MTODOS DE DETECO DE MICRORGANISNOS INDICADORES

Autor: Michele Almeida da Cunha Orientador: Marilene Rodrigues e Silva Resumo A contaminao de alimentos por microrganismos, a sua proliferao em termos de sade publica e a preocupao em desenvolver mtodos de controles em empresas alimentcias vem a muito tempo crescendo no mundo todo. O alimento por si prprio um meio de cultura excelente para a proliferao de microorganismos. E atravs destes microrganismos que podemos avaliar o grau e a procedncia da contaminao, bem como o perodo previsto para o consumo do alimento antes da sua deteriorao. Tem-se, portanto, tornado normal a prtica de analisar nos alimentos a existncia de bactrias produtoras de toxinfeces alimentares. Estas bactrias so denominadas microrganismos indicadores e so geralmente consideradas como sendo de grande significncia quando da avaliao da segurana e qualidade microbiolgicas de alimentos. Tal identificao s possvel atravs de alguns mtodos de anlises, onde destacamos a importncia da amostragem e da preparao da amostragem para um diagnstico preciso e confivel perante aos padres exigidos pelos rgos oficiais. Palavras-chave: Microrganismos indicadores; contaminao e segurana alimentar. Abstract The food contamination by microorganisms, its proliferation in terms of public health and the preoccupation of development controls methods in food companies are growing in the all world a long time. The food is an excellent culture ambience for microorganisms proliferation. We can evaluate the degree and the contamination origin through these microorganisms, as well a period foreseen for the food contamination before its deterioration. However, it has become normal practice to analyze in food an existence of bacterium that produces alimentary toxinfections. The bacterium is called indicative microorganism and it is generally considered as being of great importance when evaluates of the microbiological security and quality food. Such identification is possible only through some analyze methods, where we detach the importance of the sampling and of the sampling preparation for a precise and trustful diagnostic by standards demanded by official organs. Keywords: Indicating microorganism; contamination and security alimentary.

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1- Introduo Os microrganismos esto intimamente associados com a disponibilidade, a abundncia e a qualidade do alimento para consumo humano. Alimentos so facilmente contaminados com microrganismos na natureza, durante manipulao e processamento. Aps ter sido contaminado, o alimento serve como meio para o crescimento de microrganismos, podendo at mesmo mudar as caractersticas fsicas, qumicas e organolpticas do alimento levando o mesmo a deteriorao. (Chan, Krieg & Pelczar, 1996). Embora as estatsticas brasileiras sejam precrias, acredita-se que a incidncia de doenas microbianas de origem alimentar em nosso pas seja bastante elevada. Mesmo em pases desenvolvidos, nos quais o abastecimento de gneros alimentcios considerado seguro do ponto de vista de higiene e sade pblica, a ocorrncia de doenas desta natureza significante e vem aumentando, apesar dos avanos tecnolgicos nas reas de produo e controle de alimentos. (Franco, 2003). Nos Estados Unidos at a dcada de 50, a indstria de alimentos contava apenas com a anlise laboratorial dos lotes produzidos para fins de controle de segurana e qualidade. Assim, um lote era preparado e, caso a anlise demonstrasse que apresentava as condies desejadas, era liberado; se no, era retido. Tentando melhorar, a indstria de alimentos adaptou a Boas Prticas (BP) da indstria farmacutica, dando um grande passo para melhorar e dinamizar a produo de alimentos seguros e de qualidade. Com as Boas Prticas de Fabricao (BPF), comeouse a controlar, segundo normas estabelecidas, a gua, as contaminaes cruzadas, as pragas, a higiene e o comportamento do manipulador, a higienizao das superfcies, o fluxo do processo e outros itens. (SENAI, 2005). Com o tempo foi sendo verificado que a BPF e a anlise do produto final no garantia 100% de segurana dos alimentos. Este dado foi comprovado com estudos feitos pela NASA ao observar que durante os vos tripulados o principal veculo de patgenos para os astronautas eram os alimentos. Assim, a NASA junto com o Pilrsbury Co desenvolveu o sistema Hazard Analysis and Critical Control Point (HACCP), traduzido no Brasil como Sistema de Anlise de Perigos e Pontos Crticos de Controle (APPCC). Este sistema permite levantar os perigos biolgicos, qumicos e fsicos significativos que podem ocorrer na produo de um determinado alimento em uma determinada linha de processamento, e control-los nos Pontos Crticos de Controle (PCC), durante a produo (SENAI, 2005). Os perigos de natureza biolgica incluem bactrias toxignicas e infecciosas dentre outros. Os perigos de natureza qumica incluem pesticidas, produtos de limpezas enquanto que os perigos de natureza fsica incluem fragmentos de metais pesados, vidro, farpas de madeira, pedras, etc. (Franco,2003). No Brasil, entre a dcada de 60 e 70 as BP j eram exigidas, pelo Decreto-lei n 986, de 21 de outubro de 1969 que instituiu normas bsicas sobre alimentos. Porm o APPCC s foi introduzido no final da dcada 90 pela portaria do governo n326/SVS/MS de 30 de julho de 1997 que aprova o regulamen-

to tcnico; Condies Higinico-Sanitrias e de Boas Prticas de Fabricao para estabelecimento produtos/ industrializadores de alimentos. Em 2 de janeiro de 2001 a ANVISA (Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria) aprovou a resoluo RDC N12, que estabelece os Padres Microbiolgicos para alimentos e determina os critrios para a concluso e interpretaes de resultados das anlises microbiolgicas dos alimentos destinados ao consumo humano. (ANVISA, 2005). O alimento quem determina qual o microrganismo capaz ou incapaz de se desenvolver. Conhecendo-se as caractersticas do alimento, podemos, predizer a flora microbiana que nele poder se multiplicar. (SILVA, 2000). Da se d a importncia da anlise microbiolgica, pois inmeros mtodos laboratoriais podem ser utilizados para investigar a ausncia ou presena destes microrganismos. (Franco, 2003). Cuidados especiais devem ser tomados na colheita de amostra para anlise microbiolgica de alimentos. Desta primeira fase de anlise, depende, em muito, a validade de interpretao dos resultados laboratoriais. (Siqueira, R. S., 1995). Os seguintes tpicos so importantes no estudo dos mtodos de anlise microbiolgica de alimentos: amostragem, preparao da amostra para anlise, mtodos de contagem de microrganismos e isolamento e identificao de patgenos. (Franco, 2003). 2- Microrganismos Indicadores Os nmeros e tipos de microrganismos presentes dentro ou sobre os alimentos produzidos podem ser usados para avaliar com segurana a qualidade microbiolgica dos mesmos. A segurana determinada pela ausncia ou presena de microrganismos patognicos ou suas toxinas, a quantidade do inculo, e o tempo de controle ou destruio desses agentes. Testes para organismos indicadores podem ser usados para avaliar tambm a qualidade microbiolgica ou segurana quando h uma relao entre a ocorrncia de um organismo indicador e a provvel presena de um patgeno ou toxina for estabelecida. (Doyle, Beuchat, & Montiville, 1997). Alguns critrios devem ser considerados na definio de um microrganismo ou grupo de microrganismos indicadores: (I) deve ser de rpida e fcil deteco; (II) deve ser facilmente distinguvel de outros microrganismos da microbiota do alimento; (III) no deve estar presente como contaminante natural do alimento, pois assim sua deteco no indicar, necessariamente, a presena de matria fecal ou dos patgenos; (IV) deve estar sempre presente quando o patgeno associado estiver; (V) seu nmero deve correlacionar -se com o do patgeno; (VI) deve apresentar necessidades de crescimento e velocidade de crescimento semelhantes as do patgeno; (VII) deve ter velocidade de morte que seja ao menos semelhante do patgeno e, se possvel, sobrevivncia levemente superior do patgeno; (VIII) deve estar ausente nos alimentos que esto livres do patgeno, ou estar presente em quantidades mnimas .(XI) ter como hbitat exclusivo o trato intestinal do homem e outros animais; (X) deveria ocorrer em nmero muito alto nas fezes; (XI) deveria apresentar alta re-

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sistncia ao ambiente extra-enteral; (XII) deveria haver tcnicas rpidas, simples e precisas para a sua deteco e/ou contagem. (Doyle, Beuchat, & Montiville, 1997). Segundo a ICMSF (International Commission on Microbiological Specifications for Foods) microrganismos indicadores podem ser agrupados em: (I) Microrganismos que no oferecem um riscos direto a sade: contagem padro de mesfila, contagem de psicrotrficos e termfilos, contagem de bolores e leveduras. (II) Microrganismos que oferecem um risco baixo ou indireto sade: coliformes totais, coliformes fecais, Enterococcus, Enterobactriaceae totais e Escherichia coli . (SILVA, 2002). O uso de Escherichia coli como um indicador de contaminao de origem fecal presente em gua foi proposto em 1892 por Teobaldo Smith, uma vez que esse microrganismo encontrado no contedo intestinal do homem e animais homeotrmicos. (Franco, 2003). 2.1- Coliformes totais Este grupo composto por bactrias da famlia Enterobacteriaceae, capazes de fermentar a lactose com produo de gs, quando incubados a 35-37C, por 48 horas. So bacilos gram-negativos e no formadores de esporos. (Franco, 2003). Fazem partes desse grupo predominantemente bactrias pertencentes aos gneros Escherichia, Enterobacter, Citrobacter e Klebsiella. Destes, apenas a Escherichia coli tem como hbitat primrio o trato intestinal do homem e animais homeotrmicos. Os demais - Citrobacter, Enterobacter e Klebsiella -, alm de serem encontrados nas fezes, tambm esto presentes em outros ambientes como na vegetao e no solo, onde persistem por tempo superior ao de bactrias patognicas de origem intestinal como Samonella e Shigella. Conseqentemente, a presena de coliformes totais no alimento no indica, necessariamente, contaminao fecal recente ou ocorrncia de enteropatgenos. (Franco, 2003). 2.2- Coliformes fecais e Escherichia coli As bactrias pertencentes a este grupo correspondem aos coliformes totais que apresentam a capacidade de continuar fermentando lactose com produo de gs, quando incubadas a temperaturas de 44-45C. (Franco, 2003). Os critrios microbiolgicos que envolvem E.coli so teis quando desejvel determinar se houve contaminao fecal. (Doyle, Beuchat, & Montiville, 1997). Atualmente, ao invs de enumerar os coliformes fecais e E.coli alguns laboratrios esto preferindo enumerar as bactrias pertencentes famlia Enterobacteriaceae como um todo, isto , as fermentadoras e no fermentadoras de lactose, pois nmeros falsos seriam obtidos ao se verificar apenas a presena de microrganismos fermentadores de lactose, quando a populao fosse constituda, na sua maioria, por microrganismos no fermentadores, incluindo-se aqui as salmonelas lactose-negativas ou outros fermentadores tardios desses acares. (Franco, 2003)

2.3- Enterococcus Essas bactrias, antes um subgrupo do gnero Streptococcus, a partir de 1984 passaram a pertencer ao gnero Enterococcus, com 19 espcies reconhecidas atualmente. Antes de 1984, os Estreptococcus fecais eram chamados genericamente de enterococos, e consistiam de duas espcies: Streptococcus faecalis e Streptococcus faecium. So atualmente denominados Enterococcus faecalis e Enterococcus faecium. (Franco, 2003). So relativamente resistentes ao calor e podem sobreviver as pasteurizaes do leite. (Doyle, Beuchat, & Montiville, 1997). Algumas restries quanto a utilizao dos Enterococcus como indicadores de contaminao fecal dos alimentos so feitas, uma delas seria de encontrarmos em outros ambientes alm do trato intestinal e apresentarem uma sobrevivncia maior em relao aos enteropatgenos encontrados no solo, nos vegetais e em alimentos, principalmente naqueles submetidos desidratao, ao de desinfetantes e a flutuaes de temperatura por serem mais resistentes. (Franco, 2003). Apesar das limitaes do uso desses microrganismos como indicadores de contaminao fecal, sua presena em nmeros elevados em alimentos indica prticas sanitrias inadequadas ou exposio do alimento a condies que permitiram a multiplicao de microrganismos indesejveis.(Franco, 2003). 3- Mtodos de Anlise Atualmente os mtodos de anlise so comumente divididos em mtodos convencionais e mtodos rpidos. (Franco, 2003). Os mtodos convencionais so chamados assim pois foram desenvolvidos h muitos anos e desde ento so utilizados como mtodos oficiais na maioria dos laboratrios brasileiros e tambm em outros pases. (Franco, 2003). Os mtodos rpidos surgiram a partir da dcada de 70, como conseqncia da necessidade de se abreviar o tempo necessrio para a obteno de resultados analticos e melhorar a produtividade laboratorial. Alm desses objetivos, esses mtodos visam tambm a simplificao do trabalho e a reduo de custos. Para alguns mtodos, a essas vantagens, aliam-se outras como maior sensibilidade e especificidade que os mtodos convencionais.(Franco, 2003). Os mtodos rpidos aprovados pelos rgos oficiais, podem ser utilizados somente para controle, sendo que resultados negativos so considerados como definitivos, mas resultados positivos considerados como presuntivos devem ser confirmados por mtodos padres. (Tese USP, 2002). No estudo dos mtodos de anlise microbiolgica de alimentos, a obteno correta das amostras, seu transporte para laboratrio e sua preparao para anlise so etapas fundamentais para o sucesso da anlise. D execuo correta dessas trs etapas depende a exatido dos resultados obtidos. (Franco, 2003). A 1 etapa a da amostragem onde no momento da obteno de uma amostra para anlise, todas as precaues devem ser tomadas para que a

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amostra obtida seja representativa do produto como um todo. Como regra geral, toda amostra deve ser analisada at 36 horas aps sua obteno. (Franco, 2003). A 2 etapa a preparao da Amostragem, onde Tcnicas corretas de preparao de uma amostra para anlise so indispensveis. Tcnicas asspticas devem ser utilizadas em todas as etapas. Uma vez que a distribuio dos microrganismos nos alimentos no uniforme, uma homogeneizao prvia de toda a amostra indispensvel. A escolha do diluente para homogeneizao depende do tipo de produto e dos microrganismos a serem pesquisados. (Franco, 2003). 3.1- Contagem de microrganismo psicrfilos e termfilos Essas contagens avaliam o grau de deteriorao de alimentos refrigerados ou daqueles submetidos a tratamento trmico. (Franco, 2003). 3.2- Contagem total de microrganismo mesfilos aerbios Est contagem detecta, em um alimento, o nmero de bactrias aerbias e/ou facultativa e mesfilas (35 - 37 C), presentes tanto sob a forma vegetativa quanto esporulada. (Tese USP, 2002). Segundo a ICMSF (International Commission on Microbiological Specifications for Foods) o nmero de microrganismo aerbios e mesfilos (contagem em placa) encontrado em um alimento tem sido um dos indicadores microbiolgicos da qualidade dos alimentos mais comumente utilizados, indicando se a limpeza, a desinfeco e o controle da temperatura durante o processo de tratamento industrial, transporte e armazenamento foram realizados de forma adequada. Esta determinao permite tambm obter informao referente a alterao incipiente dos alimentos, sua provvel vida til, e a falta de controle no descongelamento dos alimentos ou desvios na temperatura de refrigerao estabelecida. (Teses USP, 2002). Contagem de Bolores e Leveduras O crescimento de bolores e leveduras mais lento do que observado em bactria nos alimentos de baixa acidez e alta atividade de gua. Portanto dificilmente sero responsveis pela deteriorao desses alimentos. Em alimentos cidos e de baixa atividade de gua, no entanto, o crescimento de fungos maior, provocando deteriorao com grande prejuzo econmico em frutas frescas, vegetais e cereais. (Franco, 2003). 3.3- Contagem em placas O mtodo de contagem de microrganismos em placas um mtodo geral, que pode ser utilizado para contagem de grandes grupos microbianos, como aerbios, mesfilos, aerbios psicrfilos, termfilos, bolores e leveduras, variando o tipo de meio, a temperatura e o tempo de incubao. (Tese USP, 2002). Por este mtodo, amostras de alimentos so homogeneizada, diludas em sries, em diluente apropriado, plaqueadas com ou sobre um meio de gar apropriado e incubadas, aps o que todas as colnias visveis so contadas o procedimento se baseia na

premissa de que cada clula presente em uma amostra ir formar uma colnia separada e visvel, quando fixada com meio que lhe permita crescer. (Tese USP, 2002). 3.4- Tcnica do Nmero Mais Provvel A tcnica do Nmero Mais Provvel , tambm chamada de tcnica dos tubos mltiplos, outra maneira bastante utilizada pelos laboratrios de microbiologia de alimentos para estimar a contagem de alguns tipos de microrganismos, como coliformes fecais, coliformes totais, E.coli e Staphylococcus aureus.(Teses USP, 2002). Na tcnica do Nmero Mais Provvel, o produto a ser analisado, aps homogeneizao, submetido a pelo menos trs diluies decimais seriadas. De cada uma dessas diluies, alquotas iguais so transferidas para trs ou para cinco tubos contendo o meio de cultura escolhido e um tubo coletor de gs (tubo de Durhan). Todos os tubos so incubados, e em seguida, os positivos so identificados. Pelo nmero de tubos positivos em cada uma das diluies empregada determina-se o Nmero Mais Provvel por grama de produto, tendo como base a tabela estatstica de Hoskins para trs ou para cinco tubos. (Franco, 2003). O NMP estimado de respostas onde resultados so relatados como positivos e negativo em uma ou mais diluies decimais da amostra. Por esta tcnica pode-se obter informaes sobre a populao presuntiva de coliformes (teste presuntivo), sobre a populao real de coliformes (teste confirmativo) e sobre a populao de coliformes de origem fecal (coliformes fecais). (Teses USP, 2002). 4- Consideraes Finais A preocupao com a qualidade e segurana dos alimentos uma questo mundial de sade pblica, pelo fato de podermos ingerir algum tipo de alimento contaminado por microrganismos patognico. Essa preocupao se amenizou pela criao do HACCP que uma grande ferramenta no controle de qualidade dos alimentos produzidos em grande escala pelas industrias. O conhecimento dos microrganismos indicadores tornou-se uma ferramenta muito importante pelo fato de identificar fonte da contaminao. Os mtodos de anlise se comprovaram como uma ferramenta eficiente e rpida, pois com a velocidade de produo das indstrias estes mtodos so grandes aliados para o diagnstico de comprovao de um patgeno e quando dentro dos parmetros estabelecidos so aceitos pelos rgos oficiais e pela comunidade cientifica. 5- Agradecimentos A Deus, pois sem ele nada possvel. Aos meus pais grandes incentivadores desta minha longa caminhada acadmica. Aos professores pela dedicao e pacincia, aos meus amigos da faculdade com quem compartilho minhas experincias, dvidas

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e esperana nesta nova profisso que estou abraando. A minha orientadora professora Marilene Rodrigues e Silva exemplo de profissional dedicada, que me orientou brilhantemente neste trabalho. 6- Referncia Bibliogrfica CHAN, E.C.S.; KRIEG, N.R.; PELCZAR Jnior, M. J. Microbiologia: Conceitos e Aplicaes, segunda edio - So Paulo: Makron books, 1996. DOYLE, M. P.; BEUCHAT, L. R.; MONTVILLE, T. J. Food Microbiology: Fundamentals and Frontiers, 2 edio - Washington: Editora , 1997. EVANGELISTA, J. Tecnologia dos Alimentos, 2 edio So Paulo: Editora Atheneu, 2000. FRANCO, B. D. G. M. Microbiologia dos Alimentos, 2 edio So Paulo: Editora Atheneu, 2003. SILVA Junior, E. A. Manual de Controle higinico-sanitrio em alimentos, 1 edio So Paulo: Livraria Varela, 1995. SILVA, J. A. Tpicos da Tecnologia dos Alimentos, 2 edio So Paulo: Livraria Varela, 2000. SIQUEIRA, R. S. Manual de Microbiologia de Alimentos, 2 edio Rio de Janeiro: Embrapa CTAA, 1995. SILVA, M. C. Avaliao da qualidade microbiolgica de alimentos com a utilizao de metodologias convencionais e do sistema simplate. 2002. Tese (Mestre em Cincias) Escola Superior de Agricultura, Universidade de So Paulo, 2002, Piracicaba. Disponvel em http://www.teses.usp.br/. Acesso em: 02 maio 2005. www.anvisa.gov.br. Acesso em: 22 maro 2005. www.alimentos.senac.br. Acesso em: 22 maro 2005.

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