Universidad Tecnolgica de Chile

Ingeniera en Biotecnologa j Laboratorio de Biotecnologa Vegetal

Cultivo in vitro para la obtencin de Callognesis a partir de explantes de lechuga.

Nombre de Alumno: Miguel Muoz F. Nombre Profesor: Hilda Moreno Fecha: 16 de Noviembre de 2011

Introduccin Todo material vegetal que se desee trabajar bajo el concepto in vitro del cultivo de tejidos vegetales, debe estar libre de microorganismos, ya que stos pueden impedir el desarrollo del explante o de procesos morfogenticos que se pretenden obtener, adems que de esta manera no se desperdiciar valioso tiempo de laboratorio y se evitar la repeticin de experimentos. (1) Entre los factores ms importantes a tener en cuenta para lograr la respuesta morfolgica deseada en un cultivo de tejido in vitro, es la composicin del medio de cultivo. El medio de cultivo est formado por macro y micronutrientes esenciales para la supervivencia de la planta, nutrientes (hidratos de carbono, vitaminas), agentes reguladores del crecimiento y hormonas vegetales, que ayudarn a obtener un callo, una planta completa o un rgano vegetal en particular, a partir del explante elegido (en condiciones de asepsia) y algn agente gelificante inerte (agar, gelrite, etc) (1). Para realizar este prctico y se ajust un protocolo para que sea efectivo en las condiciones del laboratorio, sin descuidar la calidad y el tiempo necesario para el desarrollo del prctico, evitando as la repeticin de experimentos. El medio utilizado fue lquido y los explantes obtenidos fueron observados en cultivo en suspensin, utilizando soluciones hormonales que promovieron la obtencin de Callognesis. Los resultados obtenidos indican que utilizando una solucin hormonal de ANA (0,5 mgL-1), en raz se puede obtener con xito la formacin de callos en distintas zonas de la raz.

Objetivos Ejecutar un protocolo asptico que permita establecer semillas de lechuga en condiciones in vitro para su establecimiento y/o germinacin. Obtencin de Callognesis a partir de explantes de lechuga. Familiarizarse con las tcnicas de cultivo de vegetales in vitro. Material Biolgico. Semillas de lechuga obtenidas de un supermercado. Material de laboratorio 1 vaso de precipitado de 250 mL, 1 vaso de precipitados de 50 mL, 1 piceta de 250 mL, Rollo de papel de aluminio, 2 placas de petri esterilizadas, papel filtro, pinzas, 1 cinta adhesiva, 3 tubos de ensayo, parafilm. Equipos Cmara de flujo laminar, cmara de cultivo, Autoclave. Reactivos y otros. Medio MS, agua destilada, etanol al 70%, hipoclorito de sodio (comercial), solucin hormonal cido naftalen-actico (ANA) 0,5mgL-1.

Preparacin del medio de cultivo: Segn el nmero de semillas a utilizar, preparar medio de cultivo MS. El pH deber ajustarse con NaOH 1.0 N antes de adicionar a los medios (Medio Knop a pH de 5.5 y Medio MS a pH 6). Preparar medio de cultivo en cantidad suficiente para hacer 2 variables (ver anexo). Desinfeccin de semillas: Luego de revisar diversos protocolos de desinfeccin, para semillas en general y semillas de lechuga se lleg a la conclusin de que los agentes desinfectantes, el tiempo utilizado y los pasos a seguir, para la mayora de los casos fueron los siguientes: Agente Desinfectante Tiempo total Extrn (o detergente comercial) al 2%* 30 40 minutos (una sola vez) Etanol al 70% 30 segundos (una sola vez) Hipoclorito de Sodio al 1% 10 minutos (una sola vez) Agua destilada 8 minutos (un minuto por enjuague) *Debido a que las semillas fueron compradas y no sacadas de la tierra, no fue necesario utilizar el extrn o detergente
comercial.

Pasos a seguir: 1) En la cmara de flujo laminar, utilizar pinza estril para poner las semillas en un vaso de precipitados de 50mL, en donde posteriormente se le aadirn los agentes desinfectantes. 2) En el vaso estril, sumergir las semillas en una solucin de etanol al 70% por 30 segundos (exactos). 3) Eliminar la solucin en otro vaso de precipitado de 250mL (vaso de desechos), vertiendo suavemente la solucin procurando que las semillas sigan en el vaso de 50mL, sostener las semillas con pinzas de ser necesario. 4) Enjuagar 3 veces con agua destilada para eliminar el etanol, en cada enjuague utilizar aproximadamente 30mL de agua destilada. 5) Eliminar el enjuagado en el vaso de desechos como en el paso 3. 6) Sumergir las semillas en una solucin de hipoclorito de sodio al 1% durante 10 minutos. 7) Lavar las semillas con agua destilada, cinco veces para eliminar restos del hipoclorito de sodio y eliminar el agua siguiendo el paso 3.

Cultivo de las semillas: 8) Poner un papel filtro dentro de la placa de petri, utilizar pinzas esterilizadas para hacerlo. 9) Del vaso de precipitado y con la ayuda de una pinza estril, tomar una a una las semillas y colocarlas en las placas de petri. 10) Colocar de 10 a 15 semillas en cada petri, procurando que queden separadas. 11) Aadir agua destilada a las semillas en las placas, procurando que no les falte agua y que no queden flotando, humedecer hasta que estn superficialmente hmedas. 12) Sellar correctamente la placa de petri, utilizando parafilm o cinta adhesiva. 13) Colocar las petri con las semillas en un cuarto de cultivo en la oscuridad a una temperatura de incubacin de entre 30 y 35C 14) Observar cada semana las semillas. Separar aquellas contaminadas y anotar si se trata de contaminacin bacteriana o fngica. Las placas de petri que estn contaminadas con semillas, debern esterilizarse a la brevedad. 15) A la aparicin del coleptilo, exponer los tubos al fotoperodo natural hasta que la plntula alcance una altura aproximada de 1-3 cm. Observaciones: 1) Las semillas incubadas en placas de petri fueron puestas en completa oscuridad aproximadamente 5 das, luego de eso fueron puesta a fotoperodo natural. 2) Verificar da a da que exista la cantidad suficiente de agua dentro de las petri, en caso de no ser as, proceder cuidadosamente a aadir agua, procurando no contaminar la placa, todo esto realizarlo en cmara de flujo laminar. 3) La temperatura en la cmara de cultivo estaba entre los 30 y 35C. 4) Las placas una vez sacadas de la oscuridad, estuvieron en un fotoperodo de 24 horas continuas de luz clara. 5) Los tubos en la cmara de cultivo eran dos, de tipo fluorescentes de 25W/TB, se encontraban aproximadamente a unos 20 cm de las placas. Extraccin y siembra de explantes: Por error, el medio utilizado para el cultivo en suspensin fue MS lquido y no slido como se haba pensado. Debido a esto, los explantes sern cultivados en suspensin para la posterior obtencin de callognesis. En la cmara de flujo laminar, se agreg 85 L de ANA de 0,5mgL-1, filtrada con jeringa y microfiltro, antes de agregar a los tres tubos de ensayo. Los tubos ya contenan un volumen de 10mL del medio MS. 1) Abrir la placa de petri que contiene las semillas germinadas, retirando lentamente la cinta adhesiva. 2) Extraer cuidadosamente con la ayuda de un bistur, 3 races, 3 tallos y tres hojas 3) Dejar los explantos en la tapa de la placa de petri para luego retirar con pinza.

4) Con la ayuda de una pinza estril, sacar los explantos de la tapa de la placa de petri y dejar los explantes en los tubos. Cada tubo con la misma concentracin hormonal, y con el mismo tipo de explante. 5) Sellar los tubos con parafilm o cinta adhesiva. 6) Dejar los tubos en la cmara de cultivo para la posterior obtencin de callognesis.

Figura 1: Tubos con explantes de tallos, hoja y raz respectivamente. Resultados y discusin: La desinfeccin de las semillas fue exitosa hasta la extraccin de explantes para la obtencin de callognesis, posteriormente a eso apareci contaminacin en slo una de las placas de petri. El largo tiempo de exposicin en la oscuridad de las placas petri, tuvo como consecuencia de que las semillas y plantas que crecieron en estas, tenan un menor tamao comparadas con las semillas que crecieron en fotoperodo de luz continua. An as las plantas al ser puestas en la luz, comenzaron a crecer y a colorarse con tonos verdes. Se logr obtener callos en el tubo que contena los explantes de raz, aprecindose un pardeamiento en dos de las 3 races observadas, como se puede observar en la figura 1.

Fig. 1) Posible formacin de callos en los explantes de raz observados con lupa, en la izquierda se puede observar el pardeamiento en 3 zonas de la raz, mientras que en la raz de la derecha slo se pudo observar en dos zonas.

Conclusin La desinfeccin de semillas siguiendo el protocolo establecido fue exitosa hasta la tercera semana, en donde comenz a aparecer contaminacin fngica, y el material utilizado para la posterior obtencin de callognesis no present contaminacin, lo que indica que la desinfeccin fue exitosa en al menos una de las placas. Los resultados obtenidos indican que utilizando una solucin hormonal de ANA (0,5 mgL-1), en raz se puede obtener con xito la formacin de callos en distintas zonas de la raz. Se debe cambiar la solucin hormonal para obtener callognesis en hoja y tallo, ya que en ninguno de los casos se pudo apreciar pardeamiento o formacin de callos.

Fuente: Instituto Politcnico Nacional, Unidad Profesional Interdisciplinaria de Biotecnologa, Laboratorio de Cultivo de Tejidos (2).

Anexo II.

Fuente: Instituto Politcnico Nacional, Unidad Profesional Interdisciplinaria de Biotecnologa, Laboratorio de Cultivo de Tejidos (2).

Bibliografa 1) Protocolo de desinfeccin y establecimiento in vitro de explantes y semillas de

mono y dicotiledneas. http://www.actiweb.es/modbioveg/archivo2.pdf 2) Instituto Politcnico Nacional, Unidad Profesional Interdisciplinaria Biotecnologa, Laboratorio de Cultivo de Tejidos.

de

http://www.biblioteca.upibi.ipn.mx/Archivos/Material%20Didactico/Manual%20del%20La boratorio%20de%20Cultivo%20de%20Tejidos%20.pdf