Penelitian Reseptor c-Met tirosin kinase inhibitor MP470 radiosensitizes sel glioblastoma James W Welsh * 1, Daruka Mahadevan2, Ron

Ellsworth2, Laurence Cooke3, David Bearss4 dan Baldassarre Stea5 Alamat: 1Departmentr Radiasi Onkologi, University of Texas MD Anderson Cancer Center, 1515 Holcombe Blvd, Houston, TX, USA,. 2Department Kedokteran, Universitas Arizona Cancer Center, 1515 Campbell Utara Avenue, Tucson, AZ 85724-5024, Amerika Serikat, 3University dari Arizona College of Medicine, 1501 Campbell Utara Avenue, Tucson, AZ 85724-5024, USA, Inc 4SuperGen, 4140 Dublin Boulevard, Dublin, CA 94568-7757, Amerika Serikat dan 5Department Radiasi Onkologi, University of Arizona Cancer Center, 1515 Campbell Utara Avenue, Tucson, AZ 85724-5024, Amerika Serikat Email: James W Welsh * - jwelsh@mdanderson.org; Daruka Mahadevan DMahadevan@azcc.arizona.edu; Ron Ellsworth - rellswo@email.arizona.edu; Laurence Cooke - lcooke@azcc.arizona.edu, David Bearss - david.bearss @ supergen.com; Baldassarre Stea - bstea@azcc.arizona.edu * Sesuai penulis Abstrak Tujuan: glioblastoma multiforme (GBM) adalah resisten terhadap terapi sitotoksik saat ini, sebagian karena perbaikan DNA ditingkatkan. Aktivasi reseptor tirosin kinase c-Met telah terbukti untuk melindungi sel-sel kanker dari kerusakan DNA. Kami berhipotesis bahwa menghambat cMet akan menurun ini perlindungan dan dengan demikian peka sel-sel tumor resisten terhadap efek dari terapi radiasi. Bahan dan metode: Delapan baris GBM sel manusia disaring untuk radiosensitivity ke kecil-molekul inhibitor c-Met MP470 dengan koloni-hitungan tes. Untai ganda (ds) DNA rusak (karena sinar radiasi) dihitung dengan menggunakan antibodi untuk gamma H2AX. Western blotting menunjukkan ekspresi RAD51, glikogen sintase kinase (GSK)-3, dan protein lainnya. Sebuah sisi tumor Tikus xenograft Model ini digunakan untuk dalam studi radiosensitization in vivo. Hasil: MP470 mengurangi c-Met fosforilasi dan ditingkatkan radiasi membunuh sel sebesar 0,4 log di SF767 sel. Sel pretreated dengan MP470 memiliki lebih ds kerusakan DNA dari sel diperlakukan dengan radiasi saja. Mekanis, MP470 ditunjukkan untuk menghambat perbaikan rusak dsDNA dan meningkatkan apoptosis. MP470 pengaruh berbagai kelangsungan hidup dan protein perbaikan DNA terkait seperti pAKT, RAD51 dan GSK3. In vivo, penambahan MP470 radiasi menghasilkan tumor-keterlambatan pertumbuhanpeningkatan rasio lebih dari 2,9 radiasi saja dan waktu kelangsungan hidup diperpanjang.

Kesimpulan: GBM adalah sebuah situs penyakit dimana radiasi sering digunakan untuk mengatasi kedua makroskopik dan penyakit mikroskopis. Meskipun upaya hasil eskalasi dosis tetap miskin. MP470, sebuah ampuh molekul kecil tyrosine kinase inhibitor c-Met, beberapa baris sel GBM radiosensitized baik in vitro dan in vivo, dan dapat membantu meningkatkan hasil bagi pasien dengan GBM.
Pengantar Pengelolaan glioma ganas terus menimbulkan tantangan terapeutik sulit. Penggunaan terapi radiasi dan kemoterapi setelah tumor debulking maksimal dapat meningkatkan baik kontrol lokal dan kelangsungan hidup untuk beberapa pasien dengan glioma ganas [1]. Sayangnya, meskipun adju-vant terapi hampir semua pasien dengan glioblastoma multi forme (GBM) akhirnya akan mengembangkan kembali tumor dan mati dari penyakit. Pola-kegagalan studi con-menyalurkan setelah terapi utama untuk GBM telah menunjukkan bahwa 75% -90% dari pasien mengalami kekambuhan tumor dalam 2 cm dari margin reseksi [2]. Upaya untuk meningkatkan dosis radiasi lokal tidak menyebabkan setiap bermakna peningkatan dalam kelangsungan hidup saat diuji dalam percobaan acak [3]. Penyebab yang paling mungkin kambuh diyakini intrinsik radioresistance, dimediasi sebagian oleh yang efisien Perbaikan DNA. Hal ini menunjukkan bahwa intervensi yang bertujuan memodifikasi resistensi seluler radiasi atau chemother-APY dapat memberikan manfaat kelangsungan hidup. Faktor pertumbuhan hepatosit (HGF) adalah protein het-erodimeric multifungsi biasanya diproduksi oleh mesenchymal sel. Kegiatan pleiotropic Its dimediasi melalui cel-lular reseptor, suatu tirosin kinase transmembran dikodekan oleh proto-onkogen c-Met. Dalam sel-sel ganas, HGF telah telah ditunjukkan untuk melindungi sel dari kematian yang disebabkan oleh variabel-Ety merusak DNAagen, termasuk radiasi dan inhibitor topoisomerase [4]. Menariknya HGF / SF tidak hanya diblokir DNA kerusakan-induksi apoptosis tetapi juga meningkatkan laju perbaikan istirahat untai DNA [5]. HGF juga berfungsi sebagai faktor pertumbuhan autokrin atau parakrin dan mengaktifkan sebuah program disosiasi sel dan motilitas ditambah dengan peningkatan produksi protease yang telah ditunjukkan untuk mempromosikan invasi selular [6,7]. HGF dan c-Met adalah co-disajikan dan sering diekspresikan dalam spektrum yang luas dari spesifikasi-tumor padat manusia termasuk paru-paru, payudara, dan keganasan otak [7,8]. Oleh karena itu, overekspresi c-Met oleh sel-sel GBM menunjukkan bahwa memblokir HGF atau yang reseptor c-Met mungkin merupakan strategi yang menarik ketika dikombinasikan com dengan

pengobatan konvensional untuk pengobatan GBM. Sebuah tinjauan baru-baru ini menunjukkan bahwa pendekatan ini inhibitor baru sev-eral dari aktivitas tyrosine kinase dari c-Met telah dikembangkan dan diuji sebagai agen tunggal atau dalam kombinasi dengan kemoterapi sitotoksik [9]. Meskipun sebelumnya telah menunjukkan bahwa penargetan HGF atau c-Met ekspresi menggunakan radiosensitizers ribozim dalam sel GBM in vitro dan in vivo tumor xenograft [10], demonstrasi inhibitor klinis yang berguna dari kinase tirosin activ-dasarkan c-Met dikombinasikan dengan radiasi belum previ-menerus diuji dalam model GBM. Dalam karya yang disajikan di sini, inhibitor novel c-Met tirosin kinase, MP470 [11], diuji kemampuannya untuk radiosensitize sel GBM baik in vitro dan in vivo. Bahan dan metode Kultur sel Semua garis sel GBM manusia diuji (SF763, SF268, SF295, SF126, SF188, SF767, U-87, dan SF210) yang diperoleh dari University of California, San Francisco, dan dipelihara dalam Dulbecco yang Dimodifikasi Elang Menengah dilengkapi dengan serum janin anak sapi 10% dan 1% penicillin-lin-streptomisin [12]. Sel diinkubasi pada suhu 37 C dalam 5% CO2 inkubator. MP470 (Supergen, Dublin, CA) adalah disimpan dalam gelap pada 4 C sampai digunakan, ketika dilarutkan di sulfoxide dimetil dan digunakan pada konsentrasi akhir 5,0-10 uM. Obat itu ditambahkan ke sel 1 jam sebelum irra-diation kecuali dinyatakan lain. Kontrol sel diperlakukan dengan volume yang sama dimetilsulfoksida. Sebuah teleterapi cobalt-60 unit (Energi Atom Kanada Lim-ited Theratron-80) digunakan untuk menyinari sel-sel GBM di tingkat dosis 2 Gy / menit. Proliferasi sel uji Cytotoxicity dari MP470 dinilai secara in vitro di semua delapan baris sel dengan menggunakan uji MTS dilakukan dalam 96-baik Format piring. Sel dilapisi dengan multichannel pipet-ter dan MP470 (hingga konsentrasi akhir dari 5 M) adalah ditambahkan ke sumur rangkap tiga 24-48 jam kemudian, setelah itu piring diinkubasi sampai 4 hari. Pengujian MTS adalah dilakukan dengan 96 CellTiter your berair non-radioaktif Proliferasi Assay kit sesuai dengan memproduksi direkomendasikan-mendations (Cat # G5421, Promega, Madison, WI). Para IC50 (konsentrasi yang menghambat proliferasi di 50% dari sampel) ditentukan dari standar kurva. Uji in vitro clonogenic

Delapan jalur GBM sel manusia dikultur sebagai dijelaskan di atas, dipanen, dihitung, dan unggulan ke 60-mm cawan petri pada kepadatan sel tertentu. MP470 (5 M) ditambahkan 1 jam sebelum sel-sel diiradiasi dengan dosis dosa-gle berkisar 2-8 Gy, setelah sel-sel kembali ke 37 C inkubator dan dibudidayakan selama 14 hari di kehadiran MP470 sebelum fiksasi. Sel-sel yang larutan asam asetat: tetap selama 5 menit dengan metanol 03:01 dan bernoda selama 5 menit dengan kristal violet 0,5% (Sigma, St Louis, MO) dalam metanol. Koloni dihitung dengan koloni kontra Colcount otomatis (Optronix, Milton Port, Oxford, Inggris) dengan menggunakan modus koloni diskrit. Para fraksi yang masih hidup dihitung sebagai (rata-rata koloni jumlah) / (sel berlapis) (efisiensi plating), dimana pelapisan Efisiensi didefinisikan sebagai (rata-rata jumlah koloni) / (sel berlapis untuk kontrol tidak disinari). Semua eksperimen dilakukan dalam rangkap dua dalam 3 percobaan independen dan berusia rata-titik data mewakili berarti standar deviasi-pertanyaan (SD). Radiasi Onkologi 2009, 4:69 http://www.ro-journal.com/content/4/1/69 Halaman 3 dari 10 (Nomor halaman bukan untuk tujuan kutipan) Apoptosis uji Dekat-anak sungai SF767 sel pra-perawatan dengan 5 uM MP470 diiradiasi (8 Gy), dan dianalisis 4 jam kemudian sebagai berikut. Singkatnya, setelah perlakuan awal dengan MP470 selama 5 jam, sel disuspensikan dalam phosphate-buffered saline (PBS, dibuat dengan melarutkan 8 g NaCl, 0,2 g KCl, 1,44 g Na2HPO4, dan 0,24 g KH2PO4 dalam 800 mL H2O) (pH 7.2) yang mengandung akridin oranye (1 mg mL-1) dan RNAse A dan kemudian bersama-diwarnai dengan 1 mg mL-1 etidium bromida (Semua reagen dari Sigma), sel kemudian dicuci dan diperiksa di bawah mikroskop fluoresensi ( 150, OLYM-nanah, Pusat Valley, PA; menarik menyaring BG12, penghalang saringan 0-5,30). Untuk analisis kuantitatif, 200 sel dihitung dan persentase sel nekrotik dan apoptosis dihitung berdasarkan lated. -H2AX uji Beruntai ganda (ds) istirahat DNA menyebabkan pembentukan dari -H2AX, sebuah kompleks histon yang unik. Kami menggunakan -H2AX antibodi (Upstate Cat # 05-636, Millipore, Billerica, MA) untuk memvisualisasikan istirahat dsDNA sebagai berikut. Sel berlapis di slide ruang, tumbuh selama 48 jam, dan diperlakukan dengan 5 uM MP470, satu jam kemudian, sel-sel diiradiasi dengan 4 Gy dan diproses baik 1 jam atau 8 jam kemudian. Sel pertama tetap di paraformaldehyde 4% dan diinkubasi

dengan antibodi primer terhadap -H2AX. Utama antibodi kemudian dicuci off, dan antibodi sekunder konjugasi fluorescein isothiocyanate (FITC) adalah ditambahkan ke slide. Kerusakan DNA divisualisasikan dengan menggunakan confocal mikroskop. Intensitas rata-rata setiap sel dihitung menggunakan Photoshop dan uji t 2 sisi digunakan untuk menghitung perbedaan. Comet assay istirahat dsDNA divisualisasikan dengan menggunakan sebuah komet netral uji (Cat # 4250-050-K, Trevigen, Gaithersburg, MD). Sel yang disebar pada 10-cm Pelat your Budaya Falcon BD (BD, Franklin Lakes, NJ), diinkubasi selama 2 hari, diperlakukan dengan 10 uM MP470 atau dimetilsulfoksida (kontrol) untuk 1 jam, dan kemudian diiradiasi dengan 8 Gy. Sel kemudian trypsinized, ditempatkan pada slide kaca, dan mengalami elec-trophoresis sesuai dengan instruksi produsen. dsDNA istirahat diukur dengan gerakan ekor zaitun, (OTM), didefinisikan sebagai (panjang ekor) (fraksi dari total DNA dalam ekor) [13]. OTM nilai dihitung dengan TriTek Komet Skor V 1,5 perangkat lunak (The TriTek Corpora-tion, Sumerduck, VA). Titik data mewakili berarti SD dari percobaan rangkap tiga. Western blotting Sel yang disebar pada 10-cm piring petri dan tumbuh selama 24-48 jam. MP470 kemudian ditambahkan pada konsentrasi 10 uM (dalam 100 dimethlysulfoxide%) untuk maksimum inhibi-tion. Sel diinkubasi dengan MP470 selama 24 jam (Kecuali ditentukan) sebelum diiradiasi dengan 4 Gy. Setelah iradiasi, sel-sel yang segaris pada pelat oleh add-ing 350 uL buffer lisis dodesil natrium sulfat (20 mM HEPES [pH 7,9], 400 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1% NP40, 1 mM DTT, 1 mM phenylmethylsulfo-nyl fluorida, 1 mg / mL aprotinin, 1 mg / mL leupeptin, 250 mg / mL benzamide, 50 mM NaF, dan 1 mM NaO3V4). Para lisat dipindahkan ke tabung microcentrifuge 1,5 mL, direbus selama 5 menit dengan vortexing intermiten, dan kemudian disentrifugasi selama 5 menit pada 10.000 rpm, setelah itu supernatan dipindahkan ke microcentrifuge baru tabung. Lisat menjadi sasaran elektroforesis pada 10% -20% HCl pra-menuangkan gel (Cat # 161-1108, Bio-Rad, nya-Cules, CA). Protein yang kemudian dipindahkan ke nitrocel-lulose kertas dan diselidiki dengan antibodi yang sesuai di bawah kondisi yang direkomendasikan oleh para pemasok. Para

antibodi berikut digunakan phospho-Akt (473 Ser Cat, # 4058), glikogen sintase kinase (GSK)-3 dengan Phospho-GSK-3 (Ser9, # 9336) your Signaling Technol-ogy, Danvers, MA), RAD51 H-92 (Santa Cruz Biotechnol-ogy, Santa Cruz, CA) dan c-Met phosphospecific Anti-c-Met [pY1003 ] (your Signaling Teknologi) [14]. siRNA percobaan siRNA ke c-Met (sc-29397) dan kontrol siRNA (sc-37007) yang dibeli dari Bioteknologi Santa Cruz. Para transfeksi reagen Lipofectamine berasal dari Invitrogen (Carlsbad, CA). U87 sel tumbuh 70% pertemuan dan transfected dengan siRNA pada konsentrasi akhir 100 nM. Tujuh puluh dua jam kemudian, sel-sel segaris barat-Ern untuk analisis blotting seperti dijelaskan di atas. Hewan percobaan Untuk membuat tumor subkutan, sel-sel (4 106 per hewan) ditanamkan di sisi-sisi 32 outbred telanjang athymic tikus, 8 per lengan (Taconic, Germantown, NY). U87 sel dipilih untuk tingkat tinggi dari c-Met ekspresi dan kemampuan untuk cepat menghasilkan tumor. Dua puluh lima hari setelah sel-sel disuntikkan, hewan-hewan itu pasangan-cocok (berdasarkan pada volume tumor) dan ditugaskan ke salah satu dari empat perlakuan kelompok: kontrol; MP470 (60 mg / kg) saja; radiasi saja (2 Gy per hari x 10 hari), dan MP470 + radiasi. MP470 disampaikan setiap hari oleh gavage dengan dosis 60 mg / kg pada minyak kacang mulai hari berturut-turut 25 untuk 14 hari. Radiasi dimulai pada hari 27 dan terdiri dari 2 Gy per hari dikirim ke tumor dengan irradiator kobalt-60 (Theratron-80). Radiasi itu disampaikan sehari, 5 hari per minggu untuk 2 minggu, pada 1 jam setelah pengobatan MP470. Total dosis kumulatif dikirim ke tumor dengan demikian 20 Gy. Hewan eutanasia oleh sesak napas CO2 ketika volume tumor mencapai 2.000 mm3, seperti yang dipersyaratkan oleh kami hewan kelembagaan komite perawatan dan menggunakan protokol # 07-029. Semua hewan sisanya eutanasia pada hari 48. Tumor diukur dengan kaliper setiap 5 hari dan Radiasi Onkologi 2009, 4:69 http://www.ro-journal.com/content/4/1/69 Halaman 4 dari 10 (Nomor halaman bukan untuk tujuan kutipan) volume dihitung menurut rumus (a2 - b / 2), di mana a adalah diameter terkecil dan b adalah yang terbesar diam-eter dari tumor. Keterlambatan pertumbuhan tumor dinyatakan dalam mutlak dan tidak-malized istilah sebagai berikut.

Pertumbuhan mutlak penundaan (AGD) didefinisikan sebagai jumlah hari untuk tumor di radhiyallahu-asi-satunya dan MP470 + kelompok radiasi untuk mencapai 1.500 mm3 dikurangi jumlah hari untuk tumor di kelompok kontrol untuk mencapai ukuran yang sama. Normalisasi pertumbuhan penundaan (NGD) dihitung sebagai jumlah hari untuk tumor pada kelompok-terapi kombinasi untuk mencapai 1.500 mm3 dikurangi jumlah hari untuk tumor pada kelompok MP470-satunya untuk mencapai 1.500 mm3. Faktor peningkatan kemudian ditentukan dengan membagi NGD untuk kelompok menerima MP470 radiasi ditambah oleh AGD untuk kelompok diberikan radiasi saja. Semua analisis statistik dilakukan dengan Stata 9.2 untuk Windows (College Station, TX), dan Nilai P <0,05 dianggap signifikan. Hasil Sitotoksisitas dan radiosensitization Molekul kecil tyrosine kinase inhibitor MP470 adalah dirancang untuk menargetkan c-Met, meskipun juga menghambat c-Kit reseptor dan platelet-derived reseptor faktor pertumbuhan di tingkat nanomolar [11]. Untuk mengevaluasi efeknya pada garis-tion prolifera GBM delapan sel yang digunakan dalam assay MTS. Semua delapan baris sel terbukti menjadi sensitif terhadap MP470 sendiri, dengan IC50 nilai mulai dari 1 pM sampai 10 pM (rata-rata 5 uM). Untuk menguji potensinya sebagai radiosensitizer, kita dinilai clonogenic bertahan hidup setelah 4 Gy sel delapan GBM yang sama baris setelah pengobatan 1-jam dengan MP470 diikuti oleh radiasi dosis tunggal (Gambar 1). Berbagai tingkat respon terlihat di garis sel yang berbeda, dengan 3 dari GBM 8 garis muncul untuk memiliki respon aditif lebih besar maka ketika MP470 dikombinasikan dengan XRT. SF767 sel memilih untuk menilai untuk kelangsungan hidup clonogenic dalam menanggapi meningkatkan dosis radiasi (0 sampai 8 Gy) dan MP470 telah efek radiosensitizing pada semua dosis radiasi yang diuji, MP470 sel meningkat membunuh dengan 0,5 log dibandingkan dengan 4 Gy saja (Gambar 2). MP470 GSK3 menghambat dan menginduksi apoptosis Setelah menetapkan kemampuan MP470 untuk menyadarkan GBM sel terhadap radiasi, kami selanjutnya ingin memvalidasi bahwa itu bertindak melalui c-Met. SF767 sel menunjukkan prs-ence dari pMet dan pengobatan dengan MP470 berkurang c-Met fosforilasi (Gambar 3A), sebagaimana dinilai oleh imunoblot-ting analisis. Dalam rangka untuk

mengkonfirmasi mekanisme MP470 dari tindakan yang kita dievaluasi jalur hilir dikenal c-Met, phosphatidylinositol 3-kinase/Akt, di SF767 sel [15]. Sebuah inkubasi 1-jam dengan MP470 menyebabkan pengurangan protein pAkt di SF767 sel (Gambar 3B). Untuk menentukan Efek dari pengurangan pAkt pada kelangsungan hidup sel, kita dievaluasi apoptosis dan nekrosis yang diinduksi oleh radiasi (8 Gy), sendiri atau setelah pretreatment 1-jam dengan MP470, menggunakan sebuah akridin oranye assay. MP470 saja tidak berpengaruh pada kematian sel, dan radiasi saja memicu peningkatan ringan kematian sel (ini berlawanan dengan persen kematian dilihat dalam uji clonogenic, karena mayoritas radiasi kematian sel yang diinduksi adalah dari pembelahan mitosis dan tidak APOP-totic). Kombinasi MP470 diikuti dengan radiasi (8 Gy), bagaimanapun, membunuh 75% dari sel-sel (Gambar 4A). Kami selanjutnya mendalilkan bahwa GSK3, regulator kunci dari ekstrinsik jalur apoptosis [16], dapat memainkan peran dalam hal ini tion Induc-apoptosis, seperti yang sangat diatur oleh Akt. Kami menemukan bahwa perlakuan awal dengan MP470 menghasilkan peningkatan fosforilasi serin GSK3 di-9 (Gambar 4B), situs diketahui menghambat GSK3 *16+. Pengaruh MP470 pada perbaikan istirahat dsDNA Untuk menguji hipotesis bahwa meningkatkan MP470 radiasi akibat kematian sel dengan mempengaruhi perbaikan dsDNA istirahat, kami mengukur kadar -H2AX. Pada 1 jam setelah irra-diation, baik sel-sel kontrol dan MP470diobati sel menunjukkan jumlah yang sebanding -H2AX fokus, menunjukkan bahwa MP470 tidak meningkatkan tingkat awal radiasi diinduksi dsDNA istirahat. Dalam rangka untuk mendeteksi pengaruh MP470 pada perbaikan, kita dihitung tingkat -H2AX fokus beberapa jam setelah iradiasi. Pada 8 jam setelah iradiasi, sel diperlakukan dengan XRT memiliki intensitas rata-rata densitometri-sity dari 71 dibandingkan dengan 127 untuk sel diperlakukan dengan MP470 dan XRT p = 0,04. (Gambar 5). Untuk lebih mengevaluasi itu MP470 mempengaruhi perbaikan dsDNA, kami dilengkapi kami -H2AX hasil dengan alat tes komet. Pada 1 jam setelah iradiasi, SF767 sel diperlakukan dengan baik radiasi saja (8 Gy) atau dengan 10 uM MP470 diikuti oleh iradiasi menunjukkan Simi-Lar tingkat kerusakan DNA, dosis tinggi MP470 dan radiasi yang digunakan di sini karena sensitivitas rendah dari uji komet. Namun, pada 8 jam setelah iradiasi, dsDNA perbaikan itu sangat menghambat dalam sel yang telah pra-diobati dengan 22 3,1 MP470 ekor DNA (%), untuk 8-Gy irra-diation sendiri dan 35 4,3 ekor DNA (%), untuk MP470

diikuti oleh 8-Gy iradiasi). Kenaikan OTM nyarankan-gests bahwa efek radiosensitizing MP470 yang mungkin sebagian dimediasi melalui penghambatan perbaikan dsDNA. RAD51 adalah tombol pengatur rekombinasi homolog perbaikan [17,18] dan pekerjaan sebelumnya kami telah menunjukkan bahwa RAD51 tingkat pada saat reseksi bedah adalah independen prognosticator bertahan hidup pada pasien GBM [19], sehingga kita dievaluasi apakah MP470 dapat mempengaruhi RAD51. RAD51 ekspresi tercatat akan meningkat (24 jam) setelah sel diiradiasi. Pretreatment dengan MP470 menurun RAD51 ekspresi dalam sel nonirradiated dan ditekan peningkatan ekspresi diminta oleh radiasi (Gambar 6A). Efek ini tergantung dosis, dengan terkuat penekanan pada MP470 konsentrasi melebihi 5 pM. Untuk memverifikasi bahwa memang MP470 RAD51 penurunan ekspresi-Sion dan tidak hanya bergeser sel ke dalam sel diam siklus negara (G0) dicirikan oleh tingkat yang lebih rendah dari RAD51, kami menguji efek MP470 pada distribusi siklus sel dan menemukan hal tidak memiliki pengaruh. Untuk membuktikan bahwa RAD51 penindasan secara langsung dikaitkan dengan c-Met inhibisi, kita membungkam ekspresi c-Met menggunakan siRNA, yang juga menunjukkan penghambatan RAD51 (Gambar 6B). Dalam studi in vivo radiosensitization Untuk memvalidasi hasil in vitro, kami implan sel GBM subkutan di sisi-sisi tikus telanjang dan diperlakukan Kelangsungan Clonogenic dari SF767 sel diperlakukan dengan MP470 diikuti dengan iradiasi dalam berbagai dosesFigure radiasi 2 Clonogenic SF767 kelangsungan hidup sel diperlakukan dengan MP470 diikuti oleh iradiasi dalam berbagai radiasi dosis. Radiasi pada semua dosis memiliki penekan moderat efek pada kelangsungan hidup clonogenic, dan efek yang ditingkatkan oleh pretreatment dengan MP470. Setiap titik data mewakili rata-rata SD 3 percobaan. Radiasi Onkologi 2009, 4:69 http://www.ro-journal.com/content/4/1/69 Halaman 6 dari 10 (Nomor halaman bukan untuk tujuan kutipan) mereka tikus dengan MP470, iradiasi, atau keduanya, dengan 8 ani-mals per kelompok. Pengobatan dimulai pada hari 25 dengan MP470 yang diberikan setiap hari selama 14 hari berturut-turut, XRT adalah dimulai pada hari 27 menggunakan total 20 Gy dalam 10 fraksi-kondisi sehari-hari, untuk tumor saja. Pada hari 48 setelah implantasi percobaan itu dihentikan dan tumor itu

diukur. Seperti ditunjukkan dalam Gambar. 7A, MP470 meningkatkan AGD dari 6,1 2,3 hari dengan radiasi saja menjadi 17,7 2,8 hari dengan kombinasi, mengakibatkan peningkatan rasio 2,9 (Tabel 1). Tingkat kelangsungan hidup dievaluasi pada akhir hari percobaan. Pada saat itu, tingkat kelangsungan hidup adalah 0% pada kelompok kontrol atau kendaraan-MP470-satunya, 50% di radiasi-hanya kelompok (P = 0,035), dan 87,5% di MP470-ditambah-radiasi kelompok (P = 0,001) (Gambar 7B). Diskusi Molekul kecil MP470 merupakan antagonis c-Met ampuh yang sitotoksik untuk berbagai jalur sel in vitro [11]. Dalam hal ini laporan, kami menunjukkan bahwa penghambatan bersamaan c-Met dalam kombinasi dengan iradiasi menyebabkan kedua dikurangi Western blot analisis SF767 jalur sel dalam menanggapi MP470Figure 3 Western blot analisis SF767 jalur sel dalam menanggapi MP470. (A) Mengobati SF767 sel dengan MP470 (10 M) selama 1 jam diikuti oleh rangsangan dengan pervanadate menyebabkan fosforilasi mengurangi c-Met [pY1003] dengan cara yang tergantung dosis, dibandingkan untuk kontrol DMSO. (B) SF767 sel diperlakukan dengan MP470 (10 M) selama 1 jam dikurangi menunjukkan ekspresi protein pAkt. (A) Apoptosis dan nekrosis, dihitung menggunakan assay akridin oranye, di SF767 sel setelah pengobatan dengan radiasi,, MP470 atau keduanya. MP470 (5 M) saja tidak berpengaruh pada proporsi cellsFigure mati 4 (A) Apoptosis dan nekrosis, dihitung menggunakan assay akridin oranye, di SF767 sel setelah pengobatan dengan radhiyallahu-asi,, MP470 atau keduanya. MP470 (5 M) saja tidak berpengaruh pada proporsi sel-sel mati. Radiasi (8 Gy) dengan sendirinya induksi kematian sel nekrotik beberapa tetapi sedikit apoptosis. Namun demikian, kombinasi dari MP470 diikuti dengan radiasi sangat meningkatkan proporsi kedua sel nekrotik dan apoptosis. Dilakukan dalam rangkap tiga: bar menunjukkan nilai mean SD. (B) Barat noda analisis SF767 sel diobati dengan radiasi (4 Gy) saja tidak memiliki pengaruh terhadap ekspresi glikogen sintase kinase (GSK) 3 terfosforilasi di serin 9, namun, pengobatan dengan MP470 (10 M) atau MP470 selama 24 jam diikuti dengan radiasi meningkatkan ekspresi protein ini terfosforilasi.

dsDNA perbaikan dan apoptosis ditingkatkan dalam GBM. Kami di Temuan vitro didukung oleh pengamatan kami di vivo menggunakan model xenograft pada tikus telanjang. Dalam model ini, MP470 dengan sendirinya, pada dosis 60 mg / kg, itu tidak berpengaruh pada ukuran tumor atau kelangsungan hidup; radiasi dengan sendirinya agak lebih efektif dalam mengurangi volume tumor dan meningkatkan kelangsungan hidup, tetapi kombinasi radiasi ditambah MP470 menghasilkan respon terbaik baik dari segi kontrol lokal

dan kelangsungan hidup. Bermutu tinggi neoplasma glia otak terus salah satu keganasan yang paling menantang untuk mengobati, dan prognosis buruk mereka telah membaik hanya sedikit lebih dari empat dekade terakhir (tingkat ketahanan hidup sebesar 10% -20% pada 2 tahun) [20]. Radiasi pasca operasi memberikan keuntungan sur-vival jelas untuk pasien dengan glioma, namun mayoritas kekambuhan penyakit ini dalam waktu 2 cm dari pascabedah-erative tidur-tempat yang sangat ditargetkan oleh radiasi. Unfor-tunately, upaya untuk meningkat dosis pengobatan ke tidur tumor telah disediakan hanya menguntungkan sederhana [21]. Untuk lebih memahami mengapa membutuhkan mengevaluasi selular dan interaksi molekul dalam sel-sel tumor resisten. Para jalur untuk keganasan terdiri dari beberapa mutasi genetik tions, sering di regulator kunci dari siklus sel atau DNA perbaikan proses. Perubahan ini memungkinkan sel-sel kanker untuk tidak hanya membagi dicentang, tetapi juga untuk memperbaiki kerusakan DNA pada Photomicrographs dari -H2AX fokus terdeteksi dalam iradiasi SF767 cellsFigure 5 Photomicrographs dari -H2AX fokus terdeteksi pada sel iradiasi SF767. Sel diiradiasi dengan 4 Gy, tetap 8 jam kemudian, dan kemudian diwarnai dengan anti--H2AX antibodi. Asli pembesaran 1.000 (nilai menunjukkan intensitas rata-rata, berdasarkan densitometri). (A) -H2AX fokus di SF767 sel diperlakukan dengan radiasi saja. (B) Pretreatment dengan 5, pM MP470 sebelum Radia-tion menyebabkan peningkatan -H2AX fokus. (C) Radiasi ditambah MP470 menghasilkan intensitas -H2AX fokus median dari 127 dibandingkan dengan 71 untuk radiasi saja p = 0,04. Radiasi Onkologi 2009, 4:69 http://www.ro-journal.com/content/4/1/69 Halaman 8 dari 10 (Nomor halaman bukan untuk tujuan kutipan) tingkat dipercepat atau lebih efisien. Salah satu gen terlibat dalam rekombinasi homolog perbaikan kerusakan dsDNA adalah RAD51. Sebelum bekerja dari laboratorium kami telah menunjukkan bahwa tingkat ekspresi RAD51 pada saat reseksi bedah awal adalah independen prognostica-tor bertahan hidup bagi pasien GBM menerima radiasi [19]. Dalam tulisan ini, kami mengevaluasi apakah MP470 bisa pengaruh RAD51 ekspresi dalam sel tumor GBM dan menemukan bahwa perlakuan awal dengan MP470 terhambat XRT diinduksi ekspresi RAD51. Ini pujian kami sebelum temuan microarray GBM jaringan yang 70% dari kambuh-sewa tumor GBM, diobati dengan XRT, ditemukan memiliki ditinggikan RAD51 pada saat kekambuhan [19]. Paradoxi-Cally, ini menunjukkan bahwa kemampuan sel-sel ganas untuk memperbaiki kerusakan dsDNA dapat ditingkatkan oleh agen yang sangat digunakan untuk mengobati kanker. Stimulasi RAD51 oleh radiasi dapat menjelaskan mengapa terapi saat ini sementara

meningkatkan kontrol lokal tetapi gagal untuk menawarkan obat definitif. Jelas, substansial perbaikan dalam kontrol lokal dan kelangsungan hidup pasien dengan GBM akan memerlukan penargetan (Menghambat) mesin molekuler yang memediasi perkembangan resistensi. Untuk pengetahuan kita, ini adalah demonstrasi pertama bahwa MP470, antagonis c-Met lisan tersedia, menyebabkan radhiyallahu-osensitization jalur sel GBM beberapa. Kami telah menunjukkan bukti yang mendukung mekanisme tindakan yang konsisten dengan penurunan dalam perbaikan istirahat dsDNA, bersama dengan ditingkatkan radiasi induksi apoptosis. Lain-tor penyelidikan telah menunjukkan bahwa c-Met inhibisi dapat meningkatkan Radia-tion-akibat kematian sel tumor secara in vitro menggunakan retrovirally berdasarkan pendekatan yang tidak akan menjadi klinis layak pilihan, meskipun hal itu berfungsi sebagai bukti penting Konsep [10]. Hal ini kontras dengan MP470, yang ditoleransi dengan baik pada hewan, tanpa merugikan diamati efek dari administrasi harian 2.000 mg / kg pada tikus dan 240 mg / kg sampai anjing [22]. Ini pekerjaan awal pada MP470 disediakan yayasan untuk mendukung tahap I percobaan, untuk menetapkan dosis toleransi maksimum MP470 di manusia. Pekerjaan kami melaporkan di sini menunjukkan bahwa c-Met inhi-bition dapat menawarkan terapi yang relevan radiosensitization dan berpotensi meningkatkan rasio terapi radiasi-tahan tumor seperti GBM. bersaing kepentingan James Welsh, Penelitian dukungan dari Supergen, memegang tepuk-ent di MP-470 Daruka Mahadevan, Co-ditemukan dari MP470, memegang tepuk-ent di MP-470 David Bearss, Co-menemukan MP-470 dan karyawan Surgen, memegang paten pada MP-470 Semua penulis lainnya tidak memiliki konflik kepentingan. Penulis 'kontribusi JW mengembangkan ide-ide untuk percobaan ini, dilakukan banyak pekerjaan, dan disusun naskah. DM terlibat dengan desain eksperimental dan sumber daya yang disediakan untuk melakukan pekerjaan ini. RE dilakukan beberapa pengalaman-dokumen. LC memberikan dukungan teknis laboratorium. DB pro-vided sumber daya dan teknis saran. BS disediakan sumber daya dan berpartisipasi dalam desain dan koordinasi. Semua penulis membaca dan menyetujui naskah akhir. Ucapan Terima Kasih Karya ini didukung oleh dana dari Supergen dan kami ingin terima kasih dukungan mereka dari pekerjaan kami. Kami berterima kasih kepada anggota Experimen-tal Layanan Tikus Bersama di Arizona Cancer Center, bersama dengan University of California San Francisco kemurahan hati dalam berbagi sel GBM mereka garis dan Dr Raymond Meyn, (MD Anderson Cancer Center) untuk-Nya bantuan dalam persiapan publikasi