抗体 。
Round Input phage (cfu) Eluted phage (cfu) Recall rate ( %)
11215 　质粒提取及 PCR 扩增 　将第三轮筛选后获 1 1 ×1012 119 ×106 119 ×10 - 6
得的含噬菌粒载体的单克隆菌接种平板培养过夜 , 2 1 ×10 12
112 ×10 7
112 ×10 - 5
挑取单克隆菌接种液体培养基 ,250 rΠmin 培养后提 3 1 ×10 12
115 ×10 7
115 ×10 - 5
Note :The recovery rate = eluted phage titerΠinput phage titer.
取质粒 , 采用通用引物 LMB3 : CAGGAAACACCTAT2
GAC 及 引 物 PHEN2SEQ : CTATGCGGCCCCATTCA 行
PCR 扩增 。PCR 反应条件 :95 ℃预变性 9 分钟 ,95 ℃
变性 45 秒 ,55 ℃退火 45 秒 ,72 ℃延伸 1 分钟 ,30 个
循环 ,72 ℃延伸 5 分钟 。扩增产物经 1 %琼脂糖凝胶
电泳分析 。
11216 　ELISA 及 FCM 　经 PCR 扩增后获得的含单
链抗体片段的单克隆菌 ,通过辅助噬菌体感染 、 扩增 图 1 　多克隆噬菌体细胞 EL ISA
制备单克隆噬菌体 , ELISA 操作方法同多克隆噬菌 Fig11 　The result of polyclonal scFv2phages EL ISA
 余 　冰等 　与肝癌细胞系 Hep G2 特异性结合单链抗体的筛选与序列分析 　第 3 期 ・181 ・

214 　单克隆噬菌体与细胞结合特性 　将获得的 12 215 　单链抗体 DNA 序列分析结果 　将筛选出的两

个阳性克隆提取单克隆噬菌体进行细胞 ELISA 检测 个单 克 隆 菌 交 上 海 博 亚 生 物 公 司 采 用 通 用 引 物
结果见图 4 , 结果显示 3 个克隆与 Hep G2 结合反应 LMB3 测序 ,所得序列在 GeneBank 中进行对比 ,结果
的 OD 值明显高于 L02 , FCM 检测结果见图 5 , 结果 表明两个单克隆分别都含有相应免疫球蛋白同源序
表明与 Hep G2 结合的阳性率明显高于 L02 细胞 ( 左 : 列 ,但二者序列不同 ; 用 IMGTΠV2Quest 软件分析单
L02 ,右 : Hep G2) 。 链抗体的互补决定区氨基酸序列 , 如下所示 。25 号
克隆序列通过 GeneBank 中进行对比时 , 其 VH 的
CDR3 区有较多缺失与突变 ,阅读框在轻链序列中提
前出现终止密码子 。其与细胞结合的阳性率亦显著
低于上述二株单克隆 。测序结果 ( VH + Link + VL )
如下 :

图 2 　多克隆噬菌体与 HepG2 细胞结合的流式细胞仪检测

结果
Fig12 　The result of polyclonal scFv2phages FCM
Note :From left to right . Purple2negative , green21st ,red22nd , blue23th round 216 　可溶性单链抗体与细胞结合的 ELISA 检测结
selection. 果 　经 IPTG 诱导表达可溶性单链抗体 ,用抗 myc 的
抗体检测证明可溶性抗体片段中含 myc 蛋白标签 ,
将获得的抗体分别与两种细胞结进行 ELISA 检测 ,
见图 6 。结果表明可溶性单链抗体及单克隆噬菌体
与细胞结合的结果一致 。

图 3 　质粒 PCR 电泳鉴定图

Fig13 　Electrophoresis of plasmid PCR products
Note :11Marker ;2281PCR products of the positive clones. 图 4 　单克隆噬菌体细胞 EL ISA
Fig14 　Monoclonal scFv phage EL ISA

图 5 　单克隆噬菌体 FCM 检测
Fig15 　Monoclonal scFv2phage FCM
 ・182 ・
图 6 　可溶性单链抗体与细胞结合 EL ISA 检测
Fig16 　The soluble scFv antibody fragments cells EL ISA
3 　讨论
随着肿瘤发生发展机制研究的深入 , 新的肿瘤
相关抗原相继被发现 , 针对这些位点的抗体治疗及
以抗体为导向的基因治疗均取得了极大的进展 , 基
因工程抗体的快速发展为其应用创造了条件 。抗肿
瘤基因工程抗体成功用于临床 , 掀起了新一轮以抗
体为导向的肿瘤治疗的热潮
[7 ,8 ]
。 获得的阳性克隆与 Hep G2 结合的特异性 。所筛选
20 世纪 90 年代初 , 人们将噬菌体展示技术应
用于抗体的表达和克隆 , 该技术在筛选上的巨大潜
[9 ]
力被人们极大的关注 , 而且抗体库技术的发展提
供了不经免疫制备抗体的可能 。Griffiths 等通过体
内组合感染法 ,构建了报道容量最大的未经免疫的
人源化抗体库 ,库容量达到 112 ×10 。从该库中
[10 ]
已有多种抗原经过筛选鉴定得到相应的具有生物活
[11 ]
性的单链抗体片段 。而单链抗体分子较小 , 免疫
原性低 ,组织穿透性好 , 易进行分子改造 , 制备简单
等优点使其在肿瘤诊疗中具有广泛应用前景 。
本实验通过肝脏正常细胞系 L02 和肝癌细胞系
Hep G2 对人源单链抗体库 Griffths. 1 进行三轮阴性
和阳 性 筛 选 后 , 多 克 隆 噬 菌 体 与 细 胞 结 合 率 的
ELISA 检测显示明显提高 , 流式细胞仪检测也得到
相同的结果 ,实验结果证实经筛选后阳性克隆得到
有效富集 。挑取 31 个单克隆菌提取质粒并进行
PCR 扩增 , 将扩增后符合单链抗体片段大小的单克
隆菌 制 备 单 克 隆 噬 菌 体 , 根 据 其 与 细 胞 结 合 的
ELISA 检测的差异性确定为阳性克隆 。实验过程
中 ,共获得含有单链抗体片段的阳性克隆 12 个 , 其
中 7 个克隆与两种细胞结合力无显著性差异 ,2 个
与正常细胞显示更强的结合力 ,3 个克隆与肿瘤细
胞结合为阳性 。进一步序列分析表明 3 株中 2 个克
隆含有完整的 scFv 基因片段 ,具有完整 scFv 基因片
段的 2 个克隆与 Hep G2 特异性结合的阳性率最高 。
所得序列在 GeneBank 中进行两两比对 ,确认是两个
插入序列完全不同的单链抗体片段 , 说明它们可能
结合的是细胞表面不同的膜分子 ; 在 GeneBank 中与
中国免疫学杂志 2005 年第 21 卷
人免疫球蛋白文库比对及用 IMGTΠV2Quest 软件分
析显示 ,两个克隆均具有完整开放阅读框 ,其载体中
信号肽序列 、 插入序列相应酶切位点及 Linker 序列
与载体图谱完全吻合 。scFv24 重链属 IGHV2 家族 ,
轻链为 Vκ2 家族 ,scFv210 重链属 IGHV1 家族 ,轻链为
Vλ3 家族。25 号克隆 VHCDR3 区缺失 (未显示) ,其与
细胞结合的阳性率亦显著低于上述二株单克隆。
利用该抗体库还有一个显著优点是在抗体基因
和外壳蛋白基因相接处设计一个琥珀密码子
( TAG) ,在含有琥珀抑制子的宿主菌 TG1 中 ,TAG 可
翻译为氨基酸而不起终止密码子的作用 , 抗体融合
基因表达为抗体2外壳蛋白融合分子 ,在无琥珀抑制
基因的宿主菌 HB2151 中 TAG 则成为终止密码子 ,
[13 ]
抗体表达为可溶性蛋白分子 。该特点在本实验
中也得到证实与应用 , 而且可溶性蛋白与细胞结合
的差异性与融合蛋白检测结果一致 , 再次证实了所
到的单链抗体为进一步靶向性功能研究和寻找肿瘤
细胞表面相关抗原奠定了基础 。
4 　参考文献
1 　Clackson T , Hoogenboom H R , Griffiths A D et al . Making antibody
fragments using phage display libraries [J ] . Nature ,1991 ;352 :6242628.
2 　Marks J D , Ouwe Hand W H , Bye J M et al . Human antibody fragments
9
specific for human blood group antigens from a phage display library [J ] .
BioΠTechnology ,1993 ;11 :114521149.
3 　Perira S , Maruyama H , Siegel D et al . A model system for detection and
isolation of a tumor cell surface antigen using antibody phage display [J ] .
J Immunol Methods ,1997 ;203 :11224.
[12 ] 4 　Figini M , Obici L , Mezzanzanica D et al . Panning phage antibody librar2
ies on cells :isolation of human Fab fragement against ovarian carcinoma
using guided selection [J ] . Cancer Res ,1998 ;58 :9912996.
5 　隋建华 ,何一心 . 抗 Kgla 细胞噬菌体展示 scFv 的筛选及鉴定 [J ] .
中华微生物学和免疫学杂志 ,2001 ;21 (6) :4372441.
6 　Griffiths A D , Williams S C , Hartley O et al . Isolation of high affinity
human antibodies directly from large synthetic repertoire [J ] . EMBO J ,
1994 ;13 :324523260.
7 　Rader C. Antibody libraries in drug and target discovery [J ] . Drug Discov
Today , 2001 ;6 :36243.
8 　Romanov V I. Phage display selection and evaluation of cancer drug tar2
gets [J ] . Curr Cancer Drug Targets ,2003 ;3 :1192129.
9 　Hoogenboom H R. Overview of antibody phage2display technology and its
applications [J ] . Methods Mol Biol ,2002 ;178 :1237.
10 　Waterhouse P , Griffiths A D , Johnson K S et al . Combinatorial infec2
tion and in vivo recombination : a strategy for making large phage anti2
body repertoires [J ] . Nucleic Acids Research ,1993 ;21 :226522266.
11 　Winter G, Griffths A D , Hawkins R E et al . Making antibodies by
phage display technology [J ] . Annu Rev Immunol ,1994 ;12 :4332455.
12 　苏 　娜 . 抗体库技术 [M] . 见 : 苏 　娜 ,沈关心主编 . 抗体工程 . 北
京 : 科学出版社 ,1996 :1582169.
13 　Hoogenboom H R , Bruine A P , Hufton S E et al . Antibody phage dis2
play technology and its applications [J ] . Immunotechnology ,1998 ;4 :12
20.
[ 收稿 2004208205 　修回 2004211226 ]
( 编辑 　徐 　杰)