Instituto Politcnico Nacional

Escuela Nacional de Ciencias Biolgicas

Departamento de Bioqumica Laboratorio de Mtodos de Anlisis
Determinacin de la actividad de enzimas proteolticas. Mtodo de Kunitz
Objetivos: Determinar la actividad enzimtica de la tripsina en base a una curva de actividad enzimtica. Conocer la relacin entre la actividad enzimtica de la tripsina y su actividad especfica para obtener las unidades especficas para tripsina Comparar unidades especficas de tripsina de cada proteasa.

Introduccin Las enzimas son catalizadores biolgicos con funciones selectivas y de gran eficiencia. Las enzimas tanto de organismos sencillos como complejos, catalizan reacciones de rutas metablicas vitales. Una de sus funciones principales es acelerar dichas reacciones, reduce en gran parte la energa necesaria para efectuar la reaccin. Las enzimas son muy especficas para cada sustrato sobre el cual actan y su grado de especificidad varia dependiendo de ello. Las enzimas proteolticas son responsables de la coagulacin de la sangre. Hay enzimas proteolticas en las clulas fagocticas de la sangre que se encargan de hidrolizar las protenas extraas. Las enzimas proteolticas pertenecen a uno de los ms importante grupos de enzimas en el proceso industrial de alimentos. Son usadas en la produccin de quesos, ablandamiento de carne y la modificacin de propiedades de las protenas de cereales en el pan y para la manufactura de cereales. La reaccin de catlisis mas comn realizada por estas enzimas es la hidrlisis de enlaces peptidicos de una protena.

La enzima proteoltica papana (EC 3.4.22.2) pertenece al grupo de las sulfhidril proteasas y fue encontrada por primera vez en la papaya.

Resultados:
1. Curva de actividad enzimtica
Tabla 1. Actividad enzimtica de la tripsina

Tubo T1 Y 1 T2 Y 2 T3 Y 3 T4 Y 4 T5 Y 5 TI Y I TII Y II TIII Y III

Concentracin de Tripsina (mg) 0.04 0.08 0.12 0.16 0.20 Bromelana 1:10 Bromelana 1:20 Papana

A280 Problema 0.211 0.346 0.464 0.535 0.593 Testigo 0.062 0.063 0.062 0.062 0.066 0.204 0.110 0.108

A280 corregida 0.149 0.283 0.402 0.473 0.527 0.501 0.326 0.238

PROBLEMAS 0.705 0.436 0.346

Ecuacin de la recta

Donde:

2. Calculo de Unidades Trpticas Las Unidad Trptica se define como la cantidad de enzima necesaria para aumentar una unidad de absorbancia a 280 nm por minuto de digestin, bajo las condiciones experimentales descritas.

3. Curva de actividad enzimtica especifica Si existen 0.11825 UT en 1 mg: Determinar UT en 0.04 mg

Tabla 2. Curva de actividad enzimtica especifica para la digestin de casena por tripsina

Tubo 1 2 3 4 5

Unidades Trpticas 0.0047 0.0095 0.0142 0.0189 0.0237

A280 corregida 0.149 0.283 0.402 0.473 0.527

Ecuacin de la recta

Ecuacin emprica

La absorbancia que presento 1 ml de la muestra Bromelana a una dilucin de 1:20 se encuentra en un intervalo casi lineal de la recta de la curva de actividad enzimtica, por lo que se determinara unidades trpticas de bromelana a esta concentracin. Para ello:

Despejando UT de la ecuacin emprica:

Unidades Trpticas de Bromelana A280 corregida de bromelana 1:20=0.326 Sustituyendo en UT

UT por gramo de pia:

Unidades Trpticas de Papana A280 corregida de papana=0.238 Sustituyendo en UT

UT por gramo de ablandador

Preguntas adicionales a) Defina actividad enzimtica y actividad enzimtica especifica Actividad enzimtica: Capacidad de la enzima para inducir una reaccin qumica determinada. A menudo esta reaccin se mide de forma indirecta Actividad enzimtica especfica: Es la relacin entre la actividad enzimtica y la cantidad de protena b) Escriba la clasificacin de las proteasa, en funcin de su mecanismo de accin y diga en que grupo se ubican las determinadas en la prctica. Existe una divisin de enzimas proteolticas en cuatro grupos con base en su mecanismo de accin: i) Serina proteasas: estas proteasas tienen en comn la caracterstica de ser inhibidas por el diisopropilfosforofluoridato (DFP) que reacciona con el grupo hidroxilo de un residuo serilo especfico en el sitio activo de la enzima. ii) Sulfhidrilo proteasas: este grupo tiene la habilidad de hidrolizar los enlaces peptidicos de protenas y la inhibicin por reactivos con grupo sulfhidrilo.

iii) Metal proteasas: Las enzimas pertenecientes a este grupo son inhibidas por un agente metal-quelante. iv) Acido proteasas: el nombre de este grupo indica que el pH ptimo de las enzimas es muy acido, en un rango de 2 a 4, y esto causa que los grupos no participen en el sitio activo. La tripsina pertenece al grupo de las serina proteasas; la papana y la bromelana se encuentran en el grupo de las sulfhidrilo proteasas c) Para que se adiciona cistena en las muestras de pia, y de ablandador? El mecanismo usado para romper un enlace pptidico implica utilizar un residuo del pptido que contenga Cistena y Treonina o una molcula de agua, de tal forma que sea posible atacar al grupo carbonilo del pptido. Una forma de hacer nuclefilos es mediante una triada cataltica, en donde un residuo de histidina es usado para activar la serina, cistena o treonina como nuclefilo. d) Cul es la especificidad de enlace de la tripsina, la bromelana y la papana? Tripsina La especificidad de sustrato de la tripsina es la Lisina y la Arginina Bromelana y Papana La especificidad de sustrato es Serina, Cistena y Treonina.

Discusin. El uso de los tubos testigos tiene como funcin principal evidenciar la presencia de sustancias extraas que absorban a 280 nm y que se encuentren presentes antes y despus de la hidrlisis de la casena. Estas sustancias afectan la lectura de absorbancia, debido a que despus de realizar la hidrlisis en los tubos problema, la solucin absorber como si esta tuviera una cantidad de protena mayor a la adicionada. Por lo tanto debe obtenerse una absorbancia corregida, siendo esta la diferencia entre la absorbancia del problema y la absorbancia del testigo, lo anterior con la finalidad de obtener resultados experimentales mas confiables. Con el fin de comparar la actividad enzimtica de cada proteasa, se obtiene unidades especficas de la tripsina (unidades trpticas). La actividad enzimtica especfica por miligramo de muestra de la tripsina es de 0.11825 UT, las actividades especficas de bromelana y papana por gramo de muestra es de 0.3073 UT y 0.1283 UT respectivamente. Cabe resaltar que se necesita menor cantidad de papana para hidrolizar la protena en

cuestin, en comparacin a la tripsina. Ambas tienen UT muy parecidas, sin embargo la cantidad de tripsina que se evala es para un miligramo de muestra, la cantidad de papana necesitada es por gramo de muestra. Por ltimo la cantidad de bromelana para realizar la reaccin es mayor a la cantidad necesitada de papana. La cantidad de tripsina es mayor a la cantidad de bromelana:

Esto explica la utilizacin de la papana en los ablandadores de carne. Conclusin. La actividad enzimtica de la tripsina es de 0.11825 UT por miligramo La actividad enzimtica de la bromelana es de 0.3073 UT por gramo La actividad enzimtica de la papana es de 0.1283 UT por gramo La cantidad de enzima mnima necesaria por minuto de digestin para aumentar una unidad de absorbancia corresponde a la papana.

Referencia bibliogrfica Berg, J. Stryer, L. 2008. Bioqumica. 6 Edicin. Editorial Reverte. Espaa. Pag. 67 Whitaker, J. 1972. Principles of Enzymology for the Food Sciences. Editorial Marcel Dekker, Inc. New York, U.S.A. pp. 511-512, 515-517, 526537 Horton, H. Moran, L. 2008. Principios de Bioqumica. 4 Edicin. Editorial Pearson Educacin de Mxico. Mxico. pp 129-130