Introduccin: La a-amilasa es una enzima proteica que se encuentra en la saliva humana y cataliza la degradacin del almidn, que es un polisacrido

de reserva vegetal . El almidn est formado por dos tipos de molculas: la amilosa y la amilopectina, ambos polisacridos de glucosa. La amilosa se conforma por cadenas lineal es de glucosas unidas por enlaces a- C1- C4, mientras que la amilopectina tiene, adems de estos ltimos enlaces, uniones C1 con C6, formando cadenas ramificadas. La aamilasa rompe uniones C1- C4, tanto en la amilasa como en la amilopectina, dejando dextrinas lineales y ramificadas ( oligosacridos) como productos. Para medir la actividad enzimtica de la a- amilasa, se utilizar un test colorimtrico que detecta el almidn. Par a ello se contar con una solucin de iodo/ ioduro de potasio ( I2/ I K) , ya que el almidn en presencia de esta solucin adquiere una coloracin azulada caracterstica. Esto tiene una explicacin fsica: el iodo se coloca en el interior de la hlice que forma la amilosa ( en las regiones hidrofbicas) , formando un complejo de color azul. Cuando la a- amilasa acta, degrada la amilosa, se desintegra la hlice y por tanto en presencia de I2/ I K ya no dar una coloracin azul. Por lo tanto, en este TP mediremos la desaparicin de sustrato ( evidenciada por el test colorimtrico) para determinar la actividad de la enzima. Adems, analizaremos cmo afectan las distintas condiciones en que acta la enzima ( pH, temperatura, concentracin de NaCl ), as como los efectos que pueden causar diferentes pretratamientos ( proteinasa, calor ). La dilucin ptima nos indicar cunto debemos diluir la saliva para que se logre el efecto acromtico dentro del rango propuesto ( 2- 8 minutos) . Metodologa: Se parti de una muestra de saliva de un integrante del grupo y se la recogi en un vaso de precipitado que se coloc en un recipiente con hielo para reducir la energa cintica ( para disminuir el contacto de las molculas, reduciendo las interacciones qumicas que se pudieran producir ) de compuestos presentes en la saliva que puedan afectar el funcionamiento de la protena. A partir de la muestra, se tom una al cuota para impregnar un papel indicador de pH sobre un papel blanco. El pH obtenido fue entre 7- 8. Desde aqu , el trabajo se dividi en dos partes: una par a determinar la dilucin ptima y el tiempo de referencia y la otra, modificando una de las condiciones experimentales.

Par t e 1:

Se tom 1 ml de saliva de la muestra del vaso de precipitados y se lo diluy con 9 ml de agua destilada en un tubo de ensayo, obteniendo una dilucin 1/ 10. Luego se mezcl por inversin, evitando que la solucin adquiera energa cintica y se produzca la desnaturalizacin de la enzima de nuestro inters; y se lo coloc en hielo, por la misma razn antes expuesta. Se prepar una gradilla con 15 tubos, conteniendo cada uno una solucin ( de coloracin amarilla) de 5 ml de agua de la canilla y una gota deI2/ IK 0,01M, que se mezcl por agitacin par a obtener una solucin homognea. Luego, se nos entreg una solucin de almidn 1% p/ v a bao trmico a 37 C ( par a que conforme una solucin homognea) . Se extrajeron 6 gotas con pipeta Pasteur de la solucin de almidn y se la volc en un tubo 0 de la gradilla, mezclndolo por inversin y obteniendo un color azul caracterstico del complejo Iodo- almidn. Pr ont ament e, se col oc en el t ubo con al mi dn 1 ml de l a di l uci n 1/ 10 de l a sal i va ( que cont i ene a ami l asa) y en ese i nst ant e se comenz a cr onomet r ar . A l os 30 segundos, se r et i r ar on 6 got as de est a sol uci n a 37 C donde deb a ocur r i r l a r eacci n y se l as agr eg al t ubo 1 de l a gr adi l l a. Est e pr ocedi mi ent o se deber a haber r epet i do cada 30 segundos par a l os si gui ent es t ubos hast a que l a muest r a adqui r i er a un col or par duzco, si n embar go, ya en el t ubo 1, al mezcl ar l o por i nver si n con un t apn de goma, se obt uvo una col or aci n par da. Como el ef ect o acr omt i co expl i cado en l a i nt r oducci n se hab a dado ant es de l os 2 mi nut os, er a evi dent e que l a di l uci n 1/ 10 no er a l a pt i ma. Por eso, se deci di una nueva di l uci n 1/ 50. Par a obt ener est a di l uci n, se t om 1 ml de l a 1/ 10 de sal i va y se l a col oc en un t ubo de ensayos con 4 ml de agua dest i l ada, mezcl ndol o por i nver si n. Se r epi t i el pr ocedi mi ent o ant er i or de l a medi ci n de l a r eacci n enzi mt i ca y de est a maner a se det er mi n el t i empo de r ef er enci a par a l a di l uci n 1/ 50, que ser l a di l uci n pt i ma.