UNIVERSIDAD AUTNOMA DE CIUDAD JUREZ INSTITUTO DE CIENCIAS BIOMDICAS DEPARTAMENTO DE CIENCIAS QUMICO-BIOLGICAS PROGRAMA DE BIOLOGA

MANUAL DE PRCTICAS GENTICA HUMANA

MANUAL DE PRCTICAS DE GENETICA HUMANA COMPILADORES: Principal: M. en C. Rocio Cortes Rodrguez Colaboradores: M. en C. Rocio Cortes Rodrguez Revisado por: Academia de Biologia 2011 Ciudad Jurez, Chihuahua Universidad Autnoma de Ciudad Jurez 2009 p. 68

M. en C. Emilio Clarke Crespo Coordinador de la Academia de Biologa

D. Ph. Antonio de la Mora Covarrubias Coordinador del Programa de Biologa

Dr. Alejandro Martnez Martnez Jefe del Departamento de Ciencias Qumico-Biolgicas

M.C. Hugo Staines Orozco Director del Instituto de Ciencias Biomdicas

Aprobados por la Academia de Biologa, 2011

CONTENIDO Practica 1: Extraccion de DNA..3 Practica 2: Corrimiento de Acidos Nucleicos..9 Practica 3: El cariotioi humano11 Practica 4: Simulacion de errores durante el proceso de replicacion...14 Practica 5: Digestion del DNA con endonucleasas de restriccion.19 Practica 6: Southern blotting23 Practica 7: Transformacion de celulas bacterianas.28 Practica 8: Fundamentos de la clonacion..32 Practica 9: Regulacion genica en procariotes...37 Practica 10: Factores involicrados en la regulacion de la transcripcion genica en eucariotas y sus funciones...43 Practica 11: Biologia genomica...48 Practica 12: Estudio genealogico en el genoma humano...50 Practica 13: Estudio de la herencia poligenica56 Practica 14: Estudio de los polimorfismos del grupo sangineo..63 Pracitca 15: Tecnica del aplastamiento para el estudio de los cromosomas..66
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Pracitca 1 EXTRACCION DE DNA Objetivo: Que el alumno aprender sobre la extraccin de DNA y la electroforesis. Introduccin Extraccin de DNA El concepto bsico de la extraccin de DNA se puede dividir en 5 pasos: 1) Ruptura de las clulas.- es casi virtualmente posible obtener DNA de todas las clulas que se conocen, nicamente tendr que adaptarse a las necesidades y facilidades para escoger los mtodos de lisis celular. Entre los mas utilizados estn: a) Los detergentes.- El uso de detergentes es til para extraer DNA especialmente de parsitos, clulas en cultivo y tejido. b) Enzimas.- cuando se trata de extraccin de DNA en bacterias, se utiliza la lisosima que es una enzima que se encuentra en varias secreciones del cuerpo humano como lagrimas y moco, y en la clara de huevo. Acta desestabilizando la pared celular bacteriana cuando rompe las uniones glucosidicas entre los polisacridos. 2) Eliminacin de protenas.- para eliminar las protenas se utilizan enzimas proteolticas, como la pronasa, la cual es activa contra un amplio espectro de protenas naturales. 3) Eliminacin de ARN.- Una vez concluida la digestin con las proteasas, se realiza la digestin con una RNasa para eliminar en su totalidad la presencia de ARN. La RNasa se utiliza a una concentracin de 100mg/ml. 4) Extraccin de protenas.-la eliminacin de las protenas de la muestra se termina utilizando solventes organicos como el fenol que es utilizado en la extraccin de las protenas debe ser biodestilado o ultrapuro. 5) Precipitacin del DNA.- para poder concentrar el DNA despus de la eliminacin de las protenas, se utilizan una serie de sales entre las que se encuentran el acetato de sodio, acetato de potasio, acetato de amonio y cloruro de litio. Una vez que el DNA ha estado en contacto con los cationes seleccionados se precipitan con volmenes de etanol absoluto.

Extraccin del DNA A partir de clulas sanguneas o de espermatozoides (Nature, Vol 318, 12 dic, 1985) 1.- Tomar 300 l de glbulos blancos principalmente. 2.- La solucin grinding contiene las siguientes soluciones stock:

Para

1 muestra Agua 290 l 0.5 M EDTA 100 l 0.1 M tris (pH 50 l 8.0) 10% SDS 50 l Proteinasa 10 l Total 500 l 3.- Homogenizar con un pistn de tefln

10 muestras 2.9 ml 1.0 ml 0.5 ml 0.5 ml 0.1 ml 5.0 ml

4.- Incubar el homogenizado a 55C toda la noche (o por 3 horas) 5.- Agregar 20 l de NaCl 5 M por cada tubo de muestra. 6.- Agregar un volumen igual de fenol equilibrado a la muestra. 7.- Dar vortex por 1 minuto. Microcentrifuga de 3 a 5 minutos a mxima velocidad. 8.- Tomar el sobrenadante (el cual contiene el DNA), y ponerlo en un tubo nuevo. Descartar el tubo con el pellet. 9.- Repite los pasos 6 y 8 de 2 a 3 veces, o hasta que el sobrenadante este claro y no turbio. 10.- Agregar un volumen igual de cloroformo a la muestra. 11.- Dar vortex por 1 min. Microcentrifuga de 3 a 5 minutos a mxima velocidad. 12.- Toma el sobrenadante (el cual contiene el DNA) y colcalo en un nuevo tubo. Repite los pasos 10 al 12. 13.- Agregar 2 volmenes de etanol 100% frio al sobrenadante y mantenerlo por 5 min a -20C (puede ser durante toda la noche).
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14.- Microcentrifuga por 5 minutos hasta hacer un pellet de DNA y cuidadosamente descarta el sobrenadante lentamente por la decantacin. 15.- Adicional 2 volmenes de etanol al 70% y dejar a temperatura de cuarto por 5 minutos. 16.- Centrifugar 5 minutos descartar sobrenadante dejando solamente el pellet, repetir los pasos 11 y 12. 17.- Secar el pellet a temperatura ambiente. 18.- Resuspender el pellet de DNA seco en 50 l de H2O uv para cuantificar en el espectrofotmetro. 19.- Colocar las muestras en refrigeracin a -20C para almacenar el DNA. Procedente de clulas epiteliales 1.- Raspar cuidadosamente dentro de la mejilla 4 veces con la punta de una pipeta P200 l; raspar con la punta con un ngulo hacia la mejilla de manera que las clulas sean colectadas alrededor y dentro de la punta. 2.- Pon la punta de la pipeta dentro del tubo para microcentrifuga que contenga 500 l de NaCl. Con un pipetor para la pipeta P200 suba y baje 3 a 5 veces para resuspender las clulas. 3.- Centrifugar el tubo a alta velocidad por 2 minutos. 4.- Remueve el sobrenadante con P1000 y pon el tubo conteniendo el pellet en hielo. 5.- Poner 200 l de chelex al 5% sobre pellet y resuspender. 6.- Poner el tubo en bao de arena a 100C por 8 minutos. 7.- Dar vortex por 10 a 15 segundos, despus pasarlo al hielo por 1 minuto. 8.- centrifuga a alta velocidad por 2 min. 9.- Remover el sobrenadante a otro tuvo y dejarlo en el hielo hasta que vaya a ser utilizado. 10.- Adicionar 2.5 l de solucin de clulas bucales a cada 50 ul de tubos de reaccin.

CUANTIFICACION DE DNA Cuantificacin en espectrofotmetro. El espectrofotmetro mide la cantidad de luz ultravioleta a 260nm absorbida por las bases. Usar una cubeta de cuarzo de 1 ml con el agua como blanco. Se ajusta a cero el espectrofotmetro con H2O. Despus de ajustar agregar 1l de DNA y 99 l de H2O. Absorbancia de 1 a 260 nm es igual a 50 g/ml de DNA de doble hebra. Nota: La contaminacin de soluciones de acidos nucleicos hace la cuantificacin espestrofotometrica inexacta. Calcular la proporcin de OD260/OD280 para indicacin de pureza del acido nucleico. El DNA puro tiene una proporcin de cerca de 1.8. una proporcin baja puede ser causada por la contaminacin de protenas o fenol. Double-Stranded DNA (dsDNA): A260 = OD 260= 1 for a 50 g/ml solution Single-stranded RNA (ssRNA): A260= OD260= 1 for a 40 g/ml solution Single-stranded DNA (ssDNA): A260= OD260= 1 for a 33 g/ml solution Absorbance= Molar Extinction coefficient X concentration X pathlength (usually cuvette width) GEL DE AGAROSA 1. Hacer 1.8 % agarosa en 1 X TBE: 0.9 g agarosa en 50ml 1 X TBE. 2. Hervir hasta que se aclare, usar microondas (1-2 min; examinar para asegurar que todo se solubilice) 3. Dejar enfriar hasta aprox 60C. 4. Agregar 12l de una solucin de 5 mg/ml bromuro de etidio; mezclar. 5. Sellar ambos lados del aparato con agarosa utilizando cinta masking tape. 6. Colocar los peines en la cmara 7. Poner agarosa en la cmara, dejar solidificar -30 min. 8. Llenar con 1 XTBE hasta que la solucin apenas alcance el borde del gel (sin cubrirlo). 9. Sacar los peines lentamente.
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10. Mezclar cada muestra de ADN (50l) con 10 X loading buffer (5l). cargar la poza lentamente con una pipeta de 200 l, utilizando los gel loading tips. (con un peine de 17 pozas se puede cargar hasta 25 l/poza). Cargar una poza con marcadores con 10l. 11. Correr a 100 V hasta que el colorante azul llegue al borde del gel. Agarosa: sirve como matriz para la separacin de fragmentos de DNA por su tamao. La agarosa de bajo punto de fusin sirve como matriz inerte, facilitando la recuperacin del DNA de la agarosa, evitando la perdida de la muestra.
Recommended Agarose Gel Percentages for Resolution of DNA

Gel percentage 0.5% 0.7% 1.0% 1.2% 1.5% 2.0%

DNA size range 1,000-30,000 bp 800-12,000 bp 500-10,000bp 400-7,000bp 200-3,000bp 50-2,000bp

Bromuro de etidio: colorante que fluoresce de una color rojo anaranjado (560nm) cuando se excita con luz ultravioleta (260 a 360 nm). Esto permite detectar 10ng de DNA. Tiene carga negativa y corre en direccin opuesta al DNA. El colorante se intercala entre los pares de bases que se encuentran en las molculas lineares y circulares del DNA, hacindolas mas rigidas. Inactivacin: 1. Diluir la solucin de EtBr a menos que 0.1mg/ml con agua. 2. Agregar un volumen igual al volumen de solucin de EtBr o del volumen de los geles de 0.1 M de KMnO4 y mezclar con cuidado para evitar cualquier salpicado. 3. Agregar un volumen de 0.5 M de HCl y mezcla cuidadosamente. 4. Dejar que reaccione de 2 a 4 horas (o toda la noche). Agregar un volumen de 0.5 M de NaOH y mezclar con cuidado. La solucin puede ser tirada en el lavabo.

Referencias: Zavala Castro Jorge Eduardo, Manual de Tcnicas Bsicas de Biologa Molecular, Mexico D.F., Pag 31-33 Berk, A., Harvey, L. 2005. Biologia celular y molecular

Practica 2 CORRIMIENTO DE CIDOS NUCLICOS. Objetivo. Que el alumno reconozca las caractersticas de los cidos nuclicos y el principio de la electroforesis. Introduccin. La electoforesis es una tcnica de separacin de molculas en una mezcla por aplicacin de un campo elctrico. Las molculas disueltas se desplazan o migran en un campo elctrico a una velocidad determinada por su relacin carga: masa. Por ejemplo, si dos molculas tienen ms masa y formas iguales, la de mayor carga neta se desplazara ms rpido hacia un electrodo. Los cidos nucleicos son separados mediante esta tenica utilizando una matriz o gel. El gel puede estar compuesto de agarosa o de poliacrilamida. El gel es sumergido en un buffer de electroforesis el cual provee iones que lleva una corriente. Los geles de agarosa tienen un rango grande de separacin, pero su resolucin es baja. En un gel agarosa se pueden separar fragmentos de DNA de entre 100 y 50,000 pares de bases. Por otra parte los geles hechos de poliacrilamida pueden separarse de fragmentos de DNA de menos de 500 pares de bases, y dependiente de la concentracin del gel pueden observar diferencias de tamao hasta 5 pares de bases. Materiales y Mtodos El Bromuro de etidio debe ser manejado siempre con guantes y bajo la supervisin del maestro. (Los geles con Bromuro de etidio deben ser desechados apropiadamente). Tubos eppendorf para microcentrifuga de 1.5 Puntas para micropipetas estriles. Marcador de peso molecular Guantes Material Biolgico (proporcionado por el maestro): DNA genmico de Drosophila melanogaster.

Equipo Camara de electroforesis Horno de microondas o mechero Transiluminador Metodologa 1. Preparacin de un gel agarosa al 1%. Pesar agarosa suficiente para 50 ml. De TAE 1X. fundir la agarosa hirviendo en un mechero o en un horno de microondas, estar pendientes de que no se derrame. Dejar enfriar en la mesa por 5 min. agitndola suavemente con movimientos circulares. Aadir Bromuro de etidio a una concentracin final de 30g por cada 100 ml. Vaciar la agarosa a una charola para electroforesis horizontal con un peine de al menos 10 pozos. 2. Una vez que gelifique el gel, se retira el peine y se coloca la charola en la cmara de electroforesis horizontal, se agrega TAE 1X hasta un cubre gel. 3. Preparar las muestras, aadiendo el buffer de cargado hacer los clculos necesarios para cargar las siguientes cantidades de DNA genmico por pozo: colocar 10,50, 100, 300, 500, 800 ng, 1 y 2 d de DNA genmico y en el ultimo pozo cargar un marcador de un peso molecular. 4. Correr el gel a 80 V constante del polo negativo al polo positivo, durante 2 horas. 5. Visualizar en un transiluminador. 6. Tomar una foto si es posible o bien dibujar y describir lo que se observo. Si el DNA genmico fue aislado correctamente debe aparecer como una banda de alto peso molecular y con un ligero barrido por debajo de ella. Si aparecen barridos ms extensos o de bajo peso molecular quiere decir que el DNA se degrado en algn paso del aislamiento, este DNA degradado es un DNA de mala calidad el cual no podr ser utilizado en experimentos subsecuentes en el laboratorio. Referencias. Berk, A., Harvey, L. 2005. Biologia celular y molecular Sambrook, J., Fritsch, E., Maniatis, T.1989. Molecular Cloning. Cold Spring Harbor Laboratory Press

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Practica 3 EL CARIOTIPO HUMANO Objetivo El objetivo de esta prctica es el estudio del cariotipo humano. Se pretende que el alumno aprenda a elaborar cariogramas y a distinguir el cariotipo normal de cariotipos que reflejan alteraciones cromosmicas, obtenidos de individuos que presenten diferentes sndromes. Introduccin El cariotipo es el complemento cromosmico particular de un individuo y viene definido por el nmero y morfologa de los cromosomas en la metafase mittica. En la especie humana la dotacin cromosmica es de 2n = 46 (22 pares de autosomas y un par de cromosomas sexuales). Utilizando tcnicas de tincin estndar los cromosomas aparecen uniformemente teidos en metafase y se clasifican en 7 grupos de la A a la G atendiendo a su longitud relativa y a la posicin del centrmero que define su morfologa. Los autosomas se numeran del 1 al 22 ordenados por tamaos decrecientes y por la posicin del centrmero. Los cromosomas sexuales X e Y constituyen un par aparte, independientemente del resto (por su tamao, el cromosoma X se incluira en el grupo C, y el Y, en el grupo G). De esta forma el cariotipo humano queda constituido as: Grupo A B C D E F G X, Y Pares cromosmicos 1, 2 y 3 4y5 6, 7, 8, 9, 10, 11 y 12 13, 14 y 15 16, 17 y 18 19 y 20 21 y 22 Caractersticas Cr. muy grandes casi metacntricos (1 y 3 metacntricos, pero 2 submetacntrico) Cr. grandes y submetacntricos, con dos brazos muy diferentes en tamao Cr. medianos submetacntricos Cr. medianos acrocntricos con satlites Cr. pequeos, metacntrico el 16 y submetacntricos 17, 18 Cr. pequeos y metacntricos Cr. pequeos y acrocntricos, con satlites. El cr. X es parecido al 6. El Y, al grupo G, pero sin satlites.

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(Todos los cromosomas autosmicos estn ordenados en orden decreciente de tamao, excepto el cromosoma 21 que ahora se sabe que es ms pequeo que el 22) Clasificacin de los cromosomas

A
1 2 3 4 5

C
6 7 8 9 10 11 12

D
13 14 15 16 17 18

E
Crs.

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20

21

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sexuales X Y

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Materiales: Computadora Acceso a internet Cariotipos de individuo sano y enfermo Metodologia: Seleccionar un cariotipo por medio de una imagen de la computadora en el que se muestran los cromosomas metafsicos teidos pertenecientes a diversos individuos. El alumno deber ordenar el cariograma y determinar si existen anomalas cromosmicas en cada individuo. Referencias: Berk, A., Harvey, L. 2005. Biologia celular y molecular Sambrook, J., Fritsch, E., Maniatis, T.1989. Molecular Cloning. Cold Spring Harbor Laboratory Press Cuestionario: 1.- Qu caractersticas permiten diferenciar, en general, unos cromosomas de otros? 2.- Qu clulas del organismo llevan el cariotipo diploide completo? 3.- Qu mecanismos cromosmicos producen anomalas del cariotipo humano? 4.- Se manifiestan siempre las alteraciones cromosmicas en el fenotipo del individuo que las transmite? Explica tu respuesta.

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Practica 4 SIMULACIN DE ERRORES DURANTE LA REPLICACIN. Objetivo Que el alumno entienda la Identificacin de los distintos errores que pueden ocurrir durante la replicacin del DNA. Introduccin La replicacin del DNA es un proceso complicado y altamente regulado que ocurre en diferentes etapas: 1.La iniciacin requiere el reconocimiento de un origen se producen varios sucesos. Antes de la comience la sntesis de ADN, las cadenas parentales han de ser separadas y estabilizadas en forma de cadena simple. Entonces puede inciarse la sntesis de las cadenas hijas en la horquilla de replicacin; E.coli ello se consigue por medio de un complejo proteico llamada primosoma. 2.La elongacin es obra de otro complejo de protenas. El replisoma no es una entidad independiente tan obvia como otras, ya que sus componentes solo se ensamblan al comienzo de la replicacin. A medida que replisoma se mueve a lo largo del ADN, las cadenas parentales se desenrollan y se sintetizan las cadenas hijas. 3. Terminacin al trmino de la replicacin, se requiere de reacciones de unin y de terminacin. Despus de la terminacin, los cromosomas duplicados se separan. La enzima que sintetiza una nueva hebra de DNA se denomina DNA polimerasa, existen3 tipos de DNA polimerasa: la I est involucrada en la reparacin del DNA daado y en un tipo de replicacin llamada semiconservativa; la II tambin est involucrada en reparacin y la III, una protena con mltiples sub-unidades, es la responsable de la sntesis de novo de hebras de DNA aadiendo nucleotidosa un extremo 3-OH. Durante la replicacin pueden existir errores, estimaciones matemticas indican que hay aproximadamente 1 error por 1000 ciclos de replicacin. Los errores que produce la DNA polimerasa durante la replicacin pueden dividirse en dos clases: sustituciones, que ocurre cuando el nucletido incorrecto es incorporado, debido a un deficiente eficiencia de la lectura de prueba y, cambios de marco de lectura que ocurre cuando un nucletido extra es insertado o cuando uno es omitido.
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Cuestionario (Ejercicios modificados de Averes, 1984) 1. Cul es la importancia de que se mantenga la fidelidad de la replicacin del DNA? __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ 2. Se ha demostrado que la secuencia de los aminocidos del segmento de una enzima es:-Met-Lys-Ser-Leu-Asp-Ala-Tyr-His- en una cepa silvestre. Despus de la induccin de una mutacion, se encuentra que el mismo segmento se ha modificado de la siguiente forma: -Met-Lys-Ser-His-HisLeu-Met-Leu-Thr-lle a) Si la secuencia original del DNA que codifica esta polipeptido es 5-TAC TTT TCA GCT AGT GAA CTA CGA ATG GTA G 3- Cul fue la naturaleza de la mutacion que condujo al cambio en la secuencia de aminocidos? __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ b) Qu cambio particular en el DNA mutante podra restaurar todos los codones originales excepto para el codn que especifica el aminocido numero nuatro (His)? __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________
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3. Un anlisis de una protena muestra que dos mutantes diferentes contienen una substitucin de aminocidos en el sitio normalmente ocupado por la leucina. El origen de estos mutantes es : LeuValMet-1 a) Asignar los codones respectivos de RNA a cada mutante y a la cepa silvestre __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ 4. Un anlisis de una protena muestra que dos mutantes diferentes contienen una subritutcion de aminocidos en el sitio normalmente ocuparo por la glicina. El origen de estos mutantes es: GlyArgMet-2 a) Asignar los codones respectivos de RNA a cada mutantes y a la cepa silvestre __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ 5. Un RNAm que codifica una pequea hormona peptidica de tan solo once aminocidos tiene la siguiente construccin: 5AUG UGU AAU UUG UGG CAU UGC UAU UUU UAG AAAAAAAA-3 a) Que aminocidos conforman esta protena? __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________
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b) Cules de los siete codones que especifican aminocidos podran ser cambiado a un codn de terminacin por una sola sustitucin de una base? De el codn de terminacin en cada paso que cite. __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ 6. Los plsmidos que portan los genes pen-r y test-r fueron expuestos a enzimas de restriccin que cortan la regin que porta prn-r pero dejan intacta a tet-r. El plsmido digerido se mezclo con fragmentos genmicos de restriccin de una biblioteca genmica clonada de ratn para producir DNA recombinante, el cual fue utilizado para transformar bacterias sensibles a drogas. Las bacterias transformadas fueron paqueadas (puestas a crecer en un medio de cultivo solido) en medio selectivo para identificar aquellas colonias de bacterias portando DNA recombinante, con los siguientes resultados.

Medionutritivo+tetraciclinaMedionutritivo+penicilina a) QucoloniasportanDNArecombinante?Explique. ________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________ b) Qucoloniaspodrancrecerenmedioquecontuvierapenicilinaytetraciclina?Explique. ________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________ 17

Referencias bibliogrficas Lewin, B., Aguilar, A., Genes Benjamin Lewin. Tercera edicin Avers, Ch. J. 1984. Genetica. Segunda edicin. Willard Gran Prees, Boston E.U. Sambrook, J., Fritsch, E., Maniatis, T. 1989 Molecular cloning. Cold Spring Harbor Laboratory Press.
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Practica 5 DIGESTION DEL ADN CON ENDONUCLEASAS DE RESTRICCION OBJETIVO Conocer, aprender y realizar la tcnica de digestin del ADN utilizando dos enzimas de restriccin. OBJETIVOS PARTICULARES 1. Digerir el ADN del bacterifago lambda con dos enzimas de restriccin diferentes. 2. Separar por electroforesis los fragmentos de restriccin 3. Visualizar los fragmentos de restriccin y analizar. INTRODUCCION Las endonucleasas de restriccin y mapas de restriccin Las endonucleasas de restriccin permiten la hidrlisis selectiva del DNA para obtener mapas de restriccin. La naturaleza posee un conjunto variado de herramientas, las endonucleasas de restriccin, capaces de diseccionar selectivamente molculas de DNA de muchos tamanos y orgenes en fragmentos mas pequenos. Estas enzimas protegen a las bacterias de los virus invasores, los bacterifagos. Las secuencias de DNA bacteriano, normalmente reconocidas por la endonucleasa de restriccin, estn protegudas contra el corte por la metilacin de las bases situadas dentro del palndromo, mientras que el DNA vrico metilado es reconocido como extrao y es hidrolizado. Se han identificado y purificado numerosas endonucleasas de restriccin de tipo II con diferente especificidad de secuencia; en la actualidad, muchas estn disponibles comercialmente. Las endonucleasas de restriccin permiten la construccin de nuevo tipo de mapa gentico, el mapra de restriccin, en el que se identifica el sitio de corte enzimtico dentro del DNA. Especies de DNA purificadas que contienen secuencias para una endonucleasa de restriccin son cortadas por esta. Variando el tiempo de digestin de las molculas de DNA purificadas por la endonucleasa de restriccin, se puede generar una poblacin de fragmentos de DNA de diferentes tamanos total o parcialemtne hidrolizados. La separacin de estos fragmentos generados enzimanticamente mediante electroforesis en gel de agarosa permite la obtencin de mapas de restriccin. El anlisis de un DNA completamente hidrolizado por una endonucleasa de restriccin establece el numero de sitios reconocidos por la
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endonucleasa dentro de la molecula, asi como el tamao de los fragmentos generados. METODOLOGIA (Adaptado de la traduccin de Villalobos-Arambula, Moreno-Salcedo). REACTIVOS ADN del bacterifago lambda Amortiguador de reaccin (2x) Enzima EcoRI Enzima hindIII H2O Digestin del ADN 1. Ubicar los microtubos proporcionados por el profesor que contienen las enzimas (Espara Stock de EcoRI y Hspara Stock de HindIII), en el ADN del fago lambda , el amortiguador de restriccin 2x Amy el amortiguador de carga C. Mantener las soluciones en hielo. 2. Rotular tres microtubos nuevos de la siguiente manera: Tubo uno L= ADN de (control sin digestin) Tubo dos E= Digestin con EcoRI Tubo tres H= Digestion con Hind III Agregar ademas una marca que distinga su grupo de los de sus companeros. 3. Dar un pulso de centrifuga y pipetear con extrema precisin (micropipeta de 0.5-10 l) los reactivos en los microtubos rotulados: Tubo L E H ADN 2l 4 l 4 l Amortiguador 2x 5 l 5 l 5 l EcoRI -1 l -Hind III --1 l H2 O MilliQ 3 l --Volumen Final 10 l 10 l 10 l MATERIALES Bao mara a 37C Micropipetas 0.5-10 l Equipo electrofortico Microcentrifuga Regla y papel semi-logaritmico

4. Tapar los tubos y mezclar los componentes suavemente al agitar los tubos con el dedo. Utilizar una microcentrifuga para recolectar los liquidos en el fondo (pulso de centrifugacin rpida). Verificar que el volumen total de cada tubo sea de 10 l. utilizar una punta diferente para cada muestra y colocar las tres gotas en puntos diferentes del microtubo.
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5. Colocar los tubos en la gradilla flotante e incubarlos durante 1 hora a 37C. 6. Mientras, preparar el gel de agarosa al 1.5% (ver practica uno). 7. Despus de la incubacin, retirar los tubos del bao mara, centrifugar rpidamente (pulso) con el propsito de recolectar el lquido en el fondo del tubo. 8. Anadir 2 l del amortiguador de carga azul (tubo C) en cada tubo. Tapar los tubos y mezclar suavemente, aguitando los tubos con el dedo. Dar un pulso de centrifugacin rpida. 9. Llenar la cmara de electroforesis hasta cubrir el gel de agarosa con el amortiguador TBE 1X. 10. Asegurarse de que los pozos de gel agarosa estn cerca del electrodo (-) de color negro y que la base del gel este cerca del electrodo (+) color rojo. 11. Cargar la muestra dentro de los pozos del gel, utilizando una punta diferente para cada muestra, siguiendo el orden indicado, de izquierda a derecha: LINEA 1: tubo L (control sin digestin) LINEA 2: tubo E, digestin con EcoRI. LINEA 3: tubo H, digestin con Hind III LINEA 4: marcador de ADN (lambda-Hindi III, proporcionado por el profesor)

12. Colocar la tapa de la cmara de electroforesis. Los cables rojo y negro de la tapa concordaran con los cables rojos y negro de la base. Conectar los electrodos con la fuente de poder. 13. Encender la fuente de poder y someter las muestras a 80V por 120 minutos. 14. Apagar la fuente de poder una vez terminado el proceso de electroforesis y retirar cuidadosamente el gel y la bandeja de la caja. Remover el gel de la bandeja tener cuidado ya que el gel es muy resbaloso!, colocar el gel en la bandeja de tincin. 15. *Aadir 60 ml de colorante ADN bio-seguro en la charola de tincin. Cubrir la bandeja con papel aluminio. Dejar el gel tiendo toda la noche. 16. * Colocar el sobrenadante de la solucin bio-segura, una botella, ya que se puede volver a utilizar. Agregar 60 ml de agua destilada al gel. Dejar que se destina de 10 a 15 minutos, y vacias posteriormente el agua utilizada en un contenerdor de desechos.
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17. * Para obtener un registro permanente, ponerlo sobre el acetato. (*) Alternativamente el profesor realizara la tincin con bromuro de etidio (ver practica uno) y entregara al alumno la fotografa instantnea o digitalizada del resultado de la electroforesis. BIBLIOGRAFIA Devlin T.; Bioquimica: libro de texto con aplicaciones clnicas, 2006, 4ta edicin, editorital Reverte, S.A., Barcelona, Espaa. Sambrook J.; Fristsch E.F.; Maniatis, 1989, molecular cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, segunda edicion.

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Practica 6 SOUTHERN BLOTTING OBJETIVO Que el alumno conozca la de transferencia tipo Southern. INTRODUCCION Existen diferentes tcnicas que emplean la separacin en gel por electroforesis como primer paso para identificar la presencia de determinadas molculas dentro de una muestra. Una de ellas fue inventada por Edward M. Southern en 1975 para la deteccin de ADN. Una vez finalizada la corrida en el gel, se realiza la transferencia (o blotting) de las muestras a una membrana para su posterior revelado. Esta tcnica consisten en una electroforesis seguida de transferencia y emplean secuencias especficas (sondas) complementarias a la molcula de cido nucleico a identificar. Es decir, ambas utilizan la hibridacin de cidos nucleicos para la deteccin de las molculas buscadas. Los principios generales son los mismos, pero hay diferencias en el procedimiento debidas principalmente a que el ARN se degrada mucho ms fcilmente que el ADN; esto hace necesario tomar muchas ms precauciones. Una vez sembradas las muestras en un gel, se realiza una corrida electrofortica hasta lograr que las molculas se separen por tamaos de manera tal que se puedan distinguir las buscadas. Luego se transfieren los cidos nucleicos del gel a la membrana. De esta manera los que quedan retenidos pueden ser sometidos a ensayos de hibridacin con sondas especficas para detectar la presencia dedeterminadas secuencias. El Southern Blot, que detecta la presencia de ciertas secuencias en el ADN, se usa, por ejemplo, para estudiar mutaciones en el genoma. La tcnica consiste en cortar el DNA con enzimas de restriccin para producir fragmentos de diferente tamao. Los fragmentos se separan por su tamao molecular mediante electroforesis en gel de agarosa y tincin con bromuro de etidio (Rybicki y Purves, 1996). Los fragmentos son luego transferidos a una membrana que acta como filtro. Para ello el gel se sumerge en una solucin salina para denaturarlo a hebras sencillas. Las hebras se adhieren al papel secante que las recibe y acepta debido a sus propiedades qumicas. Despus los fragmentos se fijan (por UV) al filtro membranoso y pueden ser hibridados con una sonda que se marque radioactivamente y que tenga una secuencia complementaria a la del fragmento en cuestin. Despus de la hibridacin, se lava el filtro y los fragmentos se detectan por radioautografa o mediante fluorescencia (en caso de marcaje no-radioctivo).
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El Southern Blot es una tcnica que permite la identificacin de secuencias especficas de DNA, mediante el uso de electroforesis en gel y de hibridacin utilizando sondas especificas. Para analizar una muestra de DNA cromosomal sta debe ser previamente fragmentada, por ejemplo utilizando sonicacin enzimas de restriccin. Los fragmentos obtenidos se separan, de mayor a menor tamao mediante una electroforesis en gel de agarosa. Una vez terminada la electroforesis y sin teir el gel, los fragmentos de DNA se traspasan a un filtro de nitrocelulosa a una membrana de nylon. A continuacin, el filtro se incuba con una sonda marcada, especfica para la secuencia que se desea identificar. Esta sonda es una secuencia de cido nucleico, DNAds RNAm, que reconocer a la secuencia de DNA inmovilizada en el filtro, a travs del reconocimiento de secuencias complementarias de cidos nucleicos. El traspaso de las muestras desde el gel al filtro es una etapa esencial, porque el reconocimiento de bases complementarias entre sonda y secuencias de DNA en el gel es muy ineficiente.Cabe sealar que el nombre de la tcnica Southern Blot deriva en parte del apellido Southern del investigador que la desarroll y de la palabra en ingls Blot que significa traspasar.

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METODOLOGIA Reactivos Gel agarosa ADN genomico ADN digerido Amortiguador TBE 1X Materia, equipo y accesorios Microcentrifuga Equipo electrpfpretico Micropipetas y puntas Termociclador Equipo electroforetico Papel filtro grueso y delgado (Whatman) Seleccin del papel filtro largo Charola de vidrio y puente plastico Peso (1 kg) Agitador rotatorio

Amortiguador de desnaturalizacion Amortiguador de neutralizacion Amortiguador SSC* (20 X) Amortiguador SSC* (6 X) Amortiguador SSC* (2X) Membrana de nitrocelulosa o nylon (recordata al tamao del gel) Papel plastico Electroforesis de las muestras ADN a transferir:

1. Cargar (por duplicado: en geles idnticos) las muestras de ADN (ADN del bacterifago lambda con o sin digestin que proporcionara el profesor 2. Llevar a cavo la electroforesis, 2 horas, 80 volts. 3. Teir un solo gel (con bromuro de etidio o colorante Biosafe), tomar fotografa y guardar gel a 4C, en oscuridad. Transferencia del ADN a membrana de nylon: se trabaja nicamente con el gel NO teido: 1. Sumergir el gel en 500 ml de solucin de desnaturalizacin ** por 45 minuto con agitacin leve sobre agitador rotacional 2. Enjuagar el gel en agua bidestilada 5 minutos Cuidado el gel es muy resbaloso! 3. Neutralizar en 500 ml de solucin de neutralizacin** 15 minutos, dos veces. 4. Cortar una pequea seccin de la esquina derecha superior del gel para su futura orientacin. Formacin de la pirmide de transferencia por capilaridad: 1. Usar guantes para cortar la membrana de transferencia (proporcionada entre dos hojas de papel protector), 2 hojas de papel filtro grueso y una altura de 10 cm de papel filtro delgado al mismo tamao que el gel. Cortar
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la esquina derecha superior de la membrana de la misma manera que lo hizo para el gel. 2. Para formar la pirmide colocar en orden a) La charola de vidrio b) Transversalmente, el puente (tabla de vidrio o plstico) c) El papel filtro largo que cubra la tabla y toque al interior de la charola. d) El gel (con los puntos de carga hacia abajo) e) La membrana humedecida en agua bidestilada colocada exactamente encima del gel (con las esquinas recortadas en misma ubicacin). Una vez ubicada no moverla. f) El plstico hermtico alrededor del gel y membrana para evitar el contacto directo entre el puente y las siguientes capas. g) 2 hojas de papel whatman grueso, humedecidas en SSC 2x. h) 10 cm de papel Whatman delgado y seco. i) Suficiente solucin SSC 20x para que humedezca el papel filtro grande. j) Pelcula de plstico alimenticio que cubra toda la charola (evita evaporacin y polvo). k) Por ltimo un peso (1kg aprox) 3. Dejar el proceso de transferencia de 8 a 24 horas. 4. Al dia siguiente, eliminar la pirmide en orden inverso al del montaje. Anotar el aspecto (color) de cada capa. Antes de quitar la membrana, marca con lpiz la ubicacin de los pozos de carga del gel. Separar con cuidado (y guantes) la membrana del gel. 5. Enjuagar brevemente (5min) la membrana con SSC 6x, escurrir la membrana hasta secar por 30 minutos. 6. Fijar el ADN de cadena sencilla covalentemente a la membrana: a) Horneado (cuidado de no quemarse) de 30 a 120 minutos (>80C). b) O irradiando con la luz UV 5 minutos (sobre la superficie limpia del transiluminador, ubicando la membrana con marca de lpiz por arriba) CUIDADO CON LOS OJOS Y LA PIEL, TOME PRECAUCIONES ADECUADAS! 7. Las membrana se puede conservar por varias semanas a -20C hasta su hibridacin posterior con sonda marcada (esta parte sin embargo no se efectuara)

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Verificacin del xito de la transferencia: 1.- Para cerciorarse del xito de la transferencia del ADN a la membrana se suele teir el gel despus de la transferencia y comprarlo con el gel que se tio pero no se transfiri. BIBLIOGRAFIA Lunque J.; Herraez A.; Biologia Molecular e ingeniera gentica, 2001, primera edicin, editorial harcourt, Madrid, Espaa. Sambrook J.; Fristsch E.F., Maniatis, 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, segunda edicion.

SOLUCIONES PROPORCIONADAS PARA LA PRACTICA: Solucion SSC 20x: Disolver 175.3 g de NaCl y 88.2 g de citrato de sodio en 800 ml de agua bidestilada. Ajustar a pH 7 con NaOH, ajustar el volumen a 1 litro, esteriliza en autoclave. Solucin SSC 6x: al momento de su uso, diluir 3.3 veces el amortiguador SSC 20x. Solucin SSC 2x: al momento de su unos, diluir 10 veces el amortiguador SSC 20x. Solucin amortiguadora de desnaturalizacin NaOH---------- 0.5 M NaCl------------ 1.5 M Solucion de neutralizacin Tris pH 7.4---------- 1M NaCl------------------ 1.5 M

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Practica 7 TRANSFORMACIN DE CLULAS BACTERIANAS. Objetivo Que el alumno aprenda una de las tcnicas ms utilizadas en la biologa molecular para le analisis genetico. Introduccin Esta tcnica es bsica en un laboratorio de biologa molecular. La finalidad de esta tcnica es introducir un plsmido a una bacteria, y utilizar esta para amplificar el plsmido y as obtener grandes cantidades del mismo. Los plsmidos son molculas circulares de ADN de doble cadena que se encuentran naturalmente en varias especies de bacterias. Estos elementos genticos son extracromosomales, se replican de manera independiente del cromosoma bacteriano y codifican para una gran variedad de enzimas que confieren resistencias a antibiticos y metales pesados, degradan complejos orgnicos o producen toxinas, etc. Dadas estas caractersticas, los plsmidos han sido empleados como vectores o vehculos de clonacin de molculas de ADN forneas que permiten el transporte y manipulacin del mismo. Es as como, hoy en da, se dispone de una gran variedad de plsmidos sintticos de naturaleza modular con caractersticas diversas para lograr ya sea la clonacin de un fragmento de ADN genmico, de cADN o de PCR, o para la expresin de los mismos y obtencin del respectivo producto proteico. Entre las prioridades de los plsmidos que favorecen su utilizacin como vector de clonacin se incluyen: (1) su pequeo tamao que hace que el ADN sea fcil de aislar y de manipular; (2) su naturaleza circular que hace que el ADN se mas estable durante la extraccin; (3) su origen de replicacin independientemente del control directo de la replicacin del cromosoma bacteriano; (4) su mltiple numero de copias, de manera que se aumenta la eficiencia de la extraccin del ADN plasmidico; y (5) la presencia de marcadores seleccionables, tales como genes de resistencia a antibiticos, haciendo as mas fcil la deteccin y la seleccin de las bacterias que contienen plsmidos. La estructura modular de todo plsmidos comprende bsicamente: (1) un origen de replicacin autnomo que permita un alto nmero de copias por bacterias (replicacin autnomo que permita un alto nmero de copias por bacteria (replicacin relajada), (2) genes de resistencia a antibiticos, (3) marcadores de seleccin, y (4) un sitio mltiple de clonacin, caracterizado por la presencia de
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sitios nicos para enzimas de restriccin, no encatrados en ninguna regin del plsmido. Materiales y Mtodos El maestro elaborara con anterioridad los siguientes reactivos: Medio de cultivo LB Cajas de agar-LB con ampicilina X-gal 20 mg/ml (no filtrar) IPTG 100mM (estril a travs de filtracin por un filtro de 0.22 mM) Cloruro de Calcio 100 Mm estril Materiales Puntas para micropipetas estriles Esptulas para sembrar bacterias Mechero Marcador indeleble punta negra Tubos 10 ml estriles Tubos para microcentrfuga de 1.5 ml. Matraz de 100 ml. estril Material biolgico Cepas DH5 Equipo Incubadora a 37C Bao Mara 42C Microcentrfuga Metodologa 1. Poner, de una caja fresca de clulas de la cepa DH5, un cultivo de 5 ml estril, dejarlo toda la noche a 37 C con agitacin. 2. Agregar al da siguiente 100 ml de medio luria, 3ml del cultivo de clulas de la cepa DH5, incubar con agitacin a 37C hasta que alcance una densidad ptica entre 0.4 a 0.6 (O.D. 600). 3. Centrifugar las clulas a 3000 rpm por 10 min. Se desecha el medio sobrenadante y las clulas se resuspenden delicadamente en 20 ml. De una solucin 100 mM de CaCl fra. (Es muy importante que la solucin este muy fra por que la pared de las clulas es muy delicada en este momento y la temperatura ayuda a mantener la viabilidad de las clulas).
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4. Centrifugar de nuevo a 3000 rpm por 10 min. Resuspender en 1 ml de la solucin de CaCl fra. Dividir el volumen en 10 tubos para microcentrfuga de 1.5 ml estril y conservar en hielo. 5. Marcar cinco tubos como contro a, 1 ng a, 10 ng a, 100 ng, 300 ng a. Los cincos restantes marcarlos igual pero con al letra b. 6. A los tubos con la letra a aadir la cantidad indicada del plsmido pBluescript y a los tubos marcados con la letra b aadir la cantidad indica del plsmido pBluescript-ATRAX, el cual lleva clonado del DNA de un gen. A los tubos control no se les aadir nada. Esto se hace para comprobar que las bateras componentes recin preparados no estn contaminados con otro plsmido. 7. Incubar el DNA con las bacterias durante 1 hora en el hielo. Durante este tiempo de incubacin se preparan 10 tubos de 5 ml con 1 ml de medio luria lquido, y se marcan como los tubos del inciso 5. 8. Terminado el tiempo de incubacin rpidamente se pasan los tubos a un bao de 42C (choque trmico) durante 1 min. al trmino de este minuto se vuelven a pasar los tubos al hielo durante otro minuto, se les agrega 1 ml de medio a cada tubo y se transfiere el medio a los tubos de 5 ml que se prepararon. 9. Se incuban los tubos en agitacin a 37C durante una hora para permitir que las bacterias se recuperen. Durante este tiempo de incubacin a las cajas con medio solido agar-luria, se les agrega 25 de X-Gal y se extiende con una esptula en un ambiente estril (mechero). 10. Una vez transcurrido el tiempo de incubacin se centrifugan los tubos a 3000 rpm durante 10 min., se decanta el medio y con el medio restante se toma la totalidad de las bacterias y se siembran en las cajas en ambiente estril y se esptulan para extenderlas. Las cajas se dejan incubar en una estufa a 37C. 11. Al da siguiente se cuenta el nmero de colonias, y se calcula la competencia de las clulas dividiendo el nmero de colonias obtenidas en cada caja por la cantidad de DNA (en microgramos) que se agrego. Unas clulas muy bien preparadas deben de dar una competencia entre 10 y 10. Unas clulas muy componentes pueden estar en el orden de hasta 10.

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Referencias bibliogrficas Consepcion, J., Puerta, B., Cludia, P., Urea, P., Practicas de biologa molecular. Pontifica Universidad Javeriana. Bolivar, f et al., 1977. Construction and characterization of new cloning vehicles. I. Ampicillin-resistant derivatives of plasmid pMB9. Gene 2,75. Sambrook, J., Fritsch, E., Maniatis, T. Harbor Laboratory Press.

1989 Molecular cloning. Cold Dpring

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Practica 8 FUNDAMENTOS DE LA CLONACIN. Objetivo El alumno aprender la utilidad de la clonacin para investigacin actual. Introduccin El desarrollo de mtodos para la introduccin de DNA en clulas de mamferos, ha hecho posible expresar genes clonados en una gran variedad de tipos de clulas de diferentes estructurales, y para identificar elementos involucrados en el control de la expresin gentica. En este tipo de estudios se inserta la secuencia de inters en un vector de expresin apropiado, se clona en una bacteria, se amplifica por replicacin y posteriormente se utiliza para transfectar clulas de mamfero, de insecto o bien para hacer organismos transgnicos. Estas construcciones tambin pueden utilizarse para sobre-expresar protenas o fragmentos de protenas las cuales son posteriormente purificadas para hacer anticuerpos especficos contras esas protenas. La clonacin tiene por lo tanto mltiples aplicaciones y ltimamente con ayuda de la ingeniera gentica se han podido introducir mutaciones en genes que codifican para protenas de inters, para producir protenas mutantes en grandes cantidades en bacterias o en clulas de insecto o mamferos. El introducir este mutacin en el gen, en sitios especficos, ha llevado muchas veces a encontrar funciones para protenas desconocidas, o a estudiar en clulas de mamfero cmo se comportan estas protenas mutadas y analizar a nivel celular su contribucin a una enfermedad determinada. Las principales herramientas que un bilogo molecular tiene para poder manipular el DNA son enzimas de restriccin y otras enzimas modificadoras del DNA. Las enzimas de restriccin se unen especficamente y cortan el DNA de doble cadena en sitios especficos en secuencias llamadas sitios clasificadas en 3 grupos: el grupo I y III cortan el DNA en su secuencia blanco y despus se disocia del sustrato. El grupo II consiste de un sistema binario, el cual lleva una endonucleasa que corta una secuencia especfica de nucletidos y una metiltransferasa por separado que modifica la misma secuencia blanco. Este tipo de enzimas son las que han sido ampliamente utilizadas en biologa molecular. La mayora de las enzimas reconocen 4,5 o 6 nucletidos especficos los cuales generalmente son palindromes. Existen tambin enzimas que reconocen 6 nucletidos especficos los cuales generalmente son palindromes. Existen tambin enzimas que reconocen 6 nucleotidos o mas, pero las secuencias no son exactos o estn degeneradas. Hay enzimas que cortan justo en el eje de simetra creando fragmentos de DNA cohesivos.
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El DNA restringido con una cierta enzima posteriormente puede ser ligado a un vector que haya sido cortado con la misma enzima ya que tendrn extremos complementarios. Muchas veces al diferir con dos enzimas diferentes. Ya ligar estos fragmentos a veces se puede formar un nuevo sitio de reconocimiento para una tercera enzima de restriccin. El conocer toras estas combinaciones, ha hecho que los bilogos moleculares cuenten con muchas herramientas para poder manipulas los genes o el gen que codifican para una protena particular a su conveniencia. Cuestionario 1. Cules son las propiedades de las endonucleasas del grupo II que las hacen tiles para la clonacin? __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ _____________________________________________________ 2. A continuacin se muestra el mapa de restriccin del plsmido YIP5 de 5,541

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Figura: Mapa de restriccin del plsmido YIP5 de 5,541 pb. Los nmeros indicados despus de cada enzima de restriccin indican las posiciones de los sitios de corte.

Indicar los tamaos de los fragmentos que se obtendran tras la digestin de los plsmidos YIP5 con las siguientes enzimas de restriccin: Enzimas EcoRI EcoRI y Eagl, Hindilll y Apal Hindilll y Smal Pvull y Eagl Apal y Pvull 3. Un fragmento de DNA de ratn con extremos cohesivos EcoRI contiene el gen CyP1A1. Este fragmento de DNA, de 2 kb de largo, se inserta en el sitio EcoRI del plsmido bacteriano Pbr322. El plsmido recombinante se corta con tres enzimas de restriccin distintas. La distribucin de bandas tras la electroforesis en gel de agarosa, visualizadas con bromuro de etidio, se muestra en la figura siguiente: (i) EcoRI (ii) BamHI (iii) BamHI + EcoRI Tamao del fragmento obtenido

Se transfiere el ADN del gel (iii) mediante la tcnica de Soutjern blot. Qu fragmentos hibridaran con una sonda de DNA del vector pBR322, marcada con P32? __________________________________________________________________ __________________________________________________________________
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__________________________________________________________________ __________________________________________________________________

A continuacin se muestra una cadena sencilla de DNA: 5ATGGGGTAGAATTCGAATTCAAGCTTGGCCCTGCAGGGATCC3 Indicar las secuencias potenciales de reconocimiento de las enzimas de restriccin, si las hay, en la forma de doble hlice de DNA. __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ 4. Qu mtodo se usa para crear extremos cohesivos? __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ 5. A continuacin se muestran los sitios internos de corte del gen humano Cyp1A en el plsmido PCMvSport6. Enzima BamH I Sph I EcoRI HInC II Corte 1 2 1,773 1,577 2,444 1,515 1,071 732 1,345

Suponga que ha digerido este inserto con las encimas indicadas en la tabla anterior cada una por separado, y con BamH I- EcoRI. Lleve a cabo el anlisis de los productos de digestin despus de haber realizado una electroforesis de un gel
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teido con bromuro de etidio. En el esquema del gel mostrado a continuacin indicar en cada carril las bandas que se espera obtener para cada muestra. Gel de electroforesis teido kb Marcador BamH I 23,000 9,000 6,000 4,000 Sph I EcoRI HLnC II BamH I EcoRI

2,322 2,027

565 125

Referencias bibliogrficas Bolivar, F. et al., 1977 a. Construction and characterization of new cloning vehicles. I. Ampicillin-resistant derivatives of plasmid Pmb9. Gene 2, 75. Bolivar, F. et al., 1977b. Construction and characterization of new cloning vehicles. II. Ampicillin-resistant derivatives of plasmid Pmb9. Gene 2, 95. Sambrook, J., Fritsch, E., Maniatis, T. Molecular cloning. Cold spring Harbor Laboratory Press.

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Practica 9 REGULACIN GNICA EN PROCARIONTES. Objetivo El alumno entender el proceso de regulacin gnica en procariontes. Introduccin Jacob, Monod y colaboradores analizaron el sistema de la lactosa en E. coli, de manera que los resultados de sus estudios permitieron establecer el modelo gentico del Opern que permite comprender como tiene lugar la regulacin de la expresin gnica en bacterias. Jacob y Monod recibieron en 1965 el Premio Nobel pos estas investigaciones. Un Opern es grupo de genes estructurales cuya expresin est regulada por los mismos elementos de control (promotor y operador) y genes reguladores. Los principales elementos que constituyen un opern son los siguientes: Los genes estructurales: llevan informacin para polipptidos. Se trata de los genes cuya expresin est regulada. Los operones bacterianos suelen contener varios genes estructurales, son polignicos o policistrnicos. Hay algunos operones bacterianos que tienen un solo gene estructural. Los operones eucariticos suelen contener un slo gen estructural siendo monocistrnicos. El promotor (P): se trata de un elemento de control que es una regin del ADN con una secuencia que es reconocida por la ARN polimerasa para comenzar la transcripcin. Se encuentra inmediatamente antes de los genes estructurales. Abreviadamente se le designa por la letra P. El operador (O): se trata de otro elemento de control que es una regin del ADN con una secuencia que es reconocida por la protena reguladora. El operador se sita entre la regin promotora y los genes estructurales. Abreviadamente se le designa por la letra O. El gen regulador (i): secuencia de ADN que codifica para la protena reguladora que reconoce la secuencia de la regin del operador. El gen regulador est cerca de los genes estructurales del opern pero no est inmediatamente al lado. Abreviadamente se le denomina gen i. Protena reguladora: protena codificada por el gen regulador. Est protena se une a la regin del operador. Inductor: sustrato o compuesto cuya presencia induce la expresin de los genes.
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El opern lactosa: control negativo El Opern lactosa, que abreviadamente se denomina Opern lac, es un sistema inducible que est bajo control negativo, de manera que la protena reguladora, producto del gen regulador i, es un represor que impide la expresin de los genes estructurales en ausencia del inductor. El inductor del sistema es la lactosa. Como veremos ms adelante, el opern lac tambin est bajo control positivo, ya que existe otra protena que estimula la transcripcin de los genes estructurales. Los genes estructurales del opern lactosa son los siguientes: El gen z+: codifica para la b-galactosidasa que cataliza la hidrolisis de la lactosa en glucosa ms galactosa. El gen y+: codifica para la galactsido permeasa que transporta b-galactsidos al interior de la clula bacteriana. El gen a+: codifica para la tiogalactsido transacetilasa que cataliza la transferencia del grupo acetil del acetil Coenzima A al 6-OH de un aceptor tiogalatsido. Este gen no est relacionado con el metabolismo de la lactosa. El verdadero inductor del sistema es la Alolactosa y no la lactosa de manera que la -galactosidasa transforma la lactosa en Alolactosa. En los estudios del opern lactosa se utiliza como inductor un anlogo sinttico de la lactosa que es el Isopropil tiogalactsido (IPTG). El IPTG no necesita ser transportado por la galactsido permeasa para entrar en la bacteria. Las cepas normales de E. coli son inducibles, de manera que en ausencia del inductor (la lactosa), la protena represora producto del gen i se encuentra unida a la regin operadora e impide la unin de la ARN-polimerasa a la regin promotora y, como consecuencia, no se transcriben los genes estructurales. Opern lactosa: control positivo El opern lactosa tambin est sujeto a un control de tipo positivo, de manera que existe una protena que estimula la transcripcin de los genes estructurales. En los sistemas de control negativo existe una protena que que impide la transcripcin de los genes estructurales, en los sistemas de control positivo existe una prtena activadora que estimula la transcripcin de los genes. En principio existen cuatro tipos de sistemas posibles de regulacin de la expresin gnica: Tipo 1: Inducible, control negativo (opern lactosa y opern galactosa) Tipo 2: Inducible, control positivo (opern arabinosa y opern maltosa)
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Tipo 3: Represible, control negativo (opern triptfano y opern histidina) Tipo 4: Represible, control positivo (no se han descrito) Por supuesto, un opern pude estar sujeto a ms de un tipo de control, como sucede en el caso del opern lactosa que esta bajo control negativo ejercido por la protena represora y bajo control positivo ejecutado por una protena activadora por catabolitos (CAP) tambin llamada protena activadora del AMP cclico (CRP). El control positivo del opern lactosaa como veremos est estrechamente relacionado con la Represin catablica.

Figura: Opern de la lactosa.

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Cuestionario 1. Explicar con un ejemplo las diferencias fundamentales entre control negativo y positivo. __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ 2. Los mutantes lac Y puede sintetizar -galactosidasa. Sin embargo, aunque el gen lac I est intacto, no se puede inducir -galactosidasa aadiendo lactosa al medio. Explique por qu? __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ 3. Explicar porque las mutaciones I del opern lac son recesivas frente al alelo silvestre I+ y por qu I+ es recesivo frente a las mutaciones I5. __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ 4. Qu significa que las mutaciones Oc del opern lac sean dominantes en cis? __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________

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5. Completar el siguiente cuadro. Genotipo I+ P+ O+ Z+ Y+ / I+ P+ O+ Z+ Y+ I- P+ OC Z+ Y- / I+ P+ O+ Z- Y+ I+ P- OC Z- Y+ / I- P+ OC Z+ YIS P+ O+ Z+ Y- / I+ P+ O+ Z- Y+ IS P+ O+ Z+ Y+ / I- P+ O+ Z+ Y+ I- P+ OC Z+ Y- / I- P+ O+ Z- Y+ I- P- O+ Z+ Y- / I- P+ OC Z+ Y+ -galactosidasa sin lactosa con lactosa Permeasa sin lactosa con lactosa

a) b) c) d) e) f) g)

6. Como podra determinar experimentalmente si un gen se expresa de forma constitutiva. __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ 7. Comparar las caractersticas de los genes que se expresan de forma constitutiva con los que se expresan de forma regulada. __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________

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8. Describir y explicar, con ayuda de esquemas como funcionan el cAMP y CAP en el opern de la lactosa. __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________

Referencias bibliogrficas Jacob, F y J. Monod 1961. Genetic regulatory mechanisms in the synthesis of prteins. Journal of Molecular Biology 3:318-356 Klug W.S y Cummings M.R. 2002. Essentials of Genetics. 4Th ed. Prentice Hall. Upper Sadle River N.J. 508 pp. Lewin B. 2001. Genes VII. Oxford Press. New York. 990 pp. Lewis M., Chang G., Horton N.C., Kercher M.A., Pace H.C., Schumacher M.A., Brennan R.G y Lu P. 1996. Crystal structure of the lactose operon repressor and its complexes with DNA and inducer. Science 271: 1247-1254. Matthews K.S. 1996. The whole lactose repressor. Science 271:1245-1246. Niu W, Kim Y., Tau G., Heyduk T y Ebright R.H. 1996. Transcription activation ar class II CAP-dependent promoters: two interactios betwwn CAP and RNA polymerase. Cell 87: 1123-1134. Rodriguez Arnaiz R, Cataeda Sortibaran A y M. G. Ordaz Tellez 2004. Conceptos bsicos de gentica. Las prensas de Ciencias. 262 pp. Rusell P. J.2000. Fundamentals of Genetics. 2nd ed. Addison-Wesley Longman. San Francisco, CA. 527 pp.
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Practica 10 FACTORES INVOLUCRADOS EN LA REGULACIN DE LA TRANSCRIPCIN GNICA EN EUCARIONTES Y SUS FUNCIONES. Objetivo El alumno reconocer las caractersticas de los elementos involucrados en la regulacin de la transcripcin gnica en los eucariontes. Introduccin En los ecuariontes superiores la regulacin de la expresin gnica se encuentra ntimamente asociado con la estructura de la cromatina. Los promotores de los genes eucariotas se encuentran cromatinizados, y cuando un gen debe expresarse, el promotor debe adoptar una estructura abierta que permita la unin de la maquinaria basal de transcripcin a sus secuencias blanco. Los promotores se definen como secuencias que van de -40 a 40 pares de bases a partir del sitio de inicio de la transcripcin, muchos de los promotores tienen una caja TATA a donde se une la protena TBP (protena de unin a la caja TATA, TATA Binding Protein); aunque recientemente se ha demostrado la existencia de promotores que carecen de cajas TATA y que utilizan otras secuencias a donde tambin se une la maquinaria basal de transcripcin. Los promotores tambin tienen una regin llamada promotor proximal que va desde -40 hasta -200 pares de bases a la cual se unen otros factores transcripcionales. La apertura de la cromatina y la activacin de la expresin de un gen son eventos controlados que deben de ocurrir en un tiempo, espacio y tejidos determinados. Para que esto ocurra, adems de un promotor, los genes cuentan con regiones de control a distancia, como son los acrecentadores de la transcripcin, los silenciadores y los islotes. Los acrecentadores son elementos que tiene una organizacin modular, es decir, tienen sitios de unin para diversos factores transcripcionales, son tejidos especficos y todos aumentan la tasa de transcripcin. Los silenciadores tambin tienen una organizacin modular pero al contrario en los enhanceres, estos tienen un efecto negativo sobre la transcripcin. Una caracterstica compartida tanto por los acrecentadores como por los silenciadores en que se pueden actuar sobre un promotor independientemente de su posicin, es decir, pueden encontrarse rio arriba o rio abajo del promotor y potenciar o reprimir su trascripcin. A los acrecentadores y silenciadores se unen factores transcripcionales que pueden atraer actividades remodeladoras de la cromatina
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como acetiltransferasas de hisotonas para favorecer una estructura abierta o bien desacetilasas de hisotonas para favorecer una estructura cerrada. Debido a que estos elementos actan a grandes distancias sobre un promotor determinado, se hace evidente que deben de existir regiones de la cromatina que ayuden a organizar a los genes y a sus promotores en dominios bien definidos para evitar la promiscuidad entre los elementos de regulacin de un promotor determinado y los promotores de otro genes. Los islotes son elementos que tienen una actividad neutra, es decir no tienen efecto sobre la transcripcin, no son promotores, ni silenciadores. Son elementos contitutivos, es decir que se mantienen a lo largo de la diferenciacin celular y que no son tejidos especficos. Estos islotes se han encontrado en algunos casos enmarcando a un gen o a un grupo de genes y se ha propuesto que correspondan a los limites fsicos de los dominios transcripcionalmente activos. Se ha propuesto que estos elementos son capaces de ayudar a la formacin de un dominio transcripcionalmente activo protegindolo del silenciamiento por heterocromatizacion y de la accin de elementos de regulacin adyacentes al dominio. Funcionalmente los islotes se definen porque con capaces de bloquear la accin de un acrecentador sobre su promotor nicamente cuando esta posicionados entre el acrecentador y el promotor, es decir, su actividad depende de su posicin, al contrario de los silenciadores y de lo acrecentadores. Cuestionario 1. Se esta trantando de determinar cual es la regin promotora de un gen. Se ha clonado 3 fragmentos de DNA genmico que se encuentran rio arriba y rio abajo del posible inicio de la transcripcin del gen (A, B, C). Los fragmentos clonados se sobrelepan de la siguiente manera:

Las flechas indican el posible sitio de inicio de la transcripcin del gen.

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Se disea un ensayo utilizando un plsmido que lleva como gen reportero al de la luciferasa, es decide clonar los fragmentos rio arriba del gen reportero y hacer transfecciones transitorias en clulas eucariontes, medir la actividad del gen reportero 24 horas despus de la transfeccin haciendo un lisado de las clulas cuantificando la actividad de la luciferasa en un luminometro. Se obtienen los siguientes resultados: Plsmido control (solo lleva al gen de la luciferasa): 0.000 Plsmido con el fragmento A: 250 Plsmido con el fragmento B: 2000 Plsmido con el fragmento C: 1000 (a) Qu regin contiene el promotor? __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ (b) Por qu la actividad del gen reportero disminuye con el fragmento C? __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ (c) Al analizar otras de las clonas del fragmento B que se obtuvieron, hay una en particular que tiene mutada la caja TATA (sitio de unin TBP). De acuerdo a los valores obtenidos para los distintos fragmentos (A, B y C), cul ser la actividad hipottica del gen reportero si se ensaya este fragmento? __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________

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2. Se est tratando de determinar la funcin de un fragmento de DNA genmico que tiene varios posibles sitios de unin a factores de transcripcin. Se quiere determinar si se trata de un silenciador, o de un islote. El alumno todava no lo sabe pero esa regin es un islote. Se tiene el siguiente vactor y se decide seguir la estrategia de transfecciones transitorias en el problema No.1:

a) Dibujar en qu posicin o posiciones clonar el fragmento para demostrar que se trata de un silenciador.

b) Dibujar en qu posicin o posiciones clonar el fragmento para demostrar que se trata de un islote.

c) La actividad del gen reportero del plsmido control es de 20,000 unidades, de acuerdo a las construcciones de las respuestas para a y b. escribir para cada casi cual es la actividad terica del gen reportero. Recordar que el fragmento clonado tiene una actividad de islote. __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________
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Referencias bibliogrficas Lewin, B et. al. 2002. Genes VII Oxford University Press. Valdez-Graham V, y Recillas-Targa Flix 2001. Caractersticas y formacin de un dominio transcripcionalmente activo. Revista de Educacion Bioquimica 21, 2140. Rodriguez Arnaiz R, Cataeda Sortibaran A y M. G. Ordaz Tellez 2004. Conceptos bsicos de gentica. Las prensas de Ciencias. 262 pp. Rusell P. J.2000. Fundamentals of Genetics. 2nd ed. Addison-Wesley Longman. San Francisco, CA. 527 pp.

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Practica 11 BIOLOGA GENMICA Objetivo El alumno aprender una de las metodologas empleada en la construccin de un gen de diferentes especies de un gnero. Introduccin El trmino Genmica fue acuado hace aproximadamente 17 aos y hace referencia al estudio no slo de los genes, sino sus funciones, relaciones entre s y con el medio ambiente. Esta disciplina surge, como la farmacogentica y la medicina protemica, con la consolidacin, a fines de la dcada de los 80 del Proyecto Genoma Humano y nos introduce en un periodo de transicin de la medicina donde el conocimiento gentico especfico se torna crtico para brindar un cuidado efectivo de la salud para cada individuo. A diferencia de la gentica clsica que a partir de un fenotipo, generalmente mutante, busca el o los genes responsables de dicho fenotipo, la genmica tiene como objetivo predecir la funcin de los genes a partir de su secuencia o de sus interacciones con otros genes. As, la genmica tienen un enfoque distinto para responder preguntas biolgicas cuando se compara a otras ramas de la biologa ms tradicionales. En lugar de un enfoque reduccionista ms comnmente usado en otras ramas como lo son la biologa molecular o la bioqumica la genmica trata estos problemas de manera global. En el caso del estudio puro de genomas, la secuenciacin de un genoma genera informacin sobre todos los genes presentes en un genoma. Distintas caractersticas de los genes como posicin en el genoma, conservacin de los genes observada entre distintas especies y predicciones de la estructura de las protenas o el ARN ah codificados permiten inferir la funcin de algunos de los genes estudiados. En la genmica aplicada a estudios de transcriptmica se estudian los patrones de expresin de distintos genes a una escala global (vase Chip de ADN, PCR en tiempo real). De esta forma es posible sugerir posibles funciones e interacciones de genes observadas en un punto en el tiempo. Los estudios genmicos se caracterizan por su interdisciplinaridad debido a que el gran nmero de datos generados en un estudio de este tipo requiere combinar tanto conocimientos biolgicos como estadsticos e informticos. Por otra parte, los estudios en genmica utilizan una estrategia Top-down para analizar preguntas en biologa. Con este enfoque primero se observa el comportamiento global de muchos genes o biomolculas en un organismo (ARN mensajero, protenas, metabolitos, etc.) y eventualmente se llega a conclusiones ms particulares que conciernen solo algunas biomolculas. As la aplicacin de las ciencias genmicas permite abordar preguntas de gran significancia en biologa que requieren de una comprensin global del problema. Por ejemplo, para
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el estudio de distintas enfermedades genticas complejas es necesario disponer de una lista completa de los genes participantes y luego estudiar sus interacciones. Para entender la evolucin de los genomas tambin es necesario disponer de secuencias completas para poder inferir distintos eventos que pudieron dar lugar al estado actual del genoma. Para abordar distintos problemas biolgicos las ciencias genmicas se subidividen en distintas reas de conocimiento, por ejemplo la Genmica funcional, la Genmica estructural y la Genmica comparativa. Materiales y mtodos Material Diskettes o discos compactos (CD) nuevos. Equipo Computadora con conexin a internet Programa de alineamiento Programa para anlisis filogentico Mtodos 1. Investigar la biologa de las especies que conforman al genero Canis y de Lycaon pictus. 2. Entrar a la direccin electrnica del Gene Bank: http://ncbi.nlm.nih.gov/ 3. Seleccionar las secuencias nucleotidicas del citocromo b de las especies que se agrupan en el gnero Canis. 4. Guardar la informacin en un disco 5. Alinear las secuencias con el programa de alineamientos que hayas seleccionado. 6. Utilizar el programa para anlisis genticos y generan el o los arboles filogenticos, utilizando a L. pictus como grupo externo 7. Analizar los resultados e inferir la historia filogentica del genero Canis. Referencias bibliogrficas Beckoff. M.1977. Canis Latarans. Mammalian Species, 79, 1-9. Gotelli, D., Sillero-Zubiri, G.D, M.S. Roy, D.J Giramn, J. Garcia-Moreno, E.A. Ostrander y R.K. Wayne 1994. Molecular genetics of the most endangered canid: the etiopian wolf Canis simensis. Mol . Ecol. 3, 301-312. Martin, L.D. 1989. Fossil history of the terrestrial carnivore. En : Gittleman, J.l. (Ed) Carnivore behavior, ecology and evolution. Pp 536-568 Cornell University Press. New York.
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Practica 12 ESTUDIO GENEALOGICO EN GENETICA HUMANA Objetivo: El objetivo de esta prctica es que el alumno aprenda a confeccionar y esquematizar rboles genealgicos; a determinar, en la medida de los posible, el genotipo de los individuos que lo componen, y a conocer la transmisin de algunos caracteres sencillos y de fcil observacin. Introduccion: El hombre presenta ciertas caractersticas especiales que lo califican como un material difcil para el estudio gentico. De hecho, estas caractersticas son: 1. Hay una gran diversidad gentica de individuos, y tambin la estructura gentica de las poblaciones humanas vara continuamente debido a las migraciones, la mezcla de razas, etc. 2. Por motivos ticos y morales no se practican cruzamientos experimentales, de los que por otra parte no se obtendra gran informacin, ya que: a) de cada parto suele nacer un solo individuo b) las gestaciones son largas c) entre una generacin y la siguiente transcurre mucho tiempo d) el tamao de las familias es pequeo. En cambio, otros organismos que se utilizan frecuentemente en la investigacin gentica presentan caractersticas mucho ms ventajosas. Por ejemplo en los ratones, ocurre una generacin cada dos meses y los descendientes de cada pareja pueden contarse por decenas. En Drosophila, la generacin dura 20 das y se cuentan los descendientes por centenares. As, en estos organismos y otros de caractersticas similares, los cruzamientos experimentales constituyen uno de los mejores mtodos para el conocimiento de los caracteres hereditarios. Por lo tanto, la gentica humana tiene que recurrir para su desarrollo a mtodos indirectos tales como el uso de pedigrs o rboles genealgicos, anlisis de poblaciones, etc. A pesar de todas estas dificultades, desde principios de siglo y mediante el uso de tcnicas genealgicas, se ha ido acumulando el conocimiento de nuevos caracteres determinados genticamente y de los genes que los controlan, hasta llegar a varios millares. Posteriormente, las tcnicas citogenticas y moleculares han permitido identificar nuevos genes y determinar su localizacin cromosmica.
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Material: El material biolgico de esta prctica sern los propios alumnos y sus familiares para la observacin de algunos caracteres genticos. Con sus datos se elaborarn las genealogas. Procedimiento: La prctica en s consiste, en primer lugar, en el reconocimiento de las variaciones fenotpicas para cada uno de los caracteres monognicos que se describen a continuacin, de donde el alumno deducir su genotipo en cada caso. Los datos se tomarn en una hoja como la que se indica al final de esta prctica. Se usar una hoja de datos para cada persona. Descripcin de los caracteres 1) Disposicin del lbulo de la oreja. Lbulo separado de la mejilla o pegado lateralmente a la mejilla. 2) Lnea frontal del pelo. Puede ser continua o tener un saliente frontal en el centro denominado "pico de viuda". Obviamente las personas calvas no se pueden contabilizar. 3) Capacidad de enrollar la lengua. Ser o no capaces de enrollar la lengua en forma de U fuera de la boca. 4) Pigmentacin del iris. Ojos azules frente a ojos ms oscuros, sean stos verdes o marrones. Lo que se compara es la ausencia total o no de pigmentacin en la superficie del ojo. En ausencia de sta, se observa la lmina interna azul del iris, y los ojos sern totalmente azules. La presencia de pigmento en las capas superiores del iris enmascara en mayor o menor grado el color azul del fondo. Otros genes determinan el color exacto y su intensidad para ojos verdes, marrones, etc., pero en esto no nos fijaremos. 5) Hiperextensibilidad del dedo pulgar. Capacidad o incapacidad de doblar hacia atrs la ltima falange del pulgar en un ngulo de casi 90 respecto a la anterior ("dedo del autoestopista"). Esta capacidad puede manifestarse slo en una de las manos, y la expresividad del rasgo es variable. 6) Dedo meique doblado. El meique puede estar recto, o bien con la ltima falange doblada hacia el dedo anular. Se colocan ambas manos relajadas sobre una mesa y se observa si los dedos estn paralelos o si los meiques se doblan hacia dentro. 7) Longitud relativa del dedo ndice. Dedo ndice ms o menos largo que el anular. Se realiza la observacin como en el caso anterior. Se trata de un carcter de expresin influenciada por el sexo.
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8) Hoyuelos faciales a ambos lados de la boca. Presencia o ausencia de hoyuelos en las mejillas. 9) Presencia de pelo en las segundas falanges de los dedos. Aunque slo haya algo de pelo en alguna de las diez falanges, se considera como fenotipo positivo. 10) Dedo gordo del pie corto. El dedo gordo del pie puede ser ms corto o ms largo que el ndice adyacente. 11) Capacidad de detectar la feniltiocarbamida (PTC). Hay individuos que detectan un sabor amargo y otras que no notan nada. Introducir primero en la boca el papel control, ensalivar, y sacar de la boca. Introducir a continuacin el papel impregnado en PTC y ensalivar. Una vez realizada la observacin, proceder de la siguiente manera: 1. Tomar los datos del fenotipo propio 2. Anotar todos los fenotipos en el lugar correspondiente de la hoja de datos. 3. Tomar los datos de tantos parientes (padres, hermanos, abuelos, tos) como sea posible. 4. Anotar los datos de cada persona en una hoja de datos diferente. 5. Confeccionar el rbol genealgico indicando el fenotipo de cada persona para, al menos, dos de los caracteres analizados. 6. Determinar si es posible el tipo de herencia de los caracteres analizados. 7. En base al tipo de herencia, nombrar los alelos adjudicados a cada carcter en la hoja de datos, usando una letra distinta para cada carcter, en maysculas/minsculas para dominante/recesivo. 8. Por ltimo, indicar cuando sea posible los genotipos de todos los miembros para cada carcter. Como ejemplo de rbol genealgico se seguir un esquema como el que se indica a continuacin:

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II

III

En la genealoga se indica el orden de las generaciones con nmero romano. La primera generacin (I) corresponde a la primera persona de la que se posean datos, por ejemplo la de los abuelos del alumno; la segunda (II) correspondera a la de los padres y tos, y la tercera (III), a la generacin del alumno. Los varones se representan con cuadrados, las mujeres con crculos, y por rombos los individuos de los que no se conocen los datos (II.9). Las parejas se unen por una lnea horizontal. Los descendientes se disponen bajo una lnea horizontal desde la que parte una lnea vertical por individuo, excepto en el caso de mellizos (III.4 y 5) o gemelos fraternos (II.4 y 5), que se indican por lneas convergentes (ver figura). Los individuos que muestran el fenotipo en estudio se indican rellenando el smbolo.

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Referencias: Rodriguez Arnaiz R, Cataeda Sortibaran A y M. G. Ordaz Tellez 2004. Conceptos bsicos de gentica. Las prensas de Ciencias. 262 pp. Rusell P. J.2000. Fundamentals of Genetics. 2nd ed. Addison-Wesley Longman. San Francisco, CA. 527 pp.

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HOJA DE DATOS 1 Parentesco: Fenotipo Lbulo de la oreja ..... separado ..... unido Pico de viuda Lengua en U .... presente .... ausente ..... capaz ..... incapaz Fenotipo Dedo autoestopista ..... presente..... ausente Longitud del ndice ..... corto ..... largo Dedo meique ..... curvado ..... recto .... presentes... ausentes

Pigmentacin del iris Pelo en 2 falanges Deteccin PTC:

.... presente ..... ausente Hoyuelos faciales .... presente .... ausente . NO

Dedo gordo del pie ..... corto ..... largo

. SI

HOJA DE DATOS 2 Parentesco: Fenotipo Lbulo de la oreja ..... separado..... unido Pico de viuda .... presente Lengua en U ..... capaz Pigmentacin del iris .... ausente ..... incapaz Fenotipo Dedo autoestopista ..... presente..... ausente Longitud del ndice ..... corto ..... largo ..... recto

Dedo meique .... curvado

... presente ..... ausente

Hoyuelos faciales.... presentes... ausentes Dedo gordo del pie ..... corto ..... largo

Pelo en 2 falanges ... presente ..... ausente Deteccin PTC: . SI . NO

HOJA DE DATOS 3 Parentesco: Fenotipo Lbulo de la oreja ..... separado..... unido Pico de viuda ..... presente .... ausente Fenotipo Dedo autoestopista ..... presente..... ausente Longitud del ndice ..... corto ..... largo Dedo meique.... curvado Hoyuelos faciales ..... recto

Lengua en U.... capaz ..... incapaz Pigmentacin del iris.... presente..... ausente Pelo en 2 falanges.... presente..... ausente Deteccin PTC: . SI . NO

.... presentes... ausentes

Dedo gordo del pie ..... corto ..... largo

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Practica 13 ESTUDIO DE LA HERENCIA POLIGENICA RECUENTO DE LAS LNEAS DE LAS HUELLAS DACTILARES Objetivo: Que el alumno comprenda la importancia del estudio de la herencia poligenica. Y comprenda el estudio que ser totalmente de las lneas de la huella (en ingls: total ridge count o TRC) Introduccin: La herencia polignica no se puede analizar empleando pedigres ni estudiando los cromosomas (de no ser que se estudie una aberracin cromosmica en concreto). Un rasgo polignico es el fenotipo resultante de la accin de dos o ms genes. Estos tienen unas caractersticas comunes: 1.- los rasgos se cuantifican midindose, 2.-los rasgos son controlados por 2 o ms genes resultando en un efecto aditivo, 3.- los rasgos son controlados por efecto de alelos mltiples, 4.- los fenotipos de los rasgos polignicos y multifactoriales varan de expresin por efecto de los factores ambientales. Existen numerosos ejemplos de este tipo de herencia por ejemplo la estatura, el peso, la inteligencia, el color de la piel, etc. Demostrar y estudiar la herencia de los rasgos polignicos no es fcil. El ejemplo que a continuacin te proponemos estudiar explorar cmo los rasgos de la herencia de las huellas dactilares son modelos de herencia polignicas. Recogeris las huellas dactilares vuestras y prepararis un perfil de las mismas. En 1890, Francis Galton sugiri que las huellas dactilares seran una buena manera de identificacin para humanos. Durante los ltimos aos de hecho, tanto los dibujos de las huellas dactilares (de las manos y pies) y de las huellas de las palmas de las manos y pies han sido de gran inters para numerosos estudios especializados. Un ejemplo de su utilidad es el estudio de la huella del recin nacido para el diagnstico precoz de anormalidades cromosmicas. La herencia de las huellas dactilares, al igual que los dems caracteres de herencia polignica, tambin se ve influda por factores ambientales aunque, debido a la precocidad y rapidez del desarrollo de stas, el fenotipo no cambiar tras el nacimiento. Las huellas dactilares se pueden detectar a partir de la 6 semana de desarrollo fetal, llegando a su mayor desarrollo hacia la semana 12-13. Posteriormente regresarn hasta adquirir la morfologa final que ya no se ver alterada durante el restante desarrollo prenatal y postnatal.

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ARCOS

LAZOS

ESPIRALES

Clasificacin de las huellas Los patrones de los dibujos de las huellas se pueden clasificas en tres grupos principalmente: arcos, lazos y espirales. El arco es el patrn ms simple y menos frecuente. En las huellas donde aparecen lazos, las lneas aparecen en tres direcciones, encontrndose en un punto intermedio (el trirradio) con ngulos de unos 120 grados. En el centro del punto de encuentro se forma un tringulo. Los lazos pueden denominarse radiales o cubitales, dependiendo de hacia dnde estn inclinados; por ejemplo, un dedo meique presentar un lazo radial si su trirradio se abre hacia el pulgar de su misma mano. Un lazo cubital ser aquel que del pulgar se abra hacia el meique de la misma mano. El patrn espiral presenta dos trirradios (formndose dos tringulos). Las frecuencias de estros tres patrones en la poblacin son de 5,0% para el arco, 5,4% para el lazo radial, 63,5% para el lazo cubital, y 26,1% para el espiral. Caractersticas de algunos sndromes comunes: - Trisoma 21: dedos con lazos cubitales generalmente, lazos radiales en dedos 4 y 5. - Trisoma 18: lneas poco desarrolladas, gran frecuencia de arcos (media de 7-8 con al menos un arco). En los pulgares sin arcos, con lazos radiales, recuentos TRC bajos. - Sndrome de Turner (45,X): alto recuento TRC sin aumento de espirales. Relacin entre la media de TRC y el nmero de cromosomas X e Y 45, X 46, XY 46, XX 47, XXY 165 145 126 114 47, XYY 48, XXYY 48, XYYY 49, XXXXX 103 88 83 17

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Materiales: Cinta tape transparente. Regla Metodologia: 1.- Recogida de un juego completo de huellas dactilares propias. 2.- Clasificar las huellas de acuerdo a su morfologa. 3.- Determinar el recuento total de lneas (TRC) de un juego completo de huellas. 4.- Construr un histograma de la distribucin de frecuencias con los datos obtenidos del grupo de prcticas. 5.- Discutir las caractersticas de la herencia polignica y el por qu de su difcil anlisis. Bibliografia: Beckoff. M.1977. Canis Latarans. Mammalian Species, 79, 1-9. Gotelli, D., Sillero-Zubiri, G.D, M.S. Roy, D.J Giramn, J. Garcia-Moreno, E.A. Ostrander y R.K. Wayne 1994. Molecular genetics of the most endangered canid: the etiopian wolf Canis simensis. Mol . Ecol. 3, 301-312. Martin, L.D. 1989. Fossil history of the terrestrial carnivore. En : Gittleman, J.l. (Ed) Carnivore behavior, ecology and evolution. Pp 536-568 Cornell University Press. New York.

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Resultados: Recogida de datos individuales (pegar aqu la cinta adhesiva con las huellas en cada casilla) pulgar derecho (I) ndice derecho (II) corazn dcho (III) anular derecho meique (VI) dcho(V)

pulgar izquierdo (I)

ndice izquierdo (II) corazn izdo (III)

anular izdo (IV) meique (V)

izdo

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mano derecha pulgar patrn obtenido: recuento parcial: _________ _________ _________ _________ _________ ndice corazn anular meique

_________ _________ _________ _________ _________

recuento total = mano dcha

_________

mano izquierda pulgar patrn obtenido: recuento parcial: _________ _________ _________ _________ _________ ndice corazn anular meique

_________ _________ _________ _________ _________

recuento total = mano izda

_________

Recuento total dos manos:

TRC= ___________

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Recogida de datos del grupo de prcticas sexo estudiante 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21

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V/M

TRC

lazos*

espirales*

arcos*

22 23 24

% del total:

______

______

______

media del TRC: media mujeres: media varones: TRC

________

________ TRC ________

(*) poner el nmero de dedos

Realizar un histograma de frecuencias.

Preguntas de la prctica:

1.- Cul es la media TRC para la clase? Existen diferencias en las TRC medias para los varones y mujeres? 2.- Cul puede ser la causa de esta diferencia? Razona tu respuesta. 3.- Compara tu TRC con la media total y con la de tu sexo. 4.- Resume y razona los resultados obtenidos en el histograma. 5.- De haber recogido datos de una poblacin mucho mayor crees que el grfico presentara otro aspecto? Razona tu respuesta.
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Practica 14 ESTUDIO DE POLIMORFISMOS ANLISIS DEL GRUPO SANGUNEO Objetivo: El objetivo del analisis del gurpo sangineo es analizar un polimorfismo evidente fenotpicamente, como es el de los grupos sanguneos. Se pretende dar a conocer la base gentica de los grupos sanguneos ms importantes. Se determinarn los grupos sanguneos de cada alumno mediante la extraccin de unas gotas de sangre por puncin del cuarto dedo de una mano con una lanceta estril. Introduccin: Los polimorfismos son el reflejo de la diversidad gentica de la especie. Se dice que existe un polimorfismo en un determinado locus cuando hay ms de un alelo presente en la poblacin con una frecuencia superior al 1%. Aunque un individuo slo puede presentar como mximo dos alelos distintos para un locus, un estudio poblacional puede revelar la presencia de mltiples alelos para ese locus, especialmente en ciertos loci que son altamente polimrficos. Una pequea proporcin de los polimorfismos en el ADN dar lugar a diferencias a nivel de los aminocidos codificados, produciendo por tanto un polimorfismo de protenas. Pero la mayora de los polimorfismos en las secuencias de ADN ocurren en ADN no codificante, y no tienen por tanto efecto fenotpico (se denominan silenciosos). La causa de que la mayor parte de polimorfismos sean silenciosos es, por una parte, que la gran mayora del genoma humano consiste en ADN no codificante; y por otra, que este ADN est sometido a menores presiones selectivas. En esta prctica abordaremos el estudio de polimorfismos humanos de dos maneras muy distintas. En primer lugar se estudiar el polimorfismo del locus AB0 que determina el grupo sanguneo. Puesto que es ste un polimorfismo fenotpico, y adems la penetrancia es del 100%, el anlisis se har directamente sobre el producto gnico. Materiales: Sangre de los indviduos. Metodologia: Sistema AB0 La determinacin de grupos del sistema AB0 se efecta enfrentando los hemates problema con antisueros de especificidad conocida: anti-A, anti-B y anti A,B (grupo 0). La aglutinacin o no aglutinacin de los hemates ensayados frente
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a cada uno de los antisueros es indicativa de la presencia o ausencia de los correspondientes antgenos en los mismos. 1.- Dividir un porta en cuadrados. Rotular las divisiones: anti-A, anti-B y anti-AB. 2.- Con una lanceta estril realizar una puncin en el cuarto dedo de una mano. 3.- Depositar en cada cuadrado una gota muy pequea de la sangre a ensayar. 4.- Aadir 1 gota de cada antisuero en su respectivo cuadrado. 5.- Mezclar bien la sangre con el reactivo empleando palillos distintos para cada ensayo. 6.- Mover la placa lentamente por rotacin a temperatura ambiente. Examinar macroscpicamente la aparicin de aglutinacin a los 2 minutos. Sistema Rh (anti-D) La presencia del antgeno D se determina enfrentando los hemates problema, en un medio proteico alto, con suero anti-D. La aglutinacin o no aglutinacin de los hemates ensayados es indicativa de la presencia o ausencia del correspondiente antgeno en los mismos. 1.- Depositar una gota de suero anti-D sobre un porta rotulado. 2.- Sobre otro porta depositar una gota de Autocontrol Rh-hr CROMATEST. 3.- Aadir a cada porta 2 gotas de sangre de un tamao aproximado a la gota de suero en l depositada. 4.- Con palillos distintos mezclar reactivo y sangre de forma que cubran una extensin de unos 2 cm cuadrados. 5.- Colocar los portas sobre la lmpara visualizadora precalentada (45). 6.- Mover la lmpara lentamente con movimientos pendulares durante 2 minutos, observando macroscpicamente la aparicin de cualquier signo de aglutinacin . Lectura Reaccin negativa: ausencia de aglutinacin al cabo de los 2 minutos. Reaccin positiva: aglutinacin visible a los dos minutos y ausencia de aglutinacin con el autocontrol. La reaccin positiva indicar cul es el antgeno presente en los eritrocitos (por ej. si sale aglutinacin en la casilla A el grupo sanguneo ser A). Si los hemates presentasen aglutinacin en el Autocontrol, dar el resultado como no vlido. Cuestionario: 1.- Anotar los resultados obtenidos y deducir el genotipo genotipos posibles. 2.- Por qu se tiene en cuenta el grupo sanguneo de las series AB0 y Rh en las transfusiones y no la serie MN? 3.- Por qu el antgeno D define bsicamente al grupo Rh? 4.- Por qu el anlisis de los grupos sanguneos slo sirve en algunos casos para exclur la paternidad y no para asignarla? 5.- En qu casos la eritroblastosis fetal puede manifestarse en el primer embarazo asumiendo incompatibilidad Rh?
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Referencias: Rodriguez Arnaiz R, Cataeda Sortibaran A y M. G. Ordaz Tellez 2004. Conceptos bsicos de gentica. Las prensas de Ciencias. 262 pp. Rusell P. J.2000. Fundamentals of Genetics. 2nd ed. Addison-Wesley Longman. San Francisco, CA. 527 pp.

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Practica 15 TECNICA DE APLASTAMIENTO PARA EL ESTUDIO DE CROMOSOMAS

OBJETIVO Que el alumno comprenda la importancia del estudio de los cromosomas como portadores de la informacion genetica. INTRODUCCION Los cromosomas son las estructuras en que se organiza la cromatina nuclear y que tienen una expresin dinmica en las distintas fases del ciclo celular. En la mitosis estas estructuras comienzan un proceso de compactacin que alcanza su mximo nivel en la metafase. Los cromosomas se tien fcilmente cuando estn condensados y pueden ser individualizados con el microscopio ptico. Cada cromosoma contiene una molcula de ADN lineal asociado a distintas protenas y el contenido de genes es variable aunque est en relacin con su tamao. Por eso, cualquier alteracin en el nmero o la estructura de los cromosomas puede ser causa de enfermedades. Para la deteccin de estas alteraciones se desarrollaron numerosas tcnicas y todas ellas requieren de un observador entrenado que las interprete. Los humanos tenemos un nmero total de 46 cromosomas y este nmero vara segn las especies. Los 46 cromosomas estn constituidos por 23 pares de homlogos y cada miembro del par proviene de un progenitor. El cariotipo es la constitucin cromosmica de un individuo y es un estudio de rutina en gentica mdica. Los cariotipos se pueden informar presentando todos los pares cromosmicos ordenados de acuerdo a su tamao, que en un principio eran recortados de la fotografa de una metafase, y ahora se pueden hacer con analizadores automticos. De los 23 pares, el par de cromosomas sexuales se seala por separado para indicar el sexo del individuo. Para citar el cariotipo de un individuo se indica primero el nmero total de cromosomas y seguidamente los componentes del par sexual precedido de una coma. As, el cariotipo normal de un varn se escribe 46,XY y el de una mujer 46,XX. Las anomalas cromosmicas son una causa ms importante de abortos espontneos, retardo mental y malformaciones. METODOLOGIA 1. Utilizando una navaja corte las puntas radiculares que han crecido en la base de la cebolla colocada en agua; descarte las races mayores a 2 cm. Coloque la mitad de las puntas radiculares en colchicina y la otra proporcin en solucin de Carnoy. Mantenga las muestras siempre frescas y no deje que se sequen en ningn momento. Sea precavido con la
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colchicina ya que es venenosa (lave inmediatamente cualquier area de contacto) Despus de unas horas en la solucin de Carnoy, remueca cuatro puntas radiculares y coloque las puntas en la solucin de maceracin (1:1 de alcohol: HCl). Cronometre bien el tiempo en estos pasos, a intervalos de dos minutos remueva las puntas radiculares a viales con 45% de acido actico marcado con 2, 4,6 y 8 minutos. Las puntas radiculares debern permanecer por lo menos durante 15 minutos en acido actico al 45%. Agregue una gota de acetocarmin a un portaobjeto y tranfiera la punta radicular macerada por dos minutos en el carmn. Utilice agujas con puntas finas (entomolgicas) para remover la punta de 1mm. Descarte la opcin restante de la raz, adicione acetocarmin a la punta si es necesario. Detenga la punta de la raz con una aguja de diseccion (de preferencia con punta de dicromo) y rasge la punta; durante este procedimiento la acetocarmina se tornara ligeramente morado, esto es ventajoso ya que acelera la reaccin de la tincin de la cromatina. Si se expone mucho a la punta de acero la tincin formara un precipitado oscuro que puede arruinar la preparacin. Ponga un cubreobjetos limpio y adicione acetocarmin para rellenar los espacios bajo el cubreobjetos. Invierta cuidadosamente la preparacin y coloque en los bordes de papel secante; presione con cuidado, pero no fuerte para aplastar las clulas. No deje que se resbale a los lados la preparacin. Caliente en un mechero de alcohol la preparacin con la muestra arriba para diferenciar la tincin (los cromosomas se tien mas y el citoplasma se aclara), cuide que no hierva la preparacin de acetocarmina. Con la punta del borrador de un lpiz presione ligeramente la preparacin para aplanar mas las clulas. Puede en este paso sellar los lados del cubreobjetos con barniz de uas. Examine la preparacin del microscopio utilizando un filtro verde para mejor claridez. Si las clulas estn conglomeradas y no aplanadas, descarte la preparacin y utilice las puntas radiculares que se encuentran maceradas a 4 minutos y si aun no hay xito utilice las de mayor tiempo. Aunque la maceracin prolongada resulta en fallas en la captacin de tincin del ncleo y cromosomas. No haga las preparaciones de forma mecnica, hgalas de una en una y no apresuradamente. Guarde mejor la preparacin para posteriores estudios. Si las mantiene por ms de 2 o 3 das es mejor colocarlas en una caja de petri con un poco de papel secante hmedo y mantenerlas en el

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refrigerador. Normalmente las mejores preparaciones se encuentran durante los primeros das despus de preparadas. 10. Las puntas colocadas en la colchicina deben removerse despus de 6 horas, colocarse en solucin de carnoy par fijarse. Despus de la fijacin se aplastan y tien en acetocarmin. 11. El numero de cromosomas de la cebolla comn allium cepa es e 2n=16 Referencias: Gotelli, D., Sillero-Zubiri, G.D, M.S. Roy, D.J Giramn, J. Garcia-Moreno, E.A. Ostrander y R.K. Wayne 1994. Molecular genetics of the most endangered canid: the etiopian wolf Canis simensis. Mol . Ecol. 3, 301-312. Rodriguez Arnaiz R, Cataeda Sortibaran A y M. G. Ordaz Tellez 2004. Conceptos bsicos de gentica. Las prensas de Ciencias. 262 pp. Rusell P. J.2000. Fundamentals of Genetics. 2nd ed. Addison-Wesley Longman. San Francisco, CA. 527 pp.

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