OBTENCIN DEL DNA GENMICO Para obtencin del DNA genmico se utiliz el protocolo de extraccin de DNA fenol/cloroformo/alcohol isoamilico,

para aislamiento de DNA genmico de la sangre, que consiste en lo siguiente: 1. Obtencin de 1 ml de sangre total almacenada en tubos vacutainer con EDTA congeladas a -70C. 2. Descongelacin de las muestras, y para cada muestra de 1 ml, se aadi 0,8 ml de buffer 1X citrato en solucin salina (SSC), y se mezcl (para romper membranas de las clulas sanguneas). Centrifugacin durante 1 minuto a 12.000rpm en una micro centrfuga. 3. Se retiro 1ml del sobrenadante y se desecho en un desinfectante. 4. Aadiendo 1ml de tampn 1X de SSC, y agitando con vrtex, se centrfugo el anterior un minuto, eliminando todo el sobrenadante. 5. Agregando 375l de Acetato de sodio (NaOAc) 0,2M a cada precipitado y agitando brevemente. A continuacin, se aadieron 25l de Dodecil sulfato sdico (SDS) al 10% y 5l de proteinasa K (20mg/ml de H2O) (Sigma P-0390), agitando brevemente e incubando durante 1 hora a 55C (desnaturalizacin de enzimas restantes). 6. Aadiendo 120l de fenol/cloroformo/alcohol isoamlico y agitando durante 30 segundos. Centrifugando la muestra durante 2 minutos a 12.000rpm en un tubo de microcentrfuga. 7. Cuidadosamente se retiro la capa acuosa a un nuevo tubo de microcentrfuga de 1.5ml, agregando 1ml de etanol al 100% fro, mezclando e incubando durante 15 minutos a 20C.

8. Centrifugando durante 2 minutos a 12.000rpm en una microcentrfuga. Decantando el sobrenadante y drenando. 9. Agregando 180l de buffer TE 10:01, se agito, y se incub a 55C durante 10 minutos. 10. Se aadieron 20l de acetato de sodio 2M y se mezclo. Se agreg 500l de etanol 100% fro, se mezcl y centrifug durante 1 minuto a 12.000rpm en una microcentrfuga. 11. Decantando el sobrenadante y lavando el precipitado con 1ml de etanol al 80%. Centrifugando durante 1 minuto a 12.000 rpm en una microcentrfuga. 12. Decantando el sobrenadante y secando el precipitado en un Speedy-Vac durante 10 minutos (o hasta que se sec). 13. El pellet se resuspendi y se agregaron 200l de buffer TE 10:1. Incubando durante una noche a 55C, agitando peridicamente para disolver el ADN genmico. Se almacenaron las muestras a -20C.

ESTUDIOS DE INTEGRIDAD DEL DNA. Electroforesis de DNA en gel de agarosa. La electroforesis es una tcnica de separacin de molculas segn la movilidad de estas en un campo elctrico, a travs de una matriz porosa, la cual los separa por tamaos moleculares y carga elctrica. Se prepararon geles de agarosa al 1%. Para ello se tomaron 0.5g de agarosa, y se diluyeron en 49ml. de agua destilada y 1ml. de Tampn Tris-Acetato (TAE) 50x. Se procedi a fundir la agarosa a 60C, se dejo enfriar y se agregaron 1.5l. de bromuro de etidio, despus se vaci en moldes para gel, colocando un peine adecuado, ya

solidificado se coloco el gel en la cmara de electroforesis, aadindole buffer TAE 1x y procurando extraer todo el aire de los orificios del gel, agregando en cada uno de ellos 1l de ADN y 0.3l de colorante (solucin de azul bromofenol y cianol xileno), se corri a 62 volts durante 20 minutos.

PRUEBA DE CONCENTRACIN Y PUREZA. Cuantificacin de ADN. Se utilizo un espectofotometro ThermoSpectronic Genesis 10 vis, en donde se determino la absorbancia de cada muestra. Las longitudes de onda utilizadas fueron 260 y 280nm, preparando las muestras con un factor de dilucin de 200, es decir 5l de ADN y 995l de agua MilliQ (agua purificada y desionizada). Para la medicin de la pureza se dividi la absorbancia a 260nm entre la 280nm, si el resultado fue menor a 1 la muestra es pura, si es mayor a 1 tiene un grado de impureza.