Contoh laporan praktikum Mikrobiologi Farmasi UII BIOAUTOGRAFI

A. TUJUAN Melakukan uji bioautografi untuk mendeteksi bercak atau komponen zat aktif ekstrak buah mundu yang dicurigai memiliki efektifitas sebagai antibakteri dengan mengamati zona jernih yang mungkin terbentuk. B. LANDASAN TEORI Mikroorganisme yang ingin kita tumbuhkan, yang pertama harus dilakukan adalah memahami kebutuhan dasarnya kemudian memformulasikan suatu medium atau bahan yang akan digunakan. Air sangat penting bagi organisme bersel tunggal sebagai komponen utama protoplasmanya serta untuk masuknya nutrien ke dalam sel (1). Kebanyakan analisis meliputi pengambilan cuplikan, pemisahan senyawa pengganggu, isolasi senyawa yang dimaksudkan, pemekatan terlebih dahulu sebelum identifikasi dan pengukuran serta teknik pemisahan yang digunakan, namun kromatografi merupakan teknik paling banyak digunakan. Pemisahan menggunakan teknik kromatografi relatif murah dengan peralatan yang relatif sederhana (2). Dalam mendeteksi campuran bakteri yang berupa bercak pada KLT ada 2 metode yang dipakai untuk mendeteksi bercak atau komponen yang aktif sebagai anti bakteri. Kedua metode tersebut adalah: 1. Deteksi mikrobiologi (bioautografi)
2. Deteksi senyawa kimia dengan reaksi warna spesifik (3).

Bioautografi merupakan metode yang spesifik untuk mendeteksi bercak pada kromtogram hasil kromatografi lapis tipis atau kromatografi kertas yang mempunyai aktivitas sebagai antibakteri, antibiotic, anti fungi dan anti viral. Bioautografi juga dapat juga digunakan untuk mendeteksi senyawa antibitik yang belum diketahui yang mana dengan pereaksi warna spesifik digunakan sebagai pembanding bioautografi sehingga kedua metode tersebut saling melengkapi (3).

Antibiotika adalah suatu substansi (zat-zat) kimia yang diperoleh dari atau dibentuk dan dihasilkan oleh mikroorganisme, dan zat-zat itu dalam jumlah yang sedikit pun mempunyai daya penghambat kegiatan mikroorganisme yang lain. Antibiotik dalam perlakuan medis bertujuan untuk mengeliminasi infeksi oleh mikroba maupun mencegah penyebarannya. Oleh karena itu, antibiotik harus mampu menghambat atau membunuh mikroba infektan namun tidak toksik terhadap inangnya. Antibiotik yang baik adalah antibiotik yang memberikan kesensitifan terhadap mikrobia. Antibiotik tersebut secara kimia dapat membunuh mikrobia. Antibiotik yang memberikan sifat intermediate terhadap suatu mikroba kurang baik untuk pengobatan karena antibiotik tersebut tidak secara menyeluruh dapat membunuh mikroba. Antibiotika tersebar di alam, dan memegang peranan penting dalam mengatur populasi mikroba dalam tanah, air, limbah dan kompos. Antibiotika berbeda dalam susunan kimia dan cara kerjanya. Antibiotika yang kini banyak dipergunakan, kebanyakan dari genus Bacillus, Penicillium, dan Streptomyces (4). Metode yang spesifik untuk mendeteksi bercak pada kromatogram hasil kromatografi lapis tipis (KLT) dan kromatografi kertas yang mempunyai aktivitas sebagai antibakteri, antifungi, antibiotik dan antiviral disebut bioautografi. Kromatografi lapis tipis merupakan salah satu kromatografi yang berdasarkan proses adsorpsi. Fase diam dapat menggunakan silika atau alumina yang dilapiskan pada lempeng kaca atau aluminium. Fasa bergerak (fase mobil) atau larutan pengembang biasanya digunakan pelarut campuran organik atau bisa juga campuran pelarut organik-anorganik (2). Kromatografi adalah metode pemisahan berdasarkan prinsip like dissolve like dimana senyawa polar akan larut pada pelarut polar dan sebalknya senyawa non polar akan larut pada senyawa non polar, Sehingga senyawa polar akan terikat pada fase diam yang polar pula, begitunpula sebaliknya
(5)

. Kromatografi lapis tipis merupakan

kromatografi adsorpsi dan adsorben (silika gel (asam silikat), alumina (aluminium oxide), kieselguhr (diatomeous earth), dan selulosa) bertindak sebagai fase stasioner. Dalam kromatografi lapis tipis, bahan penyalut yang digunakan beraneka macam. Silika gel yang paling banyak dipakai (2). Teknik ini dikembangkan tahun 1938 oleh Ismailoff dan Schraiber. Adsorbent dilapiskan pada lempeng kaca yang bertindak sebagai fase diam. Fase bergerak (Untuk

senyawa organik yang polar akan lebih mudah larut dengan air dari pada pelarut organik, dan hendaknya untuk senyawa-senyawa tertentu menggunakan pelarut sesuai dengan kepolaran pelarut yang digunakan dan pembuatan fase mobil harus hati-hati karena sulitnya keterulangan dalam campuran serta pelarut jangan digunakan dalam selang yang lama) akan merayap sepanjang fase diam dan terbentuklah kromatogram. Ini dikenal juga sebagai kromatografi kolom terbuka. Metode ini sederhana, cepat dalam pemisahan dan sensitif. Kecepatan pemisahan tinggi dan mudah untuk memperoleh kembali senyawasenyawa yang dipisahkan (6). Pelarut-pelarut yang digunakan biasanya berupa campuran satu komponen organik yang utama, air dan berbagai tambahan seperti asam-asam, basa-basa atau pereaksi komplek, utk memperbesar atau mengurangi kelarutan untuk zat-zat tertentu
(7)

Hal-hal yang perlu diperhatikan dalam teknik kromatografi adalah metode (penaikan, penurunan, mendatar), macam kertas, pemilihan dan pembuatan eluen (fase mobil), kesetimbangan dari bejana yang dipilih, pembuatan cuplikan, waktu pengembangan, metode deteksi dan identifikasi (6). Metode kromatografi lapis tipis mempunyai beberapa keuntungan yaitu diperoleh waktu yang lebih cepat dan hasil pemisahan yang baik. Waktu rata-rata untuk kromatografi lapisan tipis dengan panjang silica sekitar 10 cm adalah sekitar 20-30 menit (tergantung sifat dari fase gerak). Dalam kromatografi lapisan tipis hanya membutuhkan penyerap dan cuplikan dalam jumlah yang sedikit dan noda-noda yang dipisahkan dilokalisir pada plat seperti pada lembarab kertas. Setelah pemisahan mudah diperoleh senyawa-senyawa yang terpisah secara individu yaitu dengan cara mengeruknya dan mengumpulkan tiap-tiap lapisan di mana lapisan itu diserap. Identifikasi dari senyawasenyawa yang diserap pada lapisn tipis lebih baik digunakan atau dikerjakan dengan pereaksi kimia dan reaksi-reaksi warna, tetapi lazimnya untuk identifikasi menggunakan harga Rf yang didefinisikan sebagai berikut:

Harga Rf dari senyawa murni dapat dibandingkan dengan harga Rf standard. Perlu diperhatikan bahwa harga Rf yang diperoleh hanya berlaku untuk campuran tertentu dari pelarut dan penyarap yang digunakan, meskipun demikian daftar dari harga Rf untuk berbagai pelarut dan penyerap dapat diperoleh (5). Dalam proses pengelusian pada kromatografi kecepatan dan harga Rf senyawa dipengaruhi oleh: 1. Struktur senyawa kimia Struktur senyawa kimia berhubungan dengan polaritasnya yang akan mempengaruhi kelarutannya dalam fase gerak dan ikatannya dengan fase diam. 2. Kemurnian dari fase gerak Dlam penggabungan harus menggunakan pelarut yang murni apabila menggunakan campuran maka campuran tersebut harus diketahui pembandingnya dengan pasti. 3. Derajat kejenuhan dalam bejana Apabila tidak jenuh maka akan menybabkan kesetimbangan lapisan tipis terganggu sehingga menyebabkan terjadinya pengembangan dengan pelarut yang berbentuk cekungan fase gerak lebih cepat bergerak pada bagian tepi daripada di tengah 4. Jumlah cuplikan Jumlah penotolan yang berlebih dapat menyebabkan terjadinya tailing 5. Suhu Pemisahan sebaiknya dilakukan dalam suhu yang tetap agar tidak terjadi perubahan komposisi terhadap fase gerak yang dipakai karena disebabkan oleh penguapan atau perubahan bentuk dari fase gerak (5). Ada beberapa syarat yang harus dipenuhi sebelum melakukan bioautografi adalah: 1. Sterilisasi alat dan pengerjaannya 2. Ada media yang cocok untuk menumbuhkan mikrobia uji 3. Ada mikrobia uji yang digunakan untuk menguji aktifitas antibakteri senyawa uji
4. Senyawa yang akan dianalisis diduga memiliki aktivitas pembunuh atau panghambat

bakteri (8). Bioautografi dapat dilakukan dengan berbagai cara seperti barikut :

1. Plate komatografi hasil KLT diletakkan di atas permukaan media agar dalam Petri yang

telah diinkubasi bakteri yang sensitive terhadap antibiotic uji kemudian diinkubasi selama 37C selama 15-20 jam. 2. Menggunakan kertas saring yang diletakkan diantara plate kromatografi dengan permukaan media yang berinakulum bakteri.
3. Menambahkan tetrazidum ke dalam lapisan media agar atau tempat tumbuh bakteri

setelah diinkubasi atau diletakkan beberapa waktu. Zona hambat berwarna jernih (9). C. ALAT dan BAHAN Alat : 1. Mikro pipet 2. Pinset 3. Petridis 4. Inkubator 5. Plate silica 6. Pinset 7. Bunsen 8. Kaca obyek 9. Gelas chamber Bahan : 1. Media nutrient agar 2. Ekstrak Mundu 3. Pelarut n-heksan : etil asetat ( 3:1 ) D. CARA KERJA 1. Hari pertama a. Pembuatan KLT Ukur plate silica gel dengan lebar 2,5 cm dan panjang 10 cm

Jenuhkan fase gerak, n-heksan : etil asetat ( 3:1 ) dalam bejana

Totolkan larutan sampel (Ekstrak Mundu) sebanyak 20 l sebanyak 2-5 totolan

Kembangkan plate dalam bejana Setelah mengembang, plate dikeringkan sampai semua pelarut atau fase geraknya menguap

Amati bercak dibawah sinar UV dan Hitung hRf-nya

b. Uji aktivitas antibakteri dengan metode bioautografi Siapkan dan sterilisasi 20 ml media Nutrient Agar dalam erlenmeyer

Setelah agak dingin, campur mikroba uji., kemudian homogenkan

Tuang dalam petri steril, tunggu sampai beku

Letakkan kromatogram diatas permukaan media

Diamkan kromatogram kontak dengan medianya selama 30 menit

Tutup petri rapat dan di inkubasi selama 24 jam pada suhu 370C

Zona jernih yang terbentuk diamati

Ukur hRf-nya

E. DAFTAR PUSTAKA
(1) Hadioetomo, R.S. 1993. Mikrobiologi Dasar Dalam Praktek. Gramedia, Jakarta. (2) Djide, M. N. 2003. Mikrobiologi Farmasi. Jurusan Farmasi UNHAS, Makassar. (3) Stahl. E. 1969. Analisis Obat Secara Kromatografi dan Mikroskopi. Penerbit

ITB : Bandung (4) Waluyo, Lud. 2005. Mikrobiologi Umum. Penerbit Universitas Muhammadiyah : Malang. (5) Sastroamidjojo, Hardjono. 2005. Kromatografi. Liberty : Yogyakarta.
(6) Petrucci, R. H., 1987. Kimia Dasar Jilid 3. Erlangga, Jakarta. (7) Ganiswarna, S. G. 1995. Farmakologi dan Terapi Edisi 4. Bagian Farmakologi-

Fakultas Kedokteran, Universitas Indonesia, Jakarta.

(8) Wagman, G.H. dan Weinstein, M.J. 1973. Chromatography of Antibiotics.

Journal of Chromatography, Elsifier, scientic Publishing company: New York.

(9) Zweig, G. and J. R. Whitaker, 1971, Paper Chromatography and Electrophoresis,

volume 2, Academic Press, New York and London.