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From the SelectedWorks of Pr. Mamoudou H.

DICKO, PhD

January 2006

Travaux Pratiques de Biochimie Structurale et d'Enzymologie

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UNIVERSITE DE OUAGADOUGOU -------------------

Unit de Formation et de Recherche en Sciences de la Vie et de la Terre (U.F.R.S.V.T.)


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Centre de Recherche en Sciences Biologiques Alimentaires et Nutritionnelles (CRSBAN)


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Anne 2006-2007

Laboratoire de Biochimie Emails: mdicko@univ-ouaga.bf Mamoudou_dicko2004@yahoo.fr Tel. +227 70272643

TRAVAUX PRATIQUES BIOCHIMIE STRUCTURALE & ENZYMOLOGIE Licence de Biochimie DUT- Contrle Qualit- IAA-2me Anne

Enseignant Pr. Mamoudou H. DICKO, MSc, DSc, PhD Matre de Confrences en Biochimie et Biotechnologie

Moniteurs - Obam Luis Clment (Thse Biochimie) - Karim Koudougou (Thse Biochimie) - Bayili Romaric (DEA Biochimie) - Abdoul-Latif Fatimatou (DEA Biochimie) - Diabat Wilfrid (DESS-IAA) Techniciens Paul KAGANBEGA Kabor Dieudonn Traor Eugne
TP. Licence Biochimie, DUT-CQA-2me Anne, Pr. M. H. DICKO

2 AVANT PROPOS

Inutile de rappeler ici les exigences en matire de comportement au laboratoire, la conduite tenir, les rgles dutilisation des appareils etc., car elles sont senses tre connues par un tudiant de niveau Licence ou 2me Anne DUT-Contle de Qualit en Agroalimentaire.

Les objectifs globaux de ce TP sont de : connatre les proprits chimiques et physiques des constituants de la matire vivante et les mthodes de dosage; tre capable d'utiliser les outils de base de la biochimie, de les manipuler correctement avec exactitude et prcision et de prsenter des donnes sous forme de tableaux, de figures ou de graphiques. Le but de ce cours sera avant tout pratique. Il faut donner au futur biochimiste les moyens thoriques de comprendre les techniques biochimiques utilises en laboratoire et dans l'industrie. Le plus souvent, plusieurs techniques s'offrent au Biochimiste qui est amen faire un choix selon les avantages et les inconvnients de chaque mthode et les proprits du matriel tudier. Le gradu devra tre capable de justifier et de proposer ce choix en situant le problme dans un contexte plus gnral. Il devra galement tre capable de comprendre et de proposer l'intgration de plusieurs techniques en une stratgie. Enfin, la Biochimie et l'instrumentation tant en perptuelle volution, le futur gradu devra tre form pour apprendre apprendre. Le plus souvent, le Biochimiste est amen faire un choix selon les avantages et les inconvnients de plusieurs techniques et les proprits du matriel tudier. Enfin, l'tudiant devra tre capable de faire un rapport concis sur le travail demand et les rsultats obtenus. Il devra tre capable de discuter ses rsultats.

copyright , Droit dauteurs : aucune photocopie du document nest autorise sans laccord crit des auteurs.

Pr. Mamoudou H. DICKO, PhD

TP. Licence Biochimie, DUT-CQA-2me Anne, Pr. M. H. DICKO

SOMMAIRE
TP. 1. DOSAGE SPECTROPHOTOMETRIQUE DE LAMIDON TOTAL,

LAMYLOSE ET LAMYLOPECTINE ................................................................. 4 TP. 2. DOSAGE SPECTROPHOTOMETRIQUE DES SUCRES TOTAUX ET DES SUCRES REDUCTEURS......................................................................................... 7 TP. 3 COMPARAISON DES POUVOIRS ROTATOIRES DES MONO ET POLYSACCHARIDES : ETUDE DE LA MUTAROTATION DU

GLUCOSE ................................................................................................................ 9 TP. 3 COMPARAISON DES POUVOIRS ROTATOIRES DES MONO ET POLYSACCHARIDES : ETUDE DE LA MUTAROTATION DU

GLUCOSE .............................................................................................................. 10 TP. 4. ETUDE CINETIQUE DE LHYDROLYSE ENZYMATIQUE DE LAMIDON..... 13 TP. 5. COMPARAISON DU DOSAGE SPECTROPHOTOMETRIQUE DES PROTEINES PAR LA METHODE DE BRADFORD/SEDMAK ET PAR LA METHODE DE KJELDAHL................................................................................. 17 TP. 6. EXTRACTION ET CARACTERISATION DES LIPIDES ...................................... 21 TP. 7. ETUDE CINETIQUE DE LHYDROLYSE DES TRIGLYCERIDES PAR LA LIPASE DE Pseudomonas Cepacia ........................................................................ 27 TP. 8. FRACTIONNEMENT DUN HOMOGENAT DE PANCREAS ET

CARACTERISATION DES FRACTIONS OBTENUES ..................................... 33 TP. 9. ETUDE CINETIQUE DE LA LIBERATION DES ACIDES GRAS PAR LA LIPASE PANCREATIQUE A PARTIR DHUILE DARACHIDE .................... 31 TP 10. ELECTROPHORESE DES PROTEINES................................................................. 37

TP. Licence Biochimie, DUT-CQA-2me Anne, Pr. M. H. DICKO

4 TP. 1. DOSAGE SPECTROPHOTOMETRIQUE DE LAMIDON TOTAL, LAMYLOSE ET LAMYLOPECTINE Principe Lamidon (polysaccharides de rserve chez les vgtaux) est une macromolcule constitue de deux polymres de D-glucose : Amylose et amylopectine (Figure 1). Lamylose est constitu essentiellement dunits de D-glucoses unies entre elles par des liaisons de type (14). Lamylopectine consiste essentiellement en units (14)-D-glucosidiques linaires mais branche, par des liaisons de type (16)-D-glucosidiques tous les 24-30 units de glucose. Lamylopectine contient plus de 106 rsidus de D-glucose , la rendant ainsi la macromolcule biologique la plus volumineuse qui existe. La structure primaire de lamylopectine est semblable celle du glycogne (polysaccharide de rserve chez les animaux) mais le nombre de rsidus de D-glucose dans les ramifications est de lordre de 8 12 dans le glycogne. En dautres termes le glycogne est plus ramifi que lamylopectine. Liode (I2) interagit avec lamylose et lamylopectine pour donner une coloration respectivement bleue et brune. Les spectres des complexes I2-amylose et I2-amylopectine sont diffrents. De ce fait ces complexes ont des longueurs dondes maximales pour lamylose (max = 630 nm) et lamylopectine (max = 548 nm) qui sont diffrentes. En plus lamylose absorbe dans le proche visible tan disque lamylopectine ny absorbe pas (Figure 2). On peut donc utiliser cette diffrence spectrale pour doser simultanment lamidon total, lamylose et lamylopectine dans un matriel biologique. Dans cette manipulation on considrera que labsorbance 580 nm est lie la fois lamylose et lamylopectine, par contre labsorbance 720 nm est lie essentiellement lamylose. Matriels et ractifs Bain marie Spectrophotomtre UV-visible Tubes essais Centrifugeuse Plaques chauffantes Ractif de liode : 0.2 g de I2 dissous dans 100 ml de KI 2 % (w /v) dans 0.1 N HCl. Amidon de pomme de terre 1 N KOH 1 N HCl

Mode opratoire a. Courbe dtalonnage de lamidon standard

Disperser 0.5 g damidon dans 20 ml deau distille. Y ajouter 80 ml deau distille bouillante. Agiter lgrement le mlange et continuer lbullition pendant 5 min sur une plaque chauffante pour obtenir une solution damidon limpide. Refroidir le mlange et le complter un volume de100 ml avec leau distille. Ceci constitue une solution stocke damidon 5 mg/ml. La courbe dtalonnage est tablie selon le tableau ci-dessous :

TP. Licence Biochimie, DUT-CQA-2me Anne, Pr. M. H. DICKO

5 Tableau 1. Etablissement de la courbe dtalonnage. N.B. Les mesures sont faites en triplet Ractif /tube T=0 (Blanc) (5 0 T=1 T=2 T=3 T=4 T=5 T=6 T=7 0.07 4.83 0.1 T=8 0.08 4.82 0.1 T=9 0.09 4.81 0.1 T=10 0.10 4.8 0.1

Amidon 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06 mg/ml) en ml H2O (ml) 4.9 4.89 4.88 4.87 4.86 4.85 4.84 Ractif I2/KI 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 (ml) Calculer la conc damidon (mg/ml) Dure 10 min avant les lectures des DOs dincubation DO1 (580 nm)

DO2 (720 nm) Moy DO1 Moy DO2 - Tracer la courbe f([amidon]) = DO1, amidon total Tracer la courbe f([amidon]) = DO, amylose sachant que la proportion damylose et damylopectine dans lamidon de pomme de terre est respectivement de 20% et 80%. b. Prparation de lchantillon analyser

Prendre 0.1 g de farine de matriel biologique bien broy ( = 0.5 mm) et y ajouter 5 ml de 1 N KOH. Bien homogniser la solution la temprature ambiante et la neutraliser ensuite avec 5 ml de 1 N HCl. Bien sassurer que la solution est neutre laide dun papier pH. Mettre ensuite le mlange en bullition au bain-marie pendant 15 min. Rajuster le volume du mlange 10 ml. Centrifuger le mlange et prendre le surnageant. Filtrer au besoin le surnageant et lutiliser pour le dosage de lamidon. C. Dosage de lamidon dans le matriel biologique. N.B. Les mesures sont faites en triplet Blanc Echantillon 1 0 0.05 ml 4.90 ml 4.85 ml 0.1 ml 0.1 ml 10 min avant les lectures des DOs Echantillon 2 0.05 ml 4.85 ml 0.1 ml

Ractif /Echantillon Echantillon H2O Ractif I2/KI Dure dincubation Moy DO (580 nm) Moy DO (720 nm)

A laide de ces mesures, calculer les proportions damidon total, damylose et damylopectine dans les chantillons. Donner une conclusion.

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A M Y LO S E

A M Y L O PE C T IN
Figure 1. A) structure linaire de lamylose ; B) Structure ramifie de lamylopectine

Figure 2

Rfrence. Jarvis, C. E. and Walker, J. R. L. (1993) Simultaneous, rapid, spectrophotometric determination of total starch, amylose and amylopectin. J. Sci. Food Agric. 63 , 53-57

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TP2. Dosage spectrophotomtrique des sucres totaux et des sucres rducteurs


Principe En milieu acide et chaux, les liaisons glycosidiques des carbohydrates sont hydrolyses. Les oses simples ainsi librs subissent une dshydrations intramolculaires pour des drivs furfuraux (furfural ou hydroxymethyl furfural). La fonction aldhyde des furfuraux se condense ainsi en milieux acides avec lhydroxyl dun compos phnolique (Figure 1) pour donner des actals ou hmi-actals de couleur rougetre qui absorbent dans le visible (450-500 nm). Cette mthode permet ainsi de doser tous les glucides totaux dun matriel biologique. Les sucres rducteurs sont doss par une mthode colorimtrique avec le ractif lAcide 3,5Dinitrosalycilique (DNS). Cest une raction doxydo-rduction non stchiomtrique permettant de quantifier les sucres rducteurs. Dans cette raction, la fonction aldhyde du sucre libre (rducteur) est transforme en fonction carboxylique par le DNS (oxydant). Labsorbance du DNS oxyd est lue 546 nm. Matriels et ractifs Bain marie Spectrophotomtre UV-visible Tubes essais Centrifugeuse Plaques chauffantes Solution de phnol : 5% (p/v) dans leau Acide sulfurique 75% Ractif au DNS Solution A= 2g de DNS dispers dans 40 ml deau distille Solution B. 3.2 g de NaOH dissout dans 30 ml deau Les deux solutions A et B sont mlanges et on y ajoute 60 g de tartrate double de sodium et de potassium. Dissolution du mlange peut ncessiter un lger chauffage su une plaque chauffante. Aprs dissolution, le volume est ajust 100 ml avec leau. Solution standard de maltose 0.05 mg /ml pour les sucres totaux Solution de maltose 0.5 mg/ml pour les sucres rducteurs

Mode opratoire a. Etablissement des courbes dtalonnage

Tableau 1. Courbe dtalonnage pour les sucres totaux : Ractif /tube T=0 T=1 T=2 T=3 (Blanc) Maltose (0.05 0 0.1 0.2 0.3 mg/ml) H2O (ml) 0.5 0.4 0.3 0.2 Phnol (5%) (ml) 0.5 0.50 00.5 0.5 H2SO4 2ml 2ml 2ml 2ml Incubation bain 15 min marie bouillant Incubation lobscurit 15 min

T=4 0.4 0.1 0.5 2ml

T=5 0.5 0 0.5 2ml

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8 Ractif /tube T=0 (Blanc) T=1 T=2 T=3 T=4 T=5

Calcul maltose Moy A492 -

conc.

Tracer la courbe A492 = f([maltose]); et donner lquation de la droite.

Tableau 2. Courbe dtalonnage pour les sucres rducteurs Ractif /tube T=0 (Blanc) (0.5 0 T=1 0.1 0.4 1 T=2 0.2 0.3 1 T=3 0.3 0.2 1 T=4 0.4 0.1 1 T=5 0.5 0 1

Maltose mg/ml) H2O (ml) 0.5 Ractif DNS 1 (ml) Incubation bain 8 min marie bouillant Calcul conc. maltose Moy A546O -

Tracer la courbe f([maltose]) = A546 ; et donner lquation de la droite. b. Prparation et dosage des chantillons analyser

1 g de farine dchantillon est dispers dans 10 ml de DMSO 25% (v/v) dans leau. Le mlange est incub au bain marie bouillant pendant 15 min. 0.1 ml de ce mlange est dilu dans 9.9 ml deau. - Dosages des sucres totaux. A 0.5 ml de ce dernier, on ajoute 0.5 ml de phnol (5%). Aprs homognisation, on ajoute 2 ml de H2SO4 (75%). Ce mlange est ensuite trait comme prcdemment dcrit pour le standard. Faire lessai en triplicate. - Dosage des sucres rducteurs. 0.1 ml de lchantillon pralablement dispers dans le DMSO sont mlangs avec 0.4 ml deau distille. La solution est ensuite mlange avec 1 ml du ractif au DNS puis incub au bain comme prcdemment dcrit pour le standard. Faire lessai en triplicate. Calculer la proportion des sucres totaux et des sucres rducteurs dans lchantillon Discuter les rsultats.

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H2SO4

a)

+ 3 H2O

Furfural D-Ribose

H2SO4

b)

+ 3 H2O +

D-Glucose

5-Hydroxymethyl Furfural

Figure 1. a) Exemple de raction de dshydratation dun pentose tel que le D-ribose pour donner le furfural b) exemple de raction de dshydratation dun hexose tel que le D-Glucose pour donner le 5-Hydroxymethyl furfural c) Raction de condensation entre le furfural et une compos phnolique tel que le phnol, lorcinol, le resorcinol.

c)

Actals colors

Rfrences. Sucres totaux : Fox, J. D. and Robyt, J. F. (1991) Miniaturization of three carbohydrate analyses using a microsample plate reader. Analytical Biochemistry., 195, 93-96. Sucres rducteurs: Miller, G. L. (1958) Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar. Analytical Chemistry. 31, 426-428.

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TP. 3 Comparaison des pouvoirs rotatoires des mono et polysaccharides : Etude de la mutarotation du glucose
Principe Les carbohydrates sont des composs optiquement actifs, c'est--dire quils dvient la lumire polarise. Cette dviation est due lexistence de plusieurs carbones asymtriques dans les sucres. En solution, les sucres subissent la mutarotation lie la variation lente de la configuration strochimique de leurs carbones asymtriques. Cette mutarotation peut induire une augmentation ou diminution de langle de dviation selon les pouvoirs rotatoires spcifiques des diffrents anomres. Le pouvoir rotatoire spcifique dune substance optiquement active se calcule selon la formule :

[ ] =

LxC

[] = pouvoir rotatoire spcifique du compos = angle de rotation observ au polarimtre L = longueur du tube de polarimtre (dm) C = concentration du compos en g/ml

Ractifs et appareils Polarimtre Solutions de sucres : glucose, mannose, arabinose, fructose, saccharose, raffinose, amidon, quilibres dans leau. Poudre de glucose

Mode opratoire Le polarimtre utilis dans ce TP est le Ceti polaris (Figure 1).

1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9.

Oculaire Bouton de magnification Analyseur ou bouton de contrle et de focalisation Bouton de focalisation de loculaire Fentre de lecture des valeurs des angles Compartiment contenant le tube du polarimtre de longueur variable Filtre de verre Lampe de sodium (=589 nm) Bouton de mise en marche

Figure 1. Description du polarimtre

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11 Utilisation du polarimtre Aprs avoir allum la lampe de sodium, attendre 10 min de chauffage. Introduire le tube contenant leau distille et lire le blanc. Ajuster le bouton de focalisation dobservation pour obtenir une image claire.

Mettre dans le tube du polarimtre une substance optiquement active (par exemple une solution de sucre). Noter la longueur du tube. Tourner le bouton de contrle jusqu ce que la plaque indique presque zro de tous les deux cts (gauche et droite). On observe un cercle jaune/orange divis par une bande noire comme suit : Valeur de mesure <

Tourner lanalyseur la main jusqu ce que les trois parties du cercle aient la mme couleur jauntre :

Valeur de mesure =

Lorsquon dpasse la valeur exacte de langle , on observe limage ci-dessous :

Valeur de mesure >

La valeur positive de langle est lue droite et la valeur ngative gauche. La valeur de langle de rotation est lue comme suit : - Lire la valeur obtenue partir des grandes graduations. - Pour obtenir une meilleure prcision on divise un degr de rotation part 20 parties (petites graduations). Maintenant on lit la valeur dcimale au point o le trait intrieur concide avec un trait du cercle extrieur comme indiqu dans limage ci-dessous : Comparer les angles de dviation des solutions de diffrents sucres pralablement prpars et laisss en quilibres : glucose, mannose, arabinose, fructose, saccharose, raffinose, mlezitose, amidon, etc. Calculer les concentrations des sucres en utilisant les valeurs de leurs pouvoirs rotatoires spcifiques donnes dans la littrature.

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Etude de la mutarotation du glucose Dissoudre frachement 25 g de glucose dans 100 ml deau distille et lintroduire immdiatement dans un tube de polarimtre de longueur de 2 dm. Lire la valeur de langle t=0, et ensuite toutes les 5 min jusqu ltat dquilibre (si le temps impartit le permet !). On obtient le tableau suivant : Temps 0 5 (min) observ 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 75 90 120

1. Calculer les pourcentages d et de -glucose prsents aprs 15 et 30 min dincubation. 2. Dterminer les constantes cintiques de la mutarotation k1 et k2 ainsi que la constante de la mutarotation km. Donnes : [] glucose= +112.7, [] glucose = +18.7 3. A partir de cette tude pouvons-nous dterminer lanomre le plus stable ? Valeurs des pouvoirs rotatoires spcifiques de quelque carbohydrates Carbohydrate D-ribose L-arabinose D-xylose D-glucose D-galactose D-fructose D-mannose L-rhamonose L-sorbose Lactose Maltose Sucrose Raffinose Trehalose Anomre -23.1 +54.0 +92 +113.4 +144.0 -21.0* +34.0 -7.7 +90.0 +168.0* Mlange lquilibre -23.7 +104.5 +19 +52.2 +80.5 -92.0 +14.6 +8.9 -4.4 +55.3 +16 +66.5 +105.2 +178.3 Anomre +175.0 -20.* +19 +52.0 -133.5 -17.0 +54.0* +35 +118 -

*Valeurs calcules. Rfrence : Rendina G. (1971) Experimental in modern biochemistry. Ed. Saundres W. B. Company, New York (USA). pp.133-161.

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TP. 4 Etude cintique de lhydrolyse enzymatique de lamidon


Principe Lamidon (polysaccharides de rserve chez les vgtaux) est une macromolcule constitue de deux polymres de D-glucose : Amylose et amylopectine (Figure 1). Lamylose est constitu essentiellement dunits de D-glucoses unies entre elles par des liaisons de type (14). Lamylopectine consiste essentiellement en units (14)-D-glucosidiques linaires mais branches, par des liaisons de type (16)-D-glucosidiques tous les 24-30 units de glucose. Ces deux polymres peuvent tre hydrolyss par les amylases enzymes spcifiques des liaisons (14)), les glucosidases, lamidon phosphorylases, la pullulanse, lamyloglucidase etc. Les amylases sont des hydrolases ; enzymes de la classe III dans la classification internationale des enzymes (International Union of Pure and Applied Chemistry, IUPAC). Lamylase ou -(14)-D-glucane 4-glucanohydroase (EC. 3.2.1.1) est dorigine animale, vgtale et microbienne. Elle est surtout abondante dans les grains de crales (bl, sorgho, mil, etc.) en germination. La -amylase ou -(14) glucane maltohydroase (EC. 3.2.1.2) est surtout rencontre dans les vgtaux et les microbes. Ces deux enzymes ont pour principal substrat lamidon mais leur action est incomplte car elles ne peuvent pas hydrolyser les liaisons (16) prsentes dans lamylopectine. Cette tude consiste extraire les amylases de la farine de sorgho germ (contenant la fois des amylases et ), et ensuite tudier la cintique de lhydrolyse de cet amidon par ces enzymes. Ltude cintique en fonction de la concentration en substrat nous permettra destimer les paramtres cintiques (Km et Vm) des amylases du sorgho. En rappelle les amylases sont des enzymes obissant la loi cintique de Michalis-Menten donne par lquation :

Vi =

Vm[ Eo] Km + [ S ]

O Vi= vitesse initiale de la raction enzymatique ( t 0) Vm, vitesses maximale de lenzyme Km, constante de Michalis, correspondant la concentration en substrat laquelle la vitesse atteint la moiti de la vitesse maximale Le trac en double inverse de Lineweaver et Burk (trac en double inverse) nous permet dobtenir lquation suivante : 1 Km 1 1 = x + Vi Vm [ S ] Vm Le trac 1/vi = f(1/[s]) donne une droite de pente Km/Vm et dordonne lorigine 1/Vm. Liode (I2) interagit avec lamylose et lamylopectine pour donner une coloration respectivement bleue et brune. Dans cette manipulation on considrera que labsorbance 580 nm est lie la fois lamylose et lamylopectine. Lhydrolyse de lamidon par les amylases donne du glucose, du maltose et des dextrines limites (rsidus doligosacchrides posssdant des ramifications de type (16). Cela rsulte de ce fait de la dcoloration du milieu ractionnel, e.g. une baisse de labsorbance 580 nm. En suivant (monitoring) la variation de labsorbance 580 nm, on peut effectivement dterminer les constantes cintiques apparentes globales des amylases du sorgho.
Matriels et ractifs

Bain marie Spectrophotomtre UV-visible


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14 Tubes essais Centrifugeuse Plaques chauffantes Ractif de liode : 0.2 g de I2 dissous dans 100 ml de KI 2 % (w /v). Amidon de pomme de terre Solution tampon McIlvaine (50 mM phosphate/citrate pH 2 9). Prparer une solution dacide citrique, 50 mM, pour un volume de 1 litre Prparer une solution de Na2HPO4, 50 mM, pour un volume de 1 litre

Mode opratoire

a. Extraction des amylases du sorgho

Peser 1 g de farine de sorgho germe et les disperser dans 20 ml de tampon McIlvaine pH 6 contenant du CaCl2 2 mM.. Laisser sous agitation pendant 5 min. Centrifuger la solution et prendre le surnageant comme extrait enzymatique. Cet extrait doit tre conserv au frais (4C). b. Etude de la variation de vitesse initiale en fonction de la concentration en substrat.

Disperser 0.1 g damidon dans 20 ml deau distille. Y ajouter 80 ml deau distille bouillante. Agiter lgrement le mlange et continuer lbullition pendant 5 min sur une plaque chauffante pour obtenir une solution damidon limpide. Refroidir le mlange et le complter un volume de 100 ml avec leau distille. Ceci constitue une solution stocke damidon 1 mg/ml. Tableau 1. Prparation Ractif /tube T=0 (Blanc) (1 0 2.5 0.05 200 l T=1 0.02 2.5 0.05 200 l T=2 0.04 2.5 0.05 200 l T=3 0.08 2.5 0.05 200 l T=4 0.12 2.5 0.05 200 l T=5 0.16 2.5 0.05 200 l T=6 0.20 2.5 0.05 200 l

Amidon mg/ml) en ml Tampon Citrate pH6 (ml) Ractif I2/KI (ml) Extrait enzymatique Prendre les DO580 nm toutes les 10 s

t=0 idem idem idem idem idem idem t=10 t=20 t=30 t=-----t= 3 min N.B. La solution enzymatique est additionne juste avant la lecture de la DO Tracer la courbe f(A580) = f(t) pour chaque concentration en amidon, dterminer les vitesses initiales pour chaque concentration en amidon. Tracer la courbe Vi = f([amidon)]. Dduire si cette cintique est Michalienne ou non Tracer la courbe 1/Vi = f(1/S) et calculer les paramtres cintiques Km et Vm. Garder le mme blanc pour toutes mesures

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15 c. Etude de lactivit enzymatique en fonction du pH

Ltude de lactivit enzymatique en fonction du pH se fera dans des tampons standard de type McIlvaine (Journal of Biological Chemistry). Cette prparation se fera sur la base de lquation dAnderson Hasselbalch :
pH = pK + log [ Base] [ Acide]

La prparation des solutions tampons se fera selon le tableau suivant : Tableau 2. Prparation des tampons McIlvaine Ractif T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 50 mM 100 100 ml 100 ml 100 ml 100 ml 100 ml x x x acide ml citrique 50 mM 0 x x x x x 100 ml 100 ml 100 ml Na2HPO4 Volume x 2.3 3 4 5 5.5 6.5 7 8 9 pour obtenir un dsir pH Cette gamme de prparation nous permet dobtenir des solutions tampons de pH variant de 2.5 9. Conserver les solutions tampons au frais avant leur utilisation.
Tableau 3. Etude de lactivit en fonction du pH Ractif /tube T=1 T=2 T=3 T=4 T=5 T=6 pH pH3 pH4 pH5 pH5.5 pH6 pH6.5 Tampon 2.45 2.45 2.45 2.45 2.45 2.45 McIlvaine (ml) Amidon (1 0 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 mg/ml) en ml

T=7 pH7.0 2.45

T=8 pH8 2.45

T=8 pH9 2.45

0.2

0.2

0.2

Ractif I2/KI 0.04 (ml) Dure dincubation 5DO580 nm Extrait enzymatique

0.04

0.04

0.04

0.04

0.04

0.04

0.04

0.04

Incubation 5 min

200 l 200 l

200 l

200 l 200 l

200 l

200 l

200 l

200 l

Prendre les t=0 idem idem idem idem idem idem idem idem DO580 nm t=10 toutes les 10 s t=20 3 min Tracer la courbe f(A580) = f(t) pour chaque pH, et dterminer les vitesses initiales pour chaque pH. Tracer la courbe Vi = f(pH). Quel est le pH optimum des amylases du sorgho ? Tracer la courbe dactivit relative (%) = f(pH), en considrant 100 % dactivit au pH optimum.

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16

Reducing end

Figure 1. Mode daction des principales enzymes impliques dans lhydrolyse de lamidon.

Rfrences : Dicko , M. H. et al. (1999) Purification and characterization of -amylase from C. pilosa. Applied Microbiology and Biotechnology (Germany-USA). . 52, 802-805. Dicko, M. H. et al. (2000) Extraction, partial purification and characterisation of -amylase from G. klattianus. Bioresource Technology (England). 73, 183-185. Dicko, M. H. et al. (2001) Polysacharide hydrolases from leaves of B. senegalensis. Applied Biochemistry and Biotechnology (USA). 94, 225-241.

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TP. 5. Comparaison du dosage spectrophotomtrique des protines par la mthode de Bradford/Sedmak et par la mthode de Kjeldahl.
Principe Le dosage des protines en solution par la mthode de Bradford est bas sur linteraction en milieu acide, entre les protines et le Coomassie Brillant Bleu G250 (CBBG-250) dont la structure est la suivante :

Tan disque le CBBG-250 seul a une longueur donde maximale 450 nm ; on obtient en prsence des protines un dplacement du spectre vers le rouge (effet bathochrome) avec une longueur donde maximale 620 nm. Dune manire gnrale le CBBG-250 ragit plus spcifiquement avec les acides amins basiques (K, R, H) mais il interagit avec les autres acides amins. De ce fait plus la concentration en protine est leve, plus labsorbance 450 nm baisse, et labsorbance 620 nm augmente. Ainsi, le ratio de labsorbance 620 sur labsorbance 450 est fonction de la concentration protique.
A620 = f ([ protine )] A450

Le trac de cette courbe nous donne une droite de la forme y = ax (si on soustrait le blanc) ou une droite de la forme y = ax + b (sans soustraction du blanc). Le dosage des protines par la mthode de Kjeldahl est bas sur la minralisation totale de la matire biologique en milieu acide, suivie de la distillation de lazote sous forme dammoniac. En effet, le matriel biologique est minralis dans lacide sulfurique concentr (H2SO4) chaud (500-600C) pendant 5-10 heures en prsence du catalyseur de la digestion (mlange de K2SO4, CuSO4 et slnium ; ce dernier est de moins en moins utilis cause de sa toxicit). Le dosage de lazote seffectue selon les tapes suivantes :
Hydrolyse : H2SO4

Matriel biologique
Neutralisation : NaOH
+

NH4++ autres minraux NH3B(OH)3

Distillation : B(OH)3

NH4

NH3

A la fin de la minralisation lazote se trouve sous la forme minrale [(NH4+)2, SO42-]. Afin de pouvoir distiller lazote par entranement la vapeur deau, il faut dabord neutraliser lacide sulfurique et transformer lazote sous dammoniac gazeux (NH3). Au cours de la distillation
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18 lazote de lammoniac (Base de Lwis possdant un doublet lectronique) est entraner la vapeur deau et pig dans lacide borique : B(OH)3 qui est un acide de Lwis (possdant une orbitale vacante). Lammoniac est pig dans lacide borique travers une liaison dative : NH3 B(OH)3, est ensuite titr avec une solution faible (0.1N) dacide sulfurique. La quantification de lazote total permet dextrapoler pour estimer la quantit de protines. On admet dune manire gnrale que : la masse des protines vgtales = masse dazote x 6.25 la masse des protines animales = masse dazote x 5.75
Matriels et ractifs

Spectrophotomtre UV-visible Tubes essais , Centrifugeuse Bleu de Coomassie G250 Acide sulfurique concentr NaOH 10 N Phnophtaline (1% dans lthanol) Tablet de catalyse de minralisation : K2SO4+CuSO4 Acide perchlorique (HClO4) Srum Albumine bovin Acide borique (1.6 g /litre deau distile)

Modes Opratoires a. Prparation du bleu de Coomassie.

La solution de CBBG-250 (Sigma nr. B-1131) est prpare une concentration de 0.06% (p/v) dans une solution dacide perchlorique 3 % (p/v). La solution est laisse sous agitation pendant 24 h, puis filtre. La solution est ajuste pour donner une DO de 1.3-1.5 450 nm, laide dune solution dacide perchlorique 3 % (p/v). Le ractif, stock labri de la lumire, pourrait tre conserv pendant plus de 10 ans.
b. Prparation de la courbe dtalonnage pour le dosage des protines

La protine standard utilise pour le dosage des protines est le bovin serum albumin (BSA) une concentration de 50 g/ml dans leau distille). Tableau 1. Prparation de ltalon Tube blanc 1 2 3 4 BSA (50 g/ml) en 0 0.1 0.2 0.4 0.6 ml Eau distille 1 0.9 0.8 0.6 0.4 Ractif au Bleu de 1 1 1 1 1 Coomassie A620 A450 Aprs avoir ajout le ractif, les DOs sont lues dans les 2-5 min qui suivent. Tracer la courbe : A620 = f ([ protine )] A450

5 0.8 0.2 1

6 1 0 1

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c. Extraction des protines de lchantillon et dosage

- Solution dextraction : 7.5 g de Sodium Dodcyl Sulfate (SDS) sont mlangs 225 l de -mercapto-thanol, le tout complter 500 ml avec leau. La solution dchantillon est obtenue par dissolution de 5 g du matriel biologique dans 12.5 ml de la solution dextraction. Cette solution est ensuite centrifuge 5 000 rpm pendant 5 min. Aprs centrifugation, le surnageant recueilli. Filtrer le surnageant avec un papier filtre ou dfaut un papier lotus, juste pou retenir les particules solides et diluer le surnageant 10 fois. Le dosage seffectue comme suit : Tableau : dosage de lchantillon : Tube blanc 1 2 Echantillon (ml) 0 0.1 0.1 Solution dextraction contenant 0.01 0 0 le DNS Eau 0.990 0.9 0.9 Ractif au Bleu de Coomassie 1 1 1 A620 A450 - Calculer la concentration protique de lchantillon en vous basant sur dtalonnage dj tablie. - Pourquoi mettons dans le blanc le SDS dans les mmes proportions chantillon ?
d. Dosage des protines par la mthode de Kjeldahl

3 0.1 0 0.9 1

la courbe que votre

Dans un matras de Kjeldahl, sont introduits 0.2 g de farine, un tablet de catalyseur (1 g) et 10 ml dacide sulfurique concentr. Le tout est minralis pendant 5-10 heures jusquobtention dune solution limpide (verdtre). Le minralist est dilu avec 50 ml deau distille. A ce mlange, on ajoute quelques gouttes de phnophtaline et de la soude 10 N, jusqu lobtention dune coloration rose. Aprs cela, le matras est plac dans lappareil Kjeldahl pour la distillation. Le distillat est recueilli dans 50 ml dacide borique contenant quelques gouttes dhlianthine et de vert de bromocrsol. On effectue la distillation jusqu lobtention dun volume de distillat de 250-300 ml. Le distillat contenant lammoniac est titr en prsence de phnophtaline par lacide sulfurique 0.1 N. La teneur en protine pour un matriel biologique vgtal est donne par lquation :
(V 1 Vo) xNx14(0.001) x6.25 x100 PE Vo = Volume de H2SO4, ayant servi pour titrer le blanc V1 : volume de H2SO4 utilis pour le titrage de lchantillon N= normalit de lacide sulfurique PE= masse de prise dessai de lchantillon 6.25= coefficient de conversion 14 = poids molculaire de lazote Calculer la proportion de protine dans votre chantillon et comparer les rsultats avec la mthode dextraction en phase liquide suivie du dosage spectrophotomtrique. Commenter les rsultats. Selon vous quelle est la meilleure mthode ? % protines =

Rfrences.

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20 Bradford, M. (1976) A rapid and sensitive method for the quantization of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry (USA). 72, 248-254. Sedmak, J. J. and Grossbeg, S. E (1977) A rapid, sensitive, and versatile assay for protein using coomassie brilant blue G250. Analytical Biochemistry (USA). 79, 553-560. Zor, T., and Selinger, Z. (1996) Linearization of the Bradford protein assay increases its sensitivity: theoretical and experimental studies. Analytical Biochemistry. 236, 302-308. Dicko et al. (2002) Zymography of monophenolase and diphenoloase activities of polyphenol oxidase. Analytical Biochemistry (USA). 360, 336-339.

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TP. 6. Extraction et caractrisation des lipides


I. Gnralits

Les lipides sont des substances naturelles, constituants des structures cellulaires tels que les phospholipides, les glycolipides membranaires, lments de revtement (cires, cutines, etc. ), les substances de rserve , sources d'nergie cellulaire. On les appelle couramment huiles, graisses, beurres. La distinction entre graisses et huiles est purement arbitraire car base sur l'tat physique temprature ambiante : - huiles pour les liquides - graisses pour les solides et les ptes.
Les huiles sont souvent liquides 15C, les beurres fondent 25C, les graisses fondent aux tempratures comprises entre 35C et 40C et les suifs ou graisses animales fondent des tempratures suprieures 40C. On distingue habituellement : -les lipides simples (acides gras, glycrides, crides) - les lipides complexes (phospholipides, glycolipides). La graisse: Substance lipidique onctueuse, fondant entre 25C et 50C,dorigine animale ou vgtale. On parle de : - suif (graisse des ruminants) - Lard (graisse des porcines: porc, sanglier, rhinocros) -saindoux (graisse fondue des porcins) Elle est faite du tissu adipeux trs dvelopp chez certains animaux (porcins, ovins et autres ruminants), oiseaux (dindes, oies, canards, autruches, etc.), carnassiers (lions, tigre, panthre, lopards, etc,), homme (paume des mains, plante des pieds ), mammifres aquatiques (baleines, phoques), poissons (morues., hlicoptres), reptiles (boas, pythons, etc.) C'est la rserve lipidique mobilisable par l'intermdiaire du sang. C'est la source d'nergie efficace, servant d'isolant dans les tissus sous-cutans et autour de certains organes. La graisse est constitue d'esters d'acides gras et de glycrol. Les acides gras sont souvent saturs (tri-starines surtout). Le beurre de lait de mammifres reprsente 3 10% des matires grasses du lait. Sa composition varie selon son origine (ruminant, rongeur, flin, quids, zbus, ovins caprins, bovins etc.), Il est fait de 82 84% de triacyl-glycrols dont 1/3 d'oline, 4% de butyrine qui se transforme en acide butyrique d' odeur dsagrable. Les teneurs en huile des laits de vache et de la femme sont respectivement 3.7-5% et 3.7-10%. Les laits de brebis et chvres renferment respectivement 6.7% et 4.1%.

La margarine reprsentant 83% de lipides est faite de mlange de triacyl glycrols.


LES GRAISSES DE LA VIANDE

Le taux des lipides est variable selon les espces. -x < 5%. : poulet, cheval 5< x<100% : veau, lapin -10 < x < 20% : mouton, buf -20 < x< 30% porc, oie
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Tableau. Composition en huile de quelques olagineux

Graine ou noix Pomme cajou Pomme cannelle Thevetia (noix) Coco (noix) Huile de palmiste Jatropha curcas Karit Orange (grain) Pastque Ricin Gombo Oseille

Teneur en lipides (%) Graine ou noix 43-50 Blighia 23 Mangue 57-60.6 Corossolier 50-60 Rnier 49 Pulpe palme 30-52 Baobad (grain) 40-50 Calcdrat 30 Ssame 20-40 Citron 45-55 Courge 17-20 Gmelina 17-20 Melon

Teneur en lipides 54 3.5-12.5 25 37 44 10-30 45-60 45-60 30-60 20-50 11 20-50

Classification des lipides Les lipides se distinguent des autres composants de la matire vivante, tels les sucres et les acides amins, par une insolubilit totale ou partielle dans leau. Cette proprit physicochimique particulire fait que lon parle de milieu htrogne quand on dcrit la prsence de lipides dans un milieu aqueux. Par opposition aux composs hydrophiles et solubles dans leau, les lipides sont des composs de nature hydrophobe, solubles dans les solvants organiques tels lther, le chloroforme ou le benzne. Small [Small, 1968] a propos une classification des lipides selon leur comportement en prsence deau (voir Figure 1) base sur leurs proprits physicochimiques en phase aqueuse et aux interfaces air / eau ou huile / eau : - Les lipides non polaires, totalement insolubles dans leau et qui ne forment pas de films monomolculaires. On trouve dans cette catgorie les hydrocarbures ramifis ou insaturs ainsi que les composs terpniques (comme par exemple le carotne, le limonne, le graniol ou encore le squalne). - Les lipides polaires partiellement ou totalement solubles qui se subdivisent en trois classes : Classe I : les triacylglycrols, diacylglycrols et le cholestrol qui ne prsentent pas le phnomne de gonflement en prsence deau. Ils forment des films monomolculaires stables. Ces lipides peuvent former une mulsion en milieu aqueux. Le processus dmulsification augmente considrablement la surface de contact lipide-eau. In vivo, cette mulsification est stabilise grce par exemple la prsence de phospholipides alimentaires. Classe II : les phospholipides, monoacylglycrols et acides gras ioniss qui gonflent dans un systme aqueux. Les phospholipides peuvent dans certaines conditions former les liposomes. Il sagit de bicouches lipidiques closes, sphriques et concentriques, spares les unes des autres par des couches deau (Figure 1). Ces structures sont galement appeles vsicules et sont visibles au microscope lectronique [Bangham, 1964].
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Classe III : les sels biliaires et lysophospholipides (phospholipides avec une seule chane acyl) qui se prsentent dans leau sous forme de micelles ou de monomres. Lorsque la concentration en lipides polaires de classe III excde la concentration micellaire critique (CMC), ces lipides sorganisent de manire minimiser le contact entre leurs parties apolaires et le milieu aqueux : ils forment alors des micelles (Figure 1). Les parties polaires sorientent la priphrie, du ct de la phase aqueuse, et les parties hydrophobes sagrgent vers lintrieur. Les micelles sont en quilibre dynamique, cest--dire quil existe des changes rapides des molcules amphiphiles dune micelle lautre ainsi quavec les monomres prsents dans le milieu aqueux.

Totalement insolubles dans l'eau Ne forment pas de films monomolculaires

Lipides non polaires


Hydrocarbures paraffiniques et aromatiques, carotne, cholestane, etc...

Classe I
Forment des films monomolculaires stables: Triglycrides Diglycrides Cholestrol

Classe II
Forment des films monomolculaires stables: Phospholipides Monoglycrides Acides gras ioniss Prsentent le phnomne de gonflement

Classe III
Forment des films monomolculaires instables: Sels biliaires Lysophospholipides Prsent sous forme de micelles et de monomres

Lipides polaires

Ne prsentent pas le phnomne de gonflement

Figure 1. Reprsentation schmatique du comportement des lipides en prsence deau et linterface air/eau. Classification selon Small [Small, 1968 #6].

II. Principe de lextraction des lipides

Les lipides sont solubles chaud ou froid dans les solvants organiques tels que lther de ptrole, lther-dithylique, lhexane, lactone, lthanol, le chloroforme, le mthanol, etc. En pratique lhexane et lther de ptrole chaud sont les plus couramment utiliss. On utilise pour cela un solvant reflux dans extracteur de type SOXHLET. Les vapeurs chaudes du solvant traversent la mouture dans une cartouche, se condensent plus haut dans un rfrigrant et retombent dans la cartouche contenant la mouture. Il y a alors macration et extraction des huiles de la mouture. Lorsque le solvant remplit la cartouche, il y a siphonnage et le solvant retombe dans le ballon d'bullition. Le cycle continu jusqu' l' extraction complte de la matire grasse. Le solvant contenu dans le ballon est alors satur des huiles extraites. Il suffit alors d'vaporer le solvant
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24 laide dun appareil ROVAPOR pour recueillir les huiles et rcupr le solvant qui pourrait tre rutilis plusieurs fois. Matriels - Extracteur Soxhlet (chauffe ballon et cartouche) -Balance de prcision -Broyeur de type waring blendor - Dessiccateur - Hexane (500 ml) - Ssame ou Arachide

III. Protocole dextraction des lipides

La capacit de lhexane solubiliser est donc utilise pour les extraire au solvant organique. La dtermination des matires grasses est faite dans cette manipe selon la mthode d'extraction par le SOXHLET en utilisant l'hexane ou lther de ptrole comme solvant. Broyer dans un waring blendor les graines de ssame jusqu' l'obtention d'une mouture trs fine et trs homogne (= 0.3-0.5 mm). Peser avec prcision 50 g de la mouture en notant le poids exact dans la cartouche qui suffira pour l'extraction. Placer alors la cartouche dans le Soxhlet en l'ayant recouvert avec du coton ou avec un linge propre et sec. Peser le ballon qui servira recouvrir le solvant et y introduire 500 ml hexane. Raliser alors le montage de l'apparei1 en suivant le schma dcrit. Alimenter le rfrigrant avec le cryostat thermostat 0-4C. Avant de commencer la manipulation, faites vrifier le montage par l'assistant. Brancher alors la prise du chauffe -ballon et rgler la temprature 60C ( viter les surchauffes). Effectuer 4-6 siphonages. Dbrancher le chauffe-ballon. Arrter le cryostat. Dmonter lappareil (en prsence de l'assistant). Chasser alors par distillation la majeure partie du solvant l'aide de l'vaporateur rotatif (ROTAVAPOR) pour viter l'bullition de l'huile qui la longue pourrait modifier les indices d'acidit. Le ballon contenant les lipides est plac l'tuve pendant 30 min 103C, puis au dessiccateur pendant 30 min. Une srie de peses sont ralises, toujours aprs avoir sch le ballon l'tuve puis au dessiccateur jusqu' l'obtention d'un poids constant. Le poids des lipides est obtenu par la diffrence entre le poids final et le poids initial du ballon. (P1-P0) Teneur en matires grasses(%)= Prise d'essai P0: poids du ballon vide P1: poids du ballon contenant les lipides
IV. Dtermination des indices des huiles IV. 1. Indice de saponification

X100

Lindice de saponification dun corps gras est le poids de KOH exprim en milligramme pour neutraliser les acides gras provenant de lhydrolyse de 1g de ce corps gras. A un poids dtermin de ce corps graons on ajoute un volume connu et en excs de solution de titre de potasse. Il y a saponification et les acides gras librs se combinent avec la potasse pour donner un savon. En dosant la quantit de potasse non co,bine, on dduit celle qui a t absorbe par la matire grasse.
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25 Matriel : burette, elenmeyers Ractifs : KOH 1N, Huile extraite lors de ce TP, huile darachide, phnolphtaline 1 % dans lthanol, HCl 1 N. Protocole A :tmoin y a ajout 10 ml de KOH 1N B : 1.5 g dhuile extraite + 10 ml KOH C : 1.5 g dhuile extraite + 10 ml KOH Mlanger les suspensions et les chauffer jusqu lbullition. A la fin de la saponification, ajouter quelques gouttes de pp et doser avec HCl 1 N lexcs de potasse.

Indice de saponification

(Is)

= 56, 1 * t* (V0-Ve) Prise d'essai (g)

Vo, volume vers pour le tmoin, Ve, volume vers pour lchantillon

IV. 2. Indice diode

Le principe est bas sur la fixation diode (I2) sur les doubles liaisons thylniques (>C=C<) dun corps gras insatur. Lindice diode est dfini comme le poids diode exprim en gramme qui est fix par 100 g du corps gras considr.
H H I I

R C = C R + I2

R C -C R

Ractifs Ractifs de WIJS : 5 g I2 dans 100 ml thanol, + 5 g de HgCl2dans 100 ml thanol ; on mlange les deux solutions et les laisser reposer pdt 12 hrs

Chloroforme, ther ethylique ou CCl4, solution de Ki 25 %, solution de thiosulfate de sodium ( N2S2O3) 0.1 N, empois damidon 1 %.
Protocole Lindice diode est dtermine comme suit : on ajoute un volume connu diode un poids dtermin de matire grasse et on dose lexs diode par un dosage en retour laide dune solution sature de thiosulfats de sodium. On en dduit par diffrence la quantit diode fixe sur les lipides. A. erlen tmoin : 2.5 ml de chloroforme (ou ether ou ClCl4) + 40 ml de ractif de Wijs agiter B. 0.5 ml dhuile extraite durant le TP, 2.5 ml chloroforme, + 40 ml ractifs de Wijs, agite C. 0.5 ml dhuile darachide, 2.5 ml chloroforme, + 40 ml ractifs de Wijs, agiter

Boucher les erlens et les mettre lobscurit pendant 1h30 min en agitant momentanment.

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26 Ajouter 6 ml de solution diodure de potassium dans les erlens et agiter. Titrer par le thiosulfate 0.1 N liode prsent dans les erlens jusqu jaune claire. Ajouter quelques gouttes dempois damidon comme agent color et titrer jusquau virage lincolore.
IV. 2. Indice dacide

Lindice dacide est le nombre de milligrammes de KOH ncessaire pour neutraliser lacidit d1 gramme de corps gras ; cest la neutralisation des acides gras libres sans hydrolyser les liaisons esters des glycrides. Protocole : Peser dans un erlen 5 g dhuile extraite lors du TP, dans lautre 5 g dhuile darachide. Ajouter dans chaque erlen 10 ml dthanol et quelques gouttes de . Bien agiter et titrer la solution par le KOH 0.1 N. Question : 1. Calculer la teneur en huile de la matire vgtale que vous avez utilis. 2. Donner lquation de dtermination de lindice diode 3. Comparer les indices de saponification, dacidit et diode des corps gras.

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TP. 7. Etude cintique de lhydrolyse des triglycrides par la lipase de Pseudomonas Cepacia
Introduction
Les lipases ou triacylglycrol hydrolases [EC 3-1-1-3] font partie de la classe des hydrolases desters carboxyliques. Elles hydrolysent les fonctions ester des triacylglycrols longues chanes hydrocarbones, insolubles dans leau pour librer des acides gras (Figure 2). Les lipases sont galement des catalyseurs trs utiliss dans de nombreux procds biotechnologiques bass sur les ractions de synthse desters, dalcoolyse, dacidolyse et de trans- et inter-estrifications. Les lipases ont des origines varies : on les trouve dans le monde animal (organes digestifs, tissu adipeux, systme vasculaire et lymphatique, lysosomes) aussi bien que dans le monde vgtal (graines olagineuses) et microbien (bactries et champignons).

Figure 1. La lipase peut hydrolyser les liaisons carboxyl-ester dun triacylglycrol. On reprsente lalcool secondaire vers la gauche et le glycrol est dit sn-glycrol (i.e. numrotation strospcifique du glycrol). On numrote ensuite les carbones de haut en bas. Cette reprsentation est applique pour dterminer les formes stroisomres des (phospho)glycrides.

Spcificit des lipases La spcificit daction des lipases par rapport aux triacylglycrols fait appel trois notions diffrentes [Jensen, 1990 #1970]: La typoslectivit ou spcificit par rapport un type dacide gras donn. La rgioslectivit ou spcificit de position qui reprsente le pouvoir dhydrolyser prfrentiellement les esters primaires (en position externe sn-1 ou sn-3) ou secondaires (en position interne sn-2) des triacylglycrols (voir Figure 2). Lnantioslectivit cest--dire la capacit dhydrolyser prfrentiellement un

nantiomre par rapport lautre dans le cas dune molcule chirale (par exemple des triacylglycrols comportant trois acides gras diffrents). Dans le cas de molcules prochirales (triacylglycerols comportant trois acides gras identiques), la stroslectivit reprsente la
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capacit de discriminer un groupement strohtrotopique mais homomorphique par rapport lautre (positions sn-1 versus sn-3). Ainsi la lipase pancratique et la lipase de Rhizopus arrhizus sont rgioslectives pour les fonctions esters primaires des triacylglycrols, alors que la lipase de Candida rugosa nest pas rgioslective [Verger, 1976]. La lipase de Geotrichum candidum est typoslective puisquelle hydrolyse des liaisons ester avec un acide gras contenant une insaturation cis-9 et cela, quelle que soit leur position sur le glycrol [Charton, 1992 #5364]. Lhydrolyse de groupements esters en position sn-2 est catalyse par trs peu denzymes et seule la lipase de Candida antarctica a montr une prfrence nette pour cette position [Rogalska, 1993].

Principe de du dosage de lactivit lipolytique


Lactivit lipolytique est mesure quantitativement selon la mthode dcrite par [Kordel, 1991]. Cette activit est dose avec diffrents esters de p-nitrophnyle, hydrolyss en prsence dune lipase en p-nitrophnol et lacide correspondant. La libration du p-nitrophnol se traduit par lapparition dune coloration jaune dtecte 410 nm. Des mesures en cintique ont t menes 40 dans un spectrophotomtre aux cuves thermostates (Shimadzu UV-1205). La C solution ractionnelle contient un volume dune solution A et 9 volumes dune solution B ; la solution A correspondant au substrat 1 mM dans liso-propanol et la solution B tant une solution de Tris-HCl 100 mM, pH 8, contenant 0,25% (w/v) de polyvinyle alcool (PVA). Ce dernier compos permet la mise en mulsion du substrat et le maintien de la stabilit de cette mulsion. La vitesse de raction est calcule partir de la pente de l'absorbance en fonction du temps en utilisant un coefficient d'extinction molaire de 12 750 M-1 cm-1 pour le p-nitrophnol. Cette valeur est dtermine partir de l'absorbance de solutions standard de p-nitrophnol ralises dans la solution ractionnelle. Une unit enzymatique est la quantit d'enzyme capable de librer une mole de p-nitrophnol par minute dans les conditions dcrites cidessus. Pour chaque chantillon, l'activit donne correspond la moyenne de trois mesures d'activit. 410 nm
O O N+ OO R

lipase Tris-HCl pH 8

O N O+

R
O
-

2H
O-

ester de p-nitrophnyle

p-nitrophnolate

Mode opratoire: Prparer les solutions suivantes: Solution A. Tampon Tris-HCl pH 8, 50 mM contenant 0.44% (w/v) de Triton X-100, 0.073% de gomme arabique (w/v) Solution B. Dissoudre Paranitrophenyl palmitate (PNPC16) 5 mM dans de lisopropanol; Solution A+B. Il faut journalire prparer la solution C du substrat en mlangeant 9 mL de la A avec 1 mL de la solution B. Toutes les olutions sont conserves au frais (4 C).
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Solution E. Cest la sulution enzymatique: Dissoudre la lipase Amano de Pseudomonas Cepacia dans 50 mM de tampon Tris-HCL pH 8, pour obtenir une concentration finale de 10 g/mL. Adjuster la concentration de lenzyme pour avoir une activit raisonnable. Essai enzymatique : Dans une cuve de spectro mettre 1 mL du substrat (solution A+B). Dmarrer la raction en y ajoutant 0.1 mL de lenzyme et suivre lhydrolyse enzymatique en monitorant la libration du paranitro-phnolate 410 nm 15 s dintervalle jusqu 5 min. Le blank est obtenu en remplaant la solution enzymatique par de leau distille ou le tampon Tris-HCl. Tracer la courbe A410 = f(temps). Dterminer les vitesses initiales en calculant les pentes des courbes.

Etude de la vitesse de la raction en fonction de la concentration enzyme. Tableau 1. Prparation

Ractif /tube Solution A+B Tampon Tris_HCL pH8 Extrait enzymatique Prendre les DO410 nm toutes les 15 s

T=1 1 mL 90 L 10 L

T=2 1 mL 80 L 20 L

T=3 1 mL 70 L 30 L

T=4 1 mL 60 L 40 L

T=5 1 mL 50 L 50 L

T=6 1 mL 40 L 60 L

T=7 1 mL 20 L 80 L

T=8 1 mL 0 L 100 L

=0 idem idem idem idem idem t=10 t=20 t=30 t=--t= 5 min N.B. La solution enzymatique est additionne juste avant la lecture de la DO Tracer la courbe f(A410) = f(t) pour chaque concentration en enzyme, dterminer les vitesses initiales pour chaque concentration en enzyme. Prparer un blanc pour chaque concentration en substrat tout en remplaant lextrait enzymatique par le tampon Tris_HCL. Tracer la courbe Vi = f([enzyme)]. Dduire si lactivit est proportionnelle la concentration en enzyme. Cette prparation enzymatique est-elle pure ou non ?

Etude de la variation de la vitesse initiale en fonction de la concentration en substrat. Tableau 1. Prparation

Ractif /tube Solution A Solution B Extrait enzymatique Prendre les DO410 nm toutes les 15 s

T=1 990 L 10 L 100 L

T=2 980 L 20 L 100 L

T=3 970 L 30 L 100 L idem

T=4 960 L 40 L 100 L idem

T=5 950 L 50 L 100 L idem

T=6 940 L 60 L 100 L idem

T=7 920 L 80 L 100 L

T=8 900 L 100 L 100 L

=0 idem t=10 t=20 t=30 t=--t= 5 min

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N.B. La solution enzymatique est additionne juste avant la lecture de la DO Tracer la courbe f(A410) = f(t) pour chaque concentration en substrat, dterminer les vitesses initiales pour chaque concentration en substrat. Tracer la courbe Vi = f([PNP16)]. Dduire si cette cintique est Michalienne ou non Tracer la courbe 1/Vi = f(1/S) et calculer les paramtres cintiques Km et Vm. Prpare un blan pour chaque concentration en substrat tout en remplaant lextrait enzymatique par le tampon Tris_HCL. Dterminer la constante catalytique (Kcat) de lenzyme sachant que son PM est de 32 kDa tout en tenant compte de la concentration protique de la solution enzymatique.

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TP. 8. Etude cintique de la libration des acides gras par la lipase pancratique partir dhuile darachide
Introduction

L'extrait pancratique contient plusieurs enzymes digestives, parmi lesquelles on note la prsence de la lipase. La lipase est synthtise au niveau du pancras et dverse avec le suc pancratique dans le duodnum o elle participe l'hydrolyse des glycrides alimentaires. La lipase catalyse l'hydrolyse des esters du glycrol et d'acides gras chane longue. La lipase est une exoenzyme attaquant les liaisons esters situes en position externe des triglycrides sans toucher la position interne (ce sont les 2- mono glycrides qui sont absorbs par la paroi intestinale et transforms en chylomicrons lymphatiques). Le substrat de la lipase n'est pas une seule molcule, mais plutt un agrgat de molcules de lipides. Tandis que pour les enzymes agissant sur des substrats en solution aqueuse, la vitesse enzymatique dpend de la concentration du substrat, la vitesse de la lipase est lie directement la concentration de molcules de substrat dans l'interface. La lipase pancratique est une glycoprotine poids molculaire de 45000 50000, contenant deux isoenzymes presque identiques. Dans la prsente manipe, vous tudierez l'action de la lipase de porc ou de buf sur une mulsion huileuse. Les acides gras librs sont ensuite doss par titrimtrie avec une base.
* Matriel

Etuve 40C, Bain marie bouillant, pH mtre, Eprouvette gradue de 50 ml, pipette de 10 ml par binme, 1 erlen de 250 ml, 2 tubes essai, 1 petit bcher, 1biurette, 1 pipette de 10 ml, Agitateur magntique, l erlen de 100 ml Entonnoir, Papier filtre * Ractif Poudre l'actone de pancras de porc ou de buf : prendre 50g de pancras d'un porc ou d'un buf frachement tu dcouper en petits morceaux. Homogniser les morceaux dans un mixer ou dans un broyeur en utilisant de l'actone froid (-20C) dont le volume reprsente le double du poids du pancras ; ex: pour 5g de pancras 10 ml d'actone ). Filtrer la suspension l'aide d'un papier filtre et laver le dpt retenu sur le filtre, avec successivement les solvants frais suivants: -100 ml d'actone -50 ml d'actone + 50 ml d'ther thylique -100 ml d'ther thylique. Scher le dpt du lavage avec du papier filtre, puis laisser scher l'air libre. Cette poudre l'actone peut tre stocke basse temprature pendant longtemps (des mois) sans perte d'activit lipasique. CaCL25 mM CaCL2 0,07 M (1,1 g /1 00 ml ) NaCL 3 M ( 34,8 g/200 ml) Na-taurocholate 0,027 M ( 2,9 g/ 200 ml) Na-doxycholate Huile d'arachide, Na OH 10 mM HCL 10 mM Phnolphtaline 1% dans l'alcool. * Manipulation Peser en collaboration avec un autre binme, 1,5 g de poudre l'actone de pancras dans un petit bcher. Y ajouter 40 ml de CaCL2 5 mM. Agiter pendant 15 min 4C, l'aide d'un agitateur magntique et filtrer ensuite la solution. Doser les protines de cette solution avec la mthode de Bradford/Sedmak comme dcrit au TP 6. Le filtrat alors obtenu est susceptible de contenir la lipase pancratiqne, l'amylase pancratique le trypsinogne et la trypsine. Pour l'obtention d'une mulsion huileuse, peser dans un erlen 2,5 g de Na-desoxycholate, y ajouter 50 ml d'eau permute. Aprs la dissolution du desoxycholate, ajouter: 5 ml d 'huile d'arachide, 10 ml NaCl 3 M, 5 ml CaCL2 0,075 M , 10 ml Na-taurocholate 0,027 M
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32 Bien agiter et vrifier que le pH soit entre 7,5 et 8,0. Si ce n'est pas le cas, ajouter de l'HCL 10mM pour l'amener dans ce trajet. Placer l'erlen dans une tuve pralablement amene 38 C. Laisser votre solution enzymatique incuber pendant 5 min 38 C avant de commencer la raction. Pendant ce temps, numrotez 7 tubes essai. A t = 0 ajouter 10 ml de la solution enzymatique dans l'erlen contenant l'mulsion huileuse. Bien agiter, et prlever t = 5 min 10 ml de l'mulsion dans le tube essai n 1. Porter le tube au bainmarie immdiatement pendant 5 minutes. Refroidissez-le ensuite sous le robinet, transvaser le contenu dans petit bcher, ajouter 1- 2 gouttes de phnolphtaline et titrer jusqu' au virage rouge avec la soude 10 mM. A t = 10 minutes prendre le deuxime chantillon, t = 25 mn le troisime et, ainsi de suite de dix dix jusqu' 60 minutes. Le tmoin est t=0 est la solution huileuse + 10 ml CaCL2 5 mM. * Questions 1. Calculer la quantit d'acides gras librs dans chaque tube en millimoles. Construire la courbe reprsentative de la quantit d'acide libr en fonction du temps. 2. En dduire la vitesse de production d'acide, exprim en millimoles par minute par ml de solution enzymatique 3. Calculer lactivit spcifique ( mol dacide gras librs/min/mg de protine) de lenzyme en tenant compte de la concentration protique de lextrait actonique.

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TP. 9. Fractionnement dun homognat de pancras et caractrisation des fractions obtenues


Introduction et principe

Une cellule contient plusieurs structures complexes, comme le noyau, les mitochondries, les appareils de Golgi, les peroxysomes, lysosomes, ribosomes, etc. etc... Tous ces organites sont constitus de lipides, de protines et des polysaccharides; les acides nucliques ne sont rencontrs que dans quelques organites seulement (noyau, ribosomes, mitochondries) . Il existe plusieurs mthodes de fractionnement du matriel cellulaire. En suivant des procds diffrents, on peut isoler soit des noyaux, soit des mitochondries, soit un autre organite. Un tel fractionnement permet par exemple la localisation d'une certaine activit enzymatique ou la dtermination de la composition de l'organite isol. En appliquant des mthodes et techniques diffrentes, on peut purifier des enzymes, des lipides, des saccharides ou des fragments d'acide nucliques, dans le but d'tudier leurs proprits in vitro. De telles investigations ont beaucoup contribu la comprhension du fonctionnement des cellules et des organismes vivants. Dans ce TP on utilisera la technique de fractionnement assez gnrale pour sparer les constituants cellulaires, savoir la mthode de Schneider. Le tissu est homognis par la destruction des cellules qui librent leur contenu. Lhomognat est ensuite trait par l'acide trichloroactique, qui permet de sparer deux fractions, une soluble et l'autre insoluble. La fraction TCA soluble contient des petites molcules contenues dans le cytoplasme, comme les mono- et oligosaccharides, les acides amins, les peptides etc . La fraction TCAinsoluble contient essentiellement les protines, les acides nucliques, et les lipides. Les lipides sont ensuite limins par une extraction l'alcool. On spare les acides nucliques des protines par un traitement chaud avec le TCA, qui les solubilise en les dnaturant. Le culot rest insoluble, est considr comme renfermant les protines totales de l'homognat .
Matriel

Balance, Broyeur , Une paire de ciseaux, Chronomtre, Centrifugeuse, Glacire, Bain marie bouillant, Spectrophotomtre, tuve 70- 80C, Agitateur vortex par binme, 3 petits bchers, 1 erlen de 50 ou 100 ml, Entonnoir, Pice de tissu propre, Baguette de verre, Pipettes pasteur de 5 ml, Eprouvettes gradues de 50 ml et 25 ml, tubes de centrifugation , 13 tubes essai .
Ractifs

Pancras de porc ou de boeuf , Glace , Acide trichloroactique ( TCA) 5 % , Acide trichloroactique (TCA) 10 %, Ethanol 96 % ou alcool 96 % / ther thylique I : I ( v/v) Na OH IN, Ractif de Sedmak, Ractif la dyphnylamine (A prparer juste avant utilisation, ne se conserve pas ) : Diphnylamilne 250 mg + Acide actique 25 mg + H2SO4 concentr 0,7 ml (ajout aprs la dissolution complte des cristaux) Srum albumine bovin, 25 g/ml pour utilisation comme protine standard.

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Schmas du fractionnement
10 g de pancras + 90 ml H2O

Homognat de volume X

10 ml + 10 ml TCA 10% froid (repeter)

Surnageant S1 contenant des petits peptides et des sucres

Culot N1

Culot 1+ 16 ml alcool 96 (repeter)

Surnageant S2 contenant des lipides

Culot N2

Culot 2 + 10 ml TCA 5%, incuber 15 min 90C

Surnageant S3 contenant des acides nucliques

Culot N3 contenant les protines Dissolution dans du NaOH 1 N

Protines en solution doser par le ractif au Bleu de Coomassie G250 TP. Licence Biochimie, DUT-CQA-2me Anne, Pr. M. H. DICKO

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Manipulation Fractionnement du pancras.

Mettre pralablement refroidir dans le rfrigrateur ou dans de la glace, 500 ml d'eau distille ou permute, le TAC 5%, le TAC, 10%, erlens de 50 ou 100 ml et un entonnoir. 1. Homognisation L 'homognisation du pancras du porc ou du buf sera ralise avec un broyeur de cuisine. Peser en collaboration avec un autre binme dans un petit bcher, 10 g de pancras congel et dcouper le tissu en petits morceaux dans le rcipient du broyeur en y ajoutant 90 ml d'eau distille froide. Broyer le pancras sans le surchauffer le mlange. Complter ainsi 4 broyages d'une minute. Filtrer 1homognat laide d'une pice de tissu propre en utilisant un entonnoir et un erlen frais. Mesurer le volume obtenu aprs filtration. Garder l'homognat au froid. 2 .Prcipitation au TCA froid

Aprs agitation l'aide d'une baguette de verre, prlever 10 ml d'homognat avec une pipette coulement rapide et les mettre dans un tube de centrifugation refroidi dans de la glace. Ajouter, sous agitation 10 ml de TCA 10%; Laisser 10 min dans la glace en agitant de temps en temps. Equilibrer votre tube contre celui d'un autre binme en y ajoutant quelques gouttes de TCA 5%. Centrifuger les mlanges pendant 10 min 8000 rpm. Dcanter trs doucement les surnageants dans un tube essai portant votre nom et ce qu'il contient et le conserver dans de la glace. Si le culot n'est pas bien form, il faut enlever le surnageant par la pipette pasteur, en ayant soin de ne pas perturber le culot. A l'aide d'une baguette de verre, remettre le culot en suspension dans 8 ml de TCA 10% froid et effectuer une deuxime centrifugation pendant 8 min 8000 rpm Ajouter les nouveaux surnageants aux prcdents. Cette fraction TCA soluble froid contient les composantes cellulaires hydrosolubles tels que les amino-acides, petits peptides, oses simples et oligosacchalides. Vous pourrez le vrifier par des tests caractristiques. 3. Extraction des lipides Ajouter dans un tube contenant le culot 16 ml d'alcool 96% ou d'un mlange d'alcool 96%/ther thylique 1/1 (v/v). Remettre le culot en suspension et maintenir 10 minutes temprature ambiante en agitant frquemment. Centrifuger 5 min 8000 tours / minute Dcanter le surnageant qui a une coloration jaune dans un petit bcher pralablement tar. Remettre le culot en suspension dans 16 ml dalcool ou alcool ther thylique, puis centrifuger pendant 5 min 8000 rpm. Runir les surnageants. Aprs vaporation de l'alcool (ou alcool/ther thylique) par chauffage dans l'tuve 70 C, vous vrifiez la prsence d'un rsidu lipidique au fond du bcher. En admettant que tous les composs lipidiques sont extraits par cette technique, donner la quantit de lipides par gramme de pancras. 4. Solubilisation des acides nucligues par TCA chaud Reprendre le culot (protines + acide nucliques) par 6 ml de TCA 5% et le remettre en suspension l'aide d'un agitateur. Verser le liquide dans un tube essai et rincer le tube de centrifugation 2 fois avec 1 ml de TCA 5%. Portez cette suspension dans un bain-marie thermostat 90C pendant 15 min en agitant frquemment. Refroidir sous courant d'eau froide, transvasez dans le tube de centrifugation, et, ayant rinc le tube essai avec 1 ml de TCA 5%, centrifuger pendant 8 min 8000 rpm. N'oubliez pas d'quilibrer les tubes de centrifugation !
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36 Dcanter soigneusement le surnageant dans une prouvette de 20 ml et conservez-le. Remettre le culot en suspension dans 10 ml de TAC 5% et centrifuger nouveau. Ajouter le surnageant celui dans l'prouvette et noter le volume obtenu. Cette solution contient les acides nucliques.

5. Solubilisation et dosage des protines Les culots, essentiellement protiques, sont remis en suspension dans 2 ml NaOH 1 N. Ajouter 18 ml deau. Agiter assez longtemps pour obtenir une bonne solubilisation, puis verser dans un tube essai et le placer dans de la glace. Cette solution est dite contenir les protines totales . Centrifuger la solution pour recueillir le surnageant et doser les protines par la mthode de Bradford comme prcdemment fait au TP 6 en utilisant le srum albumine bovin comme standard. Mlanger en duplicate 1 ml de la solution protique avec 1 ml du ractifs de Sekmak (Bleu de Coomassie G250) et lire les DO 450 et 650 nm. 6. Mise en vidence des acides nucliques Verser 10 ml de la solution contenant les acides nucliques dans un petit bcher et y ajouter l5 ml d'alcool froid. Ensuite enrouler les fils de l' ADN sur une baguette de verre, les transvaser dans un tube essai contenant l ml d'eau, et y ajouter 4 ml de ractif la diphnylamine. Placer le tube au bain-marie bouillant pendant 10 min et observer la coloration.
Question 1. Calculer la quantit de lipides par gramme de pancras. 2. Dterminer la concentration initiale de la solution inconnue de protine en l'exprimant en mg/ml. Donner le poids des protines (%) dans le pancras. 3. Admettons que vous avez fait un dosage de l'ADN isol du pancras et vous avez trouv une concentration de 0,05 mg/ml, Calculer la quantit d'ADN par gramme de pancras.

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TP 10. Electrophorse des protines I. Introduction
L'lectrophorse est une technique biochimique de sparation fonde sur le fait que des molcules portant des charges lectriques migrent des vitesses diffrentes lorsqu'elles sont places dans un champ lectrique. Lide dutiliser cette caractristique pour sparer des molcules remonte la fin du dix-neuvime sicle grce aux travaux du biochimiste sudois Arne Tiselius (1902-1971), prix Nobel de chimie en 1948. Il a russit le premier sparer par cette technique les protines contenues dans des liquides biologiques complexes comme le srum sanguin et le lait. Aujourdhui, llectrophorse est devenue une technique de routine dans les laboratoires o on lutilise pour sparer notamment les protines et les acides nucliques. Llectrophorse des protines peut tre ralise sur des supports varis, notamment sur gel de polyacrylamide ou sur gel dagarose selon les informations recherches. Principe de llectrophorse Selon le principe de llectrostatique lorsquun ion de quantit de charge q est plac dans un champs lectrique E , une force F sexerce sur cet ion avec une intensit donne par lquation : Flectrique = qE Lion peut tre assimil une sphre de rayon r en mouvement dans un fluide de viscosit . De ce fait une force de friction Ffriction soppose la force lectrique F. Par dfinition Ffriction= 6rv O v = vitesse de migration de lion, r = rayon de lion, = viscosit du milieu. A lquilibre lion migre avec une vitesse constante de sorte que Flectrique = Ffriction do

v=

qE 6 r

La mobilit lectrophortique est donne par lquation :

v q = E 6 r

Cette quation nous montre que la mobilit lectrophortique est principalement fonction de la charge et de la taille de lion. Cela est valable pour toutes les techniques dlectrophorse. Les principales variantes de llectrophorse des protines sont les suivantes :

SDS-PAGE
L'une des variantes les plus rpandue de l'lctrophorse est la SDS-PAGE, utilise pour sparer les protines en fonction de leur poids molculaire. Les protines sont dnatures par du S-dodecyl sulfate, molcule trs fortement charge ngativement. Les charges ngatives du SDS noient compltement les charges propres de la protines qui n'interviennent alors plus. La charge de l'ensemble molcule dnature/SDS (et donc sa vitesse de migration) dpend alors uniquement de la longueur de la chane protique. S'il n'y avait pas le gel, toutes les protines ainsi traites migreraient la mme vitesse. Mais la prsence du gel ralentit les grosses protines, elles se rpartiront le long du trajet de migration en fonction de leur poids molculaire. C'est cette technique qui est mise en uvre dans les automates d'analyse mdicale. Sparation par le pH ou Electrophorse dIsolectrofocalisation (IEF) Cette variante consiste imposer un pH prcis au gel de migration. Les molcules dont le pKa est gal au pH, neutres, ne migreront pas, les molcules avec un pKa infrieur, charg ngativement migreront vers l'anode, les autres vers la cathode. Une telle technique prsente l'inconvnient d'obliger de dposer l'chantillon au milieu du gel, ce qui pose divers problme. Toutefois, un perfectionnement consiste utiliser un gel dont le pH varie d'une extrmit l'autre. La molcule migrera alors le long du gel jusqu' ce que le pH local soit gal son pKa. Elle deviendra alors neutre et arrtera de migrer. Les protines se rpartiront alors le long du gel en fonction de leur pKa. Il est ici possible d'utiliser un gel vertical comme dcrit dans le principe. Lune des applications de cette technique est son utilisation pour la technique de ZYMOGRAPHY qui consiste la dtection in-gel des enzymes. La technique de zymography repose sur la raction spcifique in-gel de lenzyme avec son substrat. Lemplacement de lenzyme sur le gel est dtect grce la rvlation des spots colors du produit. TP. Licence Biochimie, DUT-CQA-2me Anne, Pr. M. H. DICKO

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Electrophorse bidimensionnelle
Le gel est un milieu solide qui peut tre manipul. Il est alors possible d'appliquer dessus successivement plusieurs techniques d'lectrophorse pour obtenir des lectrophorses bidimensionnelles. L'chantillon est dpos dans un seul puit et une premire variante est applique. Puis la migration acheve on bascule le gel d'un quart de tour et on effectue une migration perpendiculaire la premire en utilisant une deuxime technique. Les molcules, spares selon deux critres, se rpartissent donc dans un systme a deux coordonnes ce qui permet une meilleure rsolution : si beaucoup de molcules ont un poids molculaire ou un pKa proche, les molcules ayant les deux paramtres en commun sont rares. Avec cette variante, il est possible de travailler sur des extraits cellulaires complets. II. Electrophorse sur gel de polyacrylamide en prsence du sodium dodcyl sulfate (SDS-PAGE) Ce type d'lectrophorse peut tre ralis en utilisant des systmes tampons dissociant ou non dissociant, continus ou non continus. L'agent dissociant le plus utilis est le dtergent anionique; Sodium Dodecyl Sulfate (SDS). Le SDS de formule CH3-(CH2)11-S03-Na+, est le dtergent le plus utilis en lectrophorse. Il a trois fonctions: 1) dissocier les protines agrges peu solubles ou hydrophobes 2), confrer une charge ngative toutes protines et enfin 3) permettre une sparation des protines en fonction de leur gomtrie, masse molaire et forme. Il se fixe sur les protines selon un rapport de masse relativement constant (1 ,4 g de SDS par g de polypeptide) et les transforme en polyanions. La dissociation dnaturation intervient sous l'action combine des rducteurs des liaisons S-S tels que le -mercaptothanol ou le dithiothreitol. La protine prend ainsi une forme allonge ("random coil"), dont la longueur est proportionnelle la masse molculaire. La charge ngative permet la migration des protines vers l'anode, mais les molcules sont spares uniquement par effet de tamis molculaire. Les marqueurs protiques de faible poids molculaires suivants sont souvent utiliss pour estimer la masse molculaire des enzymes: aactalbumine (14,4 kDa), inhibiteur de la trypsine (20, 1 kDa), anhydrase carbonique (30 kDa), ovalbumine (43 kDa), srum albumine bovin (67 kDa) et la phosphorylase b (94 kDa). La droite de calibration a t construite selon le modle de Fergusson (Log(Mr) = a + b.Rf). La sparation se fait sur deux gels : Un gel de concentration (stacking gel) et un gel de sparation (resolving gel).

L'utilisation en lectrophorse de gels de concentration et de sparation de concentrations en polyacrylamide non convenable peut aboutir 2 situations diffrentes : - Elimination des protines incapables de pntrer dans le gel, dans le cas des gels trs concentrs.Absence de sparation des protines de petite taille, migrant avec le front.Entre ces 2 extrmes, les protines peuvent tre rsolues diffremment selon la concentration en polyacrylamide du gel de sparation: En faisant varier la concentration d'acrylamide et methylne (bis acrylamide), on obtient des mailles trs diffrentes par polymrisation.

Figure 1. Description de leffet de SDS et agents rducteurs tels que le -mercapto-thanol sur les protines

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Exemple de prparation des gels en fonction du poids molculaire des protines sparer

(Polyacrylamide) (%) 15-20 10-15 5-10 5 2-5

Poids molculaire (Kd) 10-40 40-100 100-300 -300-500 PM>500 acrylamide CH2=CH-CO-NH2 + mthylne bis acrylamide (CH2=CH-CONH)2CH

Mcanisme de la formation du rseau (Network) par polymrisation de lacrylamide en prsence du biscrylamide qui cre les ponts.

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Figure 2. Description du dispositif de la cuve dlectrophorse

Figure 2. Description du mcanisme de la mobilit des protines. Les petites molcules migrent plus rapidement que les grosses molcules TP. Licence Biochimie, DUT-CQA-2me Anne, Pr. M. H. DICKO

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Figure 3. Exemple dun gel dune lectrophorse verticale

III. Prparation dun gel SDS-PAGE III.1. Matriel :

- Separating gel : gel de sparation - Stacking gel : gel de concentration - Butanol satur en H2O - Running buffer 1X : tampon de migration - Laemmli loading buffer : tampon dapplication - -Mercaptoethanol - Bleu de Coomassie R250 - Solution dcolorante
II.2 Solutions prparer: Separating gel buffer (pour 100ml, garder temprature pice) : 18.17 g Tris-base, 2 ml SDS 20 % ; ajuster le pH 8.8 avec du HCl 12 N, complter le volume 100ml Stacking gel buffer (pour 100ml, garder temprature pice) : 6.06 g Tris-base, 2 ml SDS 20%, ajuster le pH 6.8 avec du HCl 12 N, complter le volume 100 ml Acrylamide (30%) bisacrylamide (0.8%) (pour 250ml, garder 4C) : 75 g acrylamide, 2 g bisacrylamide, complter le volume 250 ml filtrer et garder 4C dans une bouteille brune ou papier daluminium Eletrodes buffer : tampon des lectrodes 10X 25 mM Tris, 192 mM Glycine, 0.1% (w/v) SDS, pH 8.3. Ne pas adjuster le pH. Stock 10X -10 g SDS, 30 g Tris + 144 g Glycine, adjuster le volume 1000 ml. Pour usage diluer 10 fois cette solution, c.a.d : 900 ml H2O + 100 ml stock Stock sample buffer : Tampon de lchantillon
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42 60 mM Tris-HCl, pH 6.8, 2% SDS, 10% glycerol, 0.025 % bromophenol blue H20..4.8 ml 0.5 M Tris-HCl, pH 6.8.1.2 ml 10% SDS.2 ml Glycerol..1 ml 0.5% Bromophenol blue (w/v)..0.5 ml La solution SDS-reducing buffer est prpare journalirement en mlangeant 50 l de mercaptoethanol (SH-CH2-CH2OH) 950 l du stock samplebuffer. Eventuellement conserver cette solution 30C.
*Lacrylamide et le bisacrylamide sont de puissants agents neurotoxiques, il faut les peser avec un masque. II.3. Montage dun gel SDS-PAGE Separating gel

10% H2O 62 ml Acrylamide 30%/bis 0.8% 48 ml Separating gel buffer 38 ml APS 10 % 2.24 ml TEMED 100 l Volume total* 150.34 ml *Effectuer les mlanges selon le volume dsir

12.5% 15% 50 ml 36 ml 60 ml 74 ml 38 ml 38 ml 2.24 ml 2.24 ml 100 l 100 l 150.34 ml 150.34 ml en tenant compte du volume total.

Pour sealer le bas : 1ml + 14l APS 10% + 6l TEMED

Stacking gel

H2O 1 ml 20 ml Acrylamide 30%/bis 0.8% : 3ml Stacking gel buffer 4.44 mll APS 10% 280 l TEMED 50 l
Running buffer 10X (pour 1L) : diluer 10 fois dans leau distille avant utilisation.

10 g SDS 30 g Tris 144 g Glycine ne pas ajuster le pH et filtrer.


Prparation de lchantillon

Prendre 100 l de la solution de lchantillon convenablement dilu et lajouter 100 l de solution tampon de lchantillon sample buffer contenant du -mercaptothanol, dans un tube Eppendorf. Si la solution lchantillon est trs concentre, dissoudre lchantillon laide du sample buffer . Chauffer le tube au bain marie pendant 5 min. Centrifuger le tube et utiliser le surnageant pour llectrophorse. Certains chantillons, notamment les extraits bruts contiennent beaucoup de sels ou dautres petites molcules qui interfrent avec la migration. Pour cela, il est
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43 ncessaire deffectuer une dialyse (Figure 3) afin de desalter lchantillon avant llectrophorse.

Avant quilibre
Figure 3. Principe de la dialyse Montage dun gel SDS-PAGE Mthode: 1. Monter les vitres du gel laide du montage. 2. Prparer la solution de separating gel . 3. Sealer le bas du gel. 4. Couler le separating gel selon la concentration du gel dsir et garder le restant de la solution dans le contenant pour voir quand la polymrisation sera complte. 5. Rajouter un peu de butanol (satur en H2O) pour galiser le gel. 6. Laisser polymriser environ 45 min. 7. Enlever compltement le butanol. 8. Placer le peigne et couler le stacking gel. 9. Laisser polymriser au moins 10 min. 10. Enlever le peigne et monter les gels sur la cuve dlectrophorse pour la migration. 11.Ajouter du running buffer 1X entre le gel et le montage jusqu ce quil soit rempli et en mettre dans le montage environ 2 cm. NB. Si on utilise un seul gel, il faut mettre une vitre de lautre ct et le remplir galement de running buffer.

A lquilibre

12.Laver les puits avec le running buffer laide dune seringue. 13.Pour loader les chantillons, rajouter du Laemmli loading buffer (contenant 10% SDS et du 2-mercaptothanol) dans les chantillons pour avoir une concentration finale de loading buffer de 1X. 14.Chauffer les chantillons 100 C pendant 5 min puis centrifuger les chantillons 30 sec pleine vitesse. 15.Remettre les chantillons dans le bloc chauffant pour loader les chantillons. Nota bene: Il faut loader la mme quantit dchantillon dans chaque puits.
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44 16.Faire migrer le gel 200V, 150 mA et 100W pendant environ 45 min ou jusqu ce que le bleu se rende au bas du gel. 17.Arrter la migration et dfaire le montage 18.Coloration du gel au Bleu de Coomassie: Mettre le gel dans un contenant avec du bleu de Coomassie et laisser agiter pendant au moins 1h, le temps que le bleu pntre dans le gel. 19.Dcoloration du gel: Remettre la solution colorante dans le contenant initial, puis ajouter du vieux destaining et agiter un peu pour enlever lexcs de colorant. Le jeter dans lvier puis remettre du destaining et laisser agiter jusqu ce que les bandes apparaissent. 20. scanner les gels
IV. Diffrentes techniques de coloration et dcolorations : IV. 1. Coloration au Bleu de Coomassie : Aprs la migration lectrophortique, les gels sont tremps successivement dans les solutions suivantes

a) Fixation des protines: acide trichloroactique 20 % (20 min, 20C). Etape non ncessaire pour I'SDS-PAGE. b) Lavage 1: mlange mthanol-acide actique-eau 30/10/60 ( 2 min, 20C) ou dfaut thanolacide actique-eau 30/10/60 c) Coloration: Bleu de Coomassie Brillant R250 0,1 % (p/v) dans un mlange mthanol- acide actique-eau 40/10/50 (10 min, 50C). Du CUSO4 0,1 % (p/v) est additionn pour l'IEF. d) Lavage 2: solution b. Trois fois pour I'SDS-PAGE et Native-PAGE, une fois pour l'IEF . e) Prservation: glycrol 5% (5 min, 50C)
Coloration au nitrate d'argent (AgNO3) Aprs la migration lectrophortique, les gels sont tremps successivement dans les solutions suivantes:

a) Fixation des protines: acide trichloroactique 20 % (20 min, 20C). Pas ncessaire pour I'SDS-PAGE. b) Lavage 1. Mlange d'thanol-acide actique-eau millipore 50/10/40 (2 min, 50C) c) Lavage 2. Mlange d'thanol-acide actique-eau millipore 10/10/80 (2-4 min, 50C). 2 trempages successifs. Etape non ncessaire pour I'SDS-PAGE d) Sensibilisateur: glutardiadhyde 8,3 % dans l'eau millipore (6 min, 50C) e) Lavage 3.2 trempages successifs de la solution b (3-5 min, 50C). Etape non ncessaire pour I'SDS-PAGE f) Lavage 4: eau millipore (2 min, 50C). 2 trempages successifs. g) Coloration au nitrate d'argent: AgNO3 0,5% (p/v) pour l'IEF et Native-PAGE, 0,25% (p/v) pour I'SDS-PAGE (10-13 min, 40C). h) Lavage 5: eau millipore (0,5 min, 30C). 2 trempages successifs.
i) ii)

Dveloppement: formaldhyde 0,015 % (v/v) dans du carbonate de sodium 2,5 % (p/v), pendant 0,5 4 min, 30C. j) Lavage 6: acide actique 5 % (2 min, 50C)

k) Prservation: mlange acide actique-glycrol-eau 10/5/85 ou 10/10/80 (3 min, 50C). Etape non ncessaire pour l'IEF. Aprs rvlation, les gels sont photographis ou scanns, puis
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45 conservs 4C au rfrigrateur dans des boites de ptris, contenant un mlange de glycrolacide actique-eau millipore 5/10/85.

Rfrences :

Laemmli, U. K. (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227, 680-685 Garfing, D.E. ( 1990) One dimensional gel electrophoresis. Methods Enzymol. 182, 425-441. Schaggerard, Hermann, and Gebhard von Jagow (1987) Tricine sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis for the sparation of proteins in range from 1 to 100 kDa. Anal Biochem. 166, 368-379. DICKO, M. H., HILHORST, R., GRUPPEN, H., TRAORE, A. S., LAANE, C., van BERKEL, W. J. H. and VORAGEN, A. G. J. (2002) Comparison of content in Phenolic compounds, polyphenol oxidases and Peroxidases in grains of fifty sorghum varieties from Burkina Faso. Journal of Agricultural and Food Chemistry (USA). 50, 3780-3788. DICKO, M. H., HILHORST, R., GRUPPEN, H., LAANE, C., van BERKEL, W. J. H. and VORAGEN, A. G. J. (2002) Zymography of momophenolase and o-diphenolase activities of Polyphenol oxidase. Analytical Biochemistry (USA). 360, 336-339.
DICKO, M. H., GRUPPEN, H.; TRAORE, A. S.; van BERKEL, W. J. H. and VORAGEN, A. G. J. (2006). Effects of germination on amylases and phenolics related enzymes in fifty sorghum varieties grouped according to food-end use properties. J. Sci. Food Agric. (Sci, England). Vol. 86, 1-11. In press

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