ENCAPSULAO E SECAGEM DE MICRORGANISMOS PROBITICOS Henrique Ortuo Moreno ; Cynthia Jurkiewicz Kunigk Aluno de Iniciao Cientfica da Escola de Engenharia

ia Mau (EEM/CEUN-IMT); Professora da Escola de Engenharia Mau (EEM/CEUN-IMT). Resumo. O presente trabalho teve o objetivo de avaliar o processo de encapsulao de microrganismos probiticos em alginato de clcio pela tcnica de asperso atravs da variao da vazo de ar e de vazo de soluo de alginato de sdio, bem como a sobrevivncia dos microrganismos aps a encapsulao e posterior liofilizao. Os resultados mostraram que o aumento da vazo de ar reduz o rendimento do processo e reduz o dimetro das cpsulas. O congelamento e a liofilizao reduziram a populao das bactrias probiticas encapsuladas. A sobrevivncia dos microrganismos probiticos foi maior nas cpsulas com maior dimetro mdio. Introduo O mercado dos produtos dito saudveis vem aumentando a cada ano, novos ingredientes e novos produtos esto sendo desenvolvidos pela indstria com apelo de reduzir problemas de sade e proporcionar uma vida mais saudvel (Moira, 2003). Por outro lado, os atuais consumidores procuram uma alimentao adequada, visando alimentos que associem sade ao bem-estar. Com o conhecimento dos benefcios causados por microrganismos probiticos, aumentou o interesse dos consumidores por produtos com essas caractersticas. O termo probitico se refere a microrganismos vivos, que administrados em quantidades adequadas, garantem benefcios sade do hospedeiro (FAO/ WHO, 2001). J os prebiticos so componentes alimentares no digerveis que afetam beneficamente o hospedeiro, por estimularem seletivamente a proliferao ou atividade de populaes de bactrias desejveis no clon (Mongensen et al, 2000). Produtos lcteos fermentados e no fermentados so considerados adequados para a sobrevivncia de microrganismos probiticos. Segundo vrios estudos os microrganismos devem permanecer viveis e em numero elevado (acima de 10 6 UFC/g) durante o processamento e armazenamento do alimento para que os efeitos benficos sejam obtidos (Anal e Sing, 2007). A legislao brasileira tem como requisito especfico a quantidade mnima vivel para os probiticos na faixa de 108 a 109 UFC na recomendao diria do produto, sendo que, para quantidades menores a aceitao depende da comprovao da eficincia do fabricante (ANVISA, 2008) A encapsulao de microrganismos probiticos tem sido utilizada para aumentar a sobrevivncia das bactrias no alimento e durante a passagem pelo trato digestivo. Entretanto importante que as caractersticas sensoriais do produto no sejam prejudicadas. Segundo Boscarioli (2010) a adio de microrganismos probiticos encapsulados em sorvete no foi perceptvel ao paladar, indicando que a encapsulao uma tecnologia vivel para o desenvolvimento de alimentos probiticos. A encapsulao de probiticos com alginato de clcio pode ser uma alternativa para o desenvolvimento de alimentos probiticos com baixa atividade de gua, como cereais, chocolate, queijos duros, manteiga e margarinas. Entretanto necessrio que as cpsulas sejam secas de forma a apresentarem uma umidade compatvel com o alimento no qual ser adicionada (Anal e Singh, 2007). A preservao de microrganismos por diferentes mtodos de secagem tem sido utilizada h dcadas. A liofilizao em particular o mtodo preferido para conservao de

microrganismos, entretanto o uso de spray drier e secadores de leito fluidizado tambm so empregados pela indstria (Morgan et al., 2006). Considerando a pequena diversidade de alimentos probiticos, o estudo da encapsulao e secagem so fundamentais para o desenvolvimento de novos alimentos probiticos com baixa atividade de gua. De forma a colaborar com o estudo sobre a encapsulao de microrganismos probiticos, este trabalho teve como objetivo avaliar o processo de encapsulao de microrganismos probiticos em alginato de clcio pela tcnica de asperso atravs da variao da vazo de ar e de vazo de soluo de alginato de sdio, bem como a sobrevivncia dos microrganismos aps a encapsulao e posterior liofilizao. Material e Mtodos Microrganismos probiticos As culturas liofilizadas utilizadas foram: Lactobacillus acidophilus NCFM FloraFIT com contagem celular de aproximadamente 1,5 x 1011 UFC/g de produto e Bifidobacterium lactis BI-04 FloraFIT com contagem celular de 4,5 x 10 11 UFC/g, ambos da empresa Danisco Brasil Ltda. As culturas foram mantidas -18C at o momento da utilizao. Produo das cpsulas de alginato de clcio A produo das cpsulas de alginato de clcio foi feita pela tcnica de asperso desenvolvida por Liserre, R e Franco (2007) e modificada por Boscarioli (2010). Uma soluo de alginato de sdio 1,0 % (Vetec) contendo 2,0% de goma accia (Colloides Naturels Brasil) foi aspergida em soluo de cloreto de clcio 0,1 M (Vetec). Para a asperso da soluo foi utilizado um tubo de ao inoxidvel (1,0 m de comprimento, dimetro interno de 12 mm e externo de 16,5 mm) com o bocal acoplado a um bico de equipamento spray drying com sado tipo leque (45, modelo 1/4J da Systens do Brasil). As cpsulas formadas foram deixadas em repouso na soluo de cloreto de clcio durante 30 minutos e ento retiradas da soluo por peneiras de ao inoxidvel (mesh de 250, 355, 500, 710 e 1000 m) e lavadas com gua destilada. Foram utilizadas trs vazes de ar (1,5 0,5; 3,0 0,5 e 4,5 0,5 m/min) e trs vazes da soluo de alginato de sdio (2,1 0,4; 3,93 0,04 e 5,93 0,09 mL/min). As cpsulas com microrganismos probiticos foram produzidas apenas com a vazo da soluo de alginato de sdio de 5,93 0,09 mL/min e vazo de ar de 1,5 0,5 e 3,0 0,5 m/min. Os microrganismos foram adicionados soluo de alginato de sdio na concentrao de 0,5% de Lactobacillus acidophilus e 1,0 % de Bifidobacterium lactis. As cpsulas contendo os microrganismos foram separadas apenas pela peneira de ao inoxidvel com mesh de 250 m, de forma a reter todas as cpsulas de maior dimetro. Liofilizao das cpsulas Parte das cpsulas que foram produzidas foi refrigerada a 4C e parte foi congelada (18C por 24 h) no mesmo dia da produo. Parte das cpsulas que foram congeladas durante 24 h foram analisadas e parte foi liofilizada. A liofilizao foi realizada em Liofilizador Enterprise I (Terroni Equipamentos Cientficos), onde as cpsulas eram colocadas congeladas (-18C). As cpsulas foram retiradas do liofilizador 24 h aps o incio do processo (vcuo: 0,200 0,300 Hg e temperatura do condensador de 37C)
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Determinao do dimetro mdio das cpsulas O dimetro das cpsulas produzidas com as trs vazes de ar e as trs vazes da soluo de alginato de sdio, sem a utilizao dos microrganismos probiticos, foi determinado em duplicata. As cpsulas foram separadas em peneiras de ao inoxidvel (mesh de 250, 355, 500, 710 e 1000 m) e lavadas com gua destilada. As cpsulas foram coradas com fucsina e observadas em microscpio biocular (CBA Olympus) com lente ocular micromtrica previamente calibrada. Foi determinado o dimetro de 20 cpsulas retidas em cada peneira. A massa de cpsulas retidas em cada peneira foi utilizada para clculo de uma mdia ponderada do dimetro. Anlises Microbiolgicas As anlises microbiolgicas para contagem de Lactobacillus acidophilus foram realizadas em duplicata, em meio de cultura MRS gar. As placas foram incubadas em estufa a 43C por 72 horas em jarras de anaerobiose, contendo gerador de anaerobiose Anaerogem (OXOID). As colnias tpicas de Lactobacillus acidophilus apresentaram dimetro de aproximadamente 3 mm, colorao branca, leitosa, achatadas e com borda irregular. Para contagem de Bifidobacterium lactis, as anlises tambm foram realizadas em duplicata, em meio de cultura MRS gar contendo solues A, B e C. A soluo A consiste em 0,01% de antibitico Dicloxacilina de sdio monohidratada, a soluo B consiste em cloreto de ltio a 10%, e a soluo C consiste em Cloridrato de L-cistena a 10%. Foram adicionados 0,5% da soluo A, 1,0% da soluo B e 0,5% da soluo C no meio de cultura. As trs solues foram adicionadas ao meio de cultura aps filtrao em membrana com dimetro de 0,20 m. As placas foram incubadas a 37C por 72 horas em jarras de anaerobiose, contendo gerador de anaerobiose Anaerogem (OXOID). As colnias de Bifidobacterium lactis apresentam dimetro entre 2 e 3 mm, colorao branca, leitosa e forma de lentilha (Oliveira, 2008). Anlise Estatstica Os resultados foram avaliados atravs de anlise de varincia (ANOVA) utilizando o Microsoft Office Excel. A comparao das mdias foi realizada atravs do teste de Duncan, considerando-se um nvel de significncia de 5%. Resultados e Discusso Rendimento do processo de encapsulao e dimetro das cpsulas A determinao do rendimento (gcpsulas/mLsoluo) foi realizada para as trs vazes de ar e trs vazes de soluo de alginato de sdio. Observa-se na Figura 1 uma reduo no rendimento com a reduo da vazo de ar. Para cada vazo da soluo de alginato foi possvel ajuste de uma equao linear que correlaciona o rendimento com a vazo de ar. As correlaes lineares e o coeficiente de correlao para as vazes de 5,93 0,09 mL/min; 3,93 0,04 mL/min e 2,1 0,4 mL/min esto apresentados nas equaes 1, 2 e 3, respectivamente, sendo x a vazo de ar (mL/min) e y o dimetro das cpsulas (m).

Figura 1 Rendimento (gcpsulas/mLsoluo) em determinadas vazes de ar e vazo da soluo de alginato de clcio y = -0,110x + 0,603 y = -0,109x + 0,622 y = -0,117x + 0,624 (r = 0,99) (r = 0,93) (r = 0,99) equao 1 equao 2 equao 3

O maior rendimento foi obtido com a menor vazo de ar (1,5 0,5 m/min), onde foram obtidas cpsulas de maior dimetro mdio, correspondente a (14 4).10 m. Por outro lado, a vazo da soluo de alginato de sdio no influenciou significativamente (p > 0,05)o rendimento do processo.

Figura 2 Dimetro (m) em determinadas vazes de ar e vazo da soluo de alginato de sdio

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O dimetro das cpsulas tambm no foi influenciado pela vazo da soluo de alginato de sdio (p>0,05), mas foi influenciado pela vazo de ar (p<0,05) sendo que, quanto maior a vazo de ar, menor o dimetro mdio das cpsulas (Figura 2). Nota-se tambm na figura 2 que o aumento da vazo de ar de 1,5 0,5 para 3,0 0,5 m/min, reduziu muito o dimetro mdio das cpsulas, uma variao entre 800 e 1000 m. J com o aumento da vazo de ar de 3,0 0,5 para 4,5 0,5 m/min a reduo no dimetro das cpsulas foi bem menor, correspondendo a uma variao entre 200 e 300 m. Portanto a relao obtida entre a vazo de ar e o dimetro das cpsulas no linear, diferentemente do observado para o rendimento do processo. Sobrevivncia dos microrganismos probiticos encapsulados As Tabelas 1 e 2 apresentam os valores das populaes de microrganismos probiticos encapsulados (log UFC/g), com diferentes dimetros de cpsula, submetidos ao processo de refrigerao, congelamento e secagem. Tabela 1 Populao de Bifidobacterium lactis (log UFC/g) nas cpsulas de alginato de clcio log UFC/g Dimetro (m) Dimetro (m) Cpsulas (4 1).10 m (14 4).10 m 9,3 0,4 9,6 0,2 Refrigeradas 8,7 0,1 8,7 0,1 Congeladas 8,6 1,4 7,3 0,5 Liofilizadas Tabela 2 Populao de Lactobacillus acidophilus (log UFC/g) nas cpsulas de alginato de clcio log UFC/g Dimetro (m) Dimetro (m) Cpsulas (4 1).10 m (14 4).10 m 9,1 0,4 9,1 0,4 Refrigeradas 8,8 0,2 8,6 0,1 Congeladas 81 8,3 0,2 Liofilizadas

Figura 3 Reduo da populao de Bifidobacterium lactis (log UFC/g) nas cpsulas de alginato de clcio

Figura 4 Reduo da populao de Lactobacillus acidophilus (log UFC/g) nas cpsulas de alginato de clcio As Figuras 3 e 4 apresentam a reduo da populao dos microrganismos probiticos nas cpsulas de alginato de clcio em relao s cpsulas refrigeradas, para cada dimetro mdio de cpsula. Nota-se que h reduo de ambos os microrganismos probiticos nas cpsulas congeladas e liofilizadas. A contagem de Bifidobacterium lactis e Lactobacillus acidophilus apresentou maior reduo da populao nas cpsulas de menor dimetro quando comparadas s cpsulas refrigeradas, sugerindo que as cpsulas de maior dimetro oferecem maior resistncia aos microrganismos. As cpsulas refrigeradas (dia seguinte aps a produo) apresentaram uma contagem de microrganismos maior que nas cpsulas congeladas e nas cpsulas liofilizadas, portanto, o congelamento e a liofilizao desses microrganismos so capazes de diminuir sua populao.
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Concluses No processo de encapsulao em alginato de clcio pela tcnica de asperso, as altas vazes de ar ocasionam a formao de cpsulas com menor dimetro mdio e menor rendimento na produo das mesmas. O congelamento e a liofilizao de bactrias probiticas encapsuladas em alginato de clcio diminuem a populao das mesmas. A encapsulao de microrganismos probiticos e secagem em liofilizador em conjunto so alternativas viveis para indstrias de alimentos produzirem alimentos secos com caracterstica probitica. Referncias Bibliogrficas Anal, A. K.; Singh, H. (2007) Recent advances in microencapsulation of probiotics for industrial applications and targeted delivery. Trends in Food Science and Technology, v. 18, p. 240-251. ANVISA. (2008) Alimentos com Alegaes de Propriedades Funcionais e ou de Sade, Novos Alimentos/Ingredientes, Substncias Bioativas e Probiticos Lista de alegaes de propriedade funcional aprovadas. Disponvel em http://www.anvisa.gov.br/alimentos/comissoes/tecno_lista_alega.htm. Acesso em 16.11. 2011. Boscarioli, M. P. M. (2010) Influncia de prebiticos na encapsulao de bactrias probiticas adicionadas em sorvete. Dissertao de Mestrado da Escola de Engenharia Mau do Centro Universitrio do Instituto Mau de Tecnologia. FAO/ WHO. (2011) Evaluation of health and nutritional properties of powder milk with live lactic acid bacteria. FAO/ WHO Expert Consulation, 34 p., Crdoba. Disponvel em www.fao.org/es/esn/food/prebioreport_en.pdf. Acesso em 28.01.2011. Liserre, A. M.; R, M. I.; Franco, B. D. G. M. (2007) Microencapsulation of Bifidobacterium animalis subsp. lactis in modified alginate-chitosan beads and evaluation of survival in simulated gastrointestinal conditions. Food Biotechnology, v. 21, n. 1, p. 1-16. Moira, H. (2003) Future for dairy products in the functional foods market. Australian Journal Dairy Technology, vol. 58, p. 98-103. Mongensen, G.; Rowland, I.; Micvedtt, T.; Fonden, R. (2000) Functional aspects of pro- and prebiotics: A literature review on immune modulation and influence on cancer. Microbial Ecology in Health and Disease, v. 12, n. 2, p. 40-44. Morgan, C. A.; Herman, N.; White, P. A.; Vese, G. (2006) Preservation of micro-organisms by drying; A review. Journal of Microbiological Methods, v. 66, p. 183-193. Oliveira, L. B. (2008) Efeito de goma accia e inulina na viabilidade de bactrias probiticas e nas caractersticas fsico-qumicas de leite fermentado simbitico. Dissertao de Mestrado da Escola de Engenharia Mau do Centro Universitrio do Instituto Mau de Tecnologia.