CURSO DE ENGENHARIA DE BIOPROCESSOS E BIOTECNOLOGIA UNIDADE BENTO GONALVES LABORATRIO DE BIOLOGIA MOLECULAR

CAMILA ECKERT GRAZIELA PILETTI JEAN BRESSAN ALBARELLO MARCEL RAMOS DA SILVA

RELATRIO EXPERIMENTO 01 - EXTRAO DE DNA DE MORANGO: ISOLANDO DNA NA COZINHA -

Novo Hamburgo 2011

1. Introduo O cido desoxirribonuclico, DNA, um composto orgnico cujas molculas contm as instrues genticas que coordenam o desenvolvimento e funcionamento de todos os seres vivos e alguns vrus. O seu principal papel armazenar as informaes necessrias para a construo das protenas. As molculas de DNA so geralmente formadas por duas cadeias polimricas em hlices unidas por pontes de hidrognio formadas entre uma base prica (Adenina ou Guanina) de uma das cadeias e uma base pirimdica (Timina ou Citosina) da outra. As tcnicas de manipulao do DNA tm influenciado direta ou indiretamente a sociedade, atravs da cura e diagnstico precoce de doenas, dos testes de paternidade, das aplicaes na medicina forense, na preservao de espcies ameaadas,na agricultura, etc. O procedimento de extrao de DNA j foi um processo bem complicado de ser feito em laboratrio. Hoje, muito fcil de fazer at mesmo em casa. possvel extrair o DNA de diversas fontes, entre elas, o morango. Uma das razes de se trabalhar com morangos que eles se prestam muito bem extrao de DNA, porque so muito macios e fceis de homogeneizar. Morangos maduros tambm produzem pectinases e celulases, que so enzimas que degradam a pectina e a celulose (respectivamente), presentes nas paredes celulares das clulas vegetais. Alm disso, os morangos possuem muito DNA: eles possuem 8 (oito) cpias de cada conjunto de cromossomos (so octoplides). O presente relatrio descreve o experimento realizado no laboratrio de Biologia Molecular da Universidade Estadual do Rio Grande do Sul, unidade de Novo Hamburgo, no dia 10 de novembro de 2011, que teve por objetivo, a extrao de DNA de origem vegetal de morangos (Fragaria sp) comerciais para fins totalmente acadmicos, introduzindo os alunos ao fascinante mundo das tcnicas laboratoriais da biologia molecular, sendo a extrao de DNA o primeiro passo para estudos de biologia molecular. Neste experimento foram utilizados produtos de uso domstico, tais como detergente, sal de cozinha e lcool etlico comercial. Para extrair DNA de morangos necessrio romper suas membranas e parede celular, para isto utilizado ao mecnica atravs de almofariz e pistilo e ao qumica com o uso de detergente. O detergente destri a membrana que

composta de gordura. Nesta etapa tambm utilizado gua quente para aumentar o grau de desordem na membrana e desnaturao das enzimas que enovelam o DNA. Em seguida deve o vegetal macerado e a soluo de quebra de membrana devem ir para banho de gelo. Este procedimento mantem as protenas desnaturadas, desfavorecendo a interao com as molculas de DNA. Para separar o DNA dos restos celulares, pode ser feito centrifugao ou filtrao. Para a precipitao dos cidos nuclicos adicionado lcool gelado logo aps a filtrao. Quanto mais gelado for o lcool, menos os cidos nuclicos iro se dissolver no lcool. O DNA pode ser isolado por centrifugao, ou pode ser capturado com o auxlio de uma pipeta ou basto de vidro.

2. Materiais e Mtodos

Para a extrao do DNA do morango, foram utilizados os seguintes materiais: gua quente (65C a 80C); lcool 96GL gelado Almofariz e pistilo; Basto de vidro; Caixa de isopor para o banho de gelo; Detergente lquido para lavar loua; Dois frascos de vidro (~200ml); Dois morangos; Funil ou suporte para papel-filtro; Gelo; Papel-filtro Proveta de 100mL; Sal de cozinha (NaCl).

Os dois morangos foram lavados e tiveram suas folhas retiradas, em seguida foram triturados no almofariz, utilizando um pistilo (FIG. 1).

Figura 1 - Macerao dos morangos

Na proveta foi feita uma soluo contendo 80mL de gua quente e 20mL de detergente (FIG. 2). Esta soluo foi transferida para um bquer contendo os morangos macerados.Adicionou-se uma colher de sopa de NaCl na soluo e misturou-se bem.

Figura 2 Soluo.

Aps aproximadamente 10 minutos, o frasco contendo a mistura com os morangos macerados foi colocado no banho de gelo, em uma caixa de isopor contendo gelo e gua (FIG. 3).

Figura 3 - Banho de gelo.

Quando a suspenso contendo os morangos triturados j estava fria, ela foi filtrada (FIG. 4) e coletou-se aproximadamente 50mL de precipitado em um bquer.

Figura 4 - Filtragem da mistura contendo morangos macerados.

O bquer contendo o precipitado foi inclinado em um ngulo de aproximadamente40 e derramou-se lcool gelado vagarosamente por suas paredes internas (FUG. 5).

Figura 5 - Adio de lcool gelado no lquido filtrado.

Quando o lcool foi adicionado ao lquido filtrado, formou-se um precipitado entre duas fases, este precipitado foi coletado enrolando em um basto de vidro (FIG. 6).

Figura 6 - Coleta do DNA com basto de vidro.

Este precipitado foi transferido para um tubo eppendorf e colocado em uma estufa com temperatura de 50-55C. Aps a secagem do DNA, adicionou-se 0,5mL de gua destilada no eppendorf. Depois de a cuba de eletroforese ser montada com a ajuda de um aluno, foicoletado 20 L de amostra do DNA de morango e adicionado 5 L de tampo de amostra 5X, totalizando ento, 25 L em um eppendorf. Quando todos os grupos terminaram de adicionar os tampes de amostra nas suas respectivas amostras de DNA extradas, as suas solues foram adicionadas nas canaletas dos gis de eletroforese, junto com as suas reaes de PCR, para posterior anlise.

3. Resultados e Discusses

Durante o banho de gelo, notou-se que o morango triturado no estava apresentando resultados observveis, pois a soluo continha muito material vegetal, para ser possvel prosseguir para a prxima fase do experimento. Para solucionar o problema, foi adicionado mais uma vez a soluo contendo gua quente, detergente e sal nas mesmas medidas anteriores. No decorrer da filtrao, escorreu um pouco da soluo sem passar pelo filtro, caindo direto no bquer contendo o filtrado. Durante a adio de lcool gelado no lquido recm-filtrado, observou-se a formao de pequenos fiapos localizados na interfase entre o lcool e a soluo. Estes fiapos, que posteriormente formaram grumos, eram o DNA do morango, nesta etapa do experimento contatou-se que a extrao do DNA foi realizada com sucesso.

4. Concluses O experimento mostrou-se vivel para extrao de DNA genmico de morango. O DNA pode ser extrado em quantidade satisfatria para posteriores anlises.

5. Referncias Bibliogrficas

cido desoxirribonuclico. Acesso em 15/11/2011. Disponvel em: http://pt.wikipedia.org/wiki/%C3%81cido_desoxirribonucleico

DNA de morango. Acesso em 15/11/2011. Disponvel em: http://www.invivo.fiocruz.br/cgi/cgilua.exe/sys/start.htm?sid=3&infoid=115

PEREIRA, B. B.; CAMPOS, E. O.; BONETTI, A. M. Extrao De DNA Por Meio De Uma Abordagem Experimental Investigativa. Uberlndia: Universidade Federal de Uberlndia, 2010.