Вы находитесь на странице: 1из 20

Coordenao Geral de Acreditao

ORIENTAO SOBRE VALIDAO DE MTODOS ANALTICOS


Documento de carter orientativo

DOQ-CGCRE-008
Reviso 04 JUL/2011

DOQ-CGCRE-008 Reviso 04 Jul/2011

Pgina 01/19

SUMRIO
1. Objetivo 2. Campo de Aplicao 3. Responsabilidade 4. Documentos Complementares 5. Siglas 6. Definies 7. Introduo 8. Validao 8.1. Planejamento da validao 8.2. Parmetros de validao 8.2.1. Seletividade 8.2.2. Linearidade 8.2.3. Faixa de trabalho e faixa linear 8.2.4. Limite de deteco 8.2.5. Limite de quantificao 8.2.6. Tendncia/recuperao 8.2.6.1. Materiais de referncia certificados 8.2.6.1.1. Erro relativo 8.2.6.1.2. ndice z 8.2.6.1.3. Erro normalizado 8.2.6.2. Ensaios de recuperao 8.2.6.3. Preciso 8.2.6.3.1. Repetitividade 8.2.6.3.1.1. Limite de repetitividade 8.2.6.3.2. Preciso intermediria 8.2.6.3.3. Reprodutibilidade 8.2.6.3.3.1. Limite de reprodutibilidade 8.2.6.3.4. Comparao da preciso entre mtodos 8.2.6.3.5. Avaliao da aceitabilidade das caractersticas de preciso de um mtodo de anlise 8.2.6.3.5.1 Interpretao 8.2.6.3.5.2 Clculo do valor de Horwitz 8.2.6.4. Robustez 8.2.6.5. Comparaes interlaboratoriais 9. Documentao de mtodos validados 10. Documentos de Referncia 11. Histrico da Reviso ANEXO Relao dos participantes da elaborao deste documento.

DOQ-CGCRE-008 Reviso 04 Jul/2011

Pgina 02/19

1 OBJETIVO Este documento tem como objetivo auxiliar os laboratrios na tarefa de demonstrar que um mtodo analtico, nas condies em que praticado, tem as caractersticas necessrias para a obteno de resultados com a qualidade exigida. Este documento no pretende abordar todas as tcnicas aplicveis validao de mtodos analticos, cabendo ao laboratrio buscar aquela que mais se aplica ao estudo em questo. 2 CAMPO DE APLICAO Este documento aplica-se Dicla, aos laboratrios acreditados ou postulantes acreditao, e aos avaliadores e especialistas na rea de laboratrios de ensaios. 3 RESPONSABILIDADE A responsabilidade pela reviso deste documento da Dicla. 4 DOCUMENTOS COMPLEMENTARES Aplicam-se as ltimas edies dos seguintes documentos: ABNT NBR ISO/IEC 17000 - Avaliao de conformidade Vocabulrio e princpios gerais ABNT NBR ISO/IEC 17025 - Requisitos Gerais para a Competncia dos Laboratrios de Ensaio e de Calibrao VIM - Vocabulrio Internacional de Metrologia: conceitos fundamentais e gerais e termos associados (VIM 2008), 1 Edio Brasileira, Rio de Janeiro, 2009. ABNT ISO/IEC Guia 43-1 Ensaios de proficincia por comparaes interlaboratoriais Parte 1: Desenvolvimento e operao de programas de ensaios de proficincia DOQ-Cgcre-020 - Definies de termos utilizados nos documentos relacionados acreditao de laboratrios 5 SIGLAS ABNT APHA ANSI ASTM AWWA Cgcre CV Dicla DP DPR IEC ISO IUPAC Associao Brasileira de Normas Tcnicas American Public Health Association American National Standards Institute American Society for Testing and Materials American Water Works Association Coordenao Geral de Acreditao Coeficiente de Variao Diviso de Acreditao de Laboratrios Desvio Padro Desvio Padro Relativo International Electrotechnical Commission International Organization for Standardization International Union of Pure and Applied Chemistry

LGC MRC NBR NIST

Laboratory of the Government Chemist (UK) Material de Referncia Certificado Norma Brasileira National Institute of Standards and Technology (USA)

DOQ-CGCRE-008 Reviso 04 Jul/2011

Pgina 03/19

VIM - Vocabulrio Internacional de Metrologia: conceitos fundamentais e gerais e termos


associados

WEF

Water Environment Federation

6 DEFINIES Para o propsito deste documento, so adotadas as definies contidas no documento DOQCgcre-020, ABNT NBR ISO/IEC 17000, ABNT NBR ISO/IEC 17025 e no VIM. 7 INTRODUO O laboratrio deve atender aos requisitos da ABNT NBR ISO/IEC 17025 para a seleo de mtodos de ensaios (item 5.4.2), desenvolvimento de mtodos de ensaio pelo laboratrio (item 5.4.3), utilizao de mtodos no normalizados (item 5.4.4) e validao de mtodos (item 5.4.5). fundamental que os laboratrios disponham de meios e critrios objetivos para demonstrar, por meio da validao, que os mtodos de ensaio que executam conduzem a resultados confiveis e adequados qualidade pretendida. O laboratrio, ao empregar mtodos normalizados, necessita demonstrar que tem condies de oper-los de maneira adequada, dentro das condies especficas existentes nas suas instalaes antes de implant-los, no necessitando realizar os parmetros, descritos nos itens, deste documento, referentes a seletividade (item 8.2.1), linearidade (item 8.2.2), faixa de trabalho e faixa linear (item 8.2.3), comparao de mtodos (item 8.2.6.3.4), avaliao da aceitabilidade (item 8.2.6.3.5) e robustez (item 8.2.6.4) e comparao da preciso entre os mtodos (item 8.2.6.3.4)desde que os parmetros de validao estejam declarados nos mtodos em questo. Se um mtodo existente for modificado para atender aos requisitos especficos, ou um mtodo totalmente novo for desenvolvido, o laboratrio deve se assegurar de que as caractersticas de desempenho do mtodo atendem aos requisitos para as operaes analticas pretendidas. 8 VALIDAO

Com o objetivo de confirmar que os mtodos so apropriados para o uso pretendido, o laboratrio deve validar:

Mtodos no normalizados; Mtodos criados/desenvolvidos pelo prprio laboratrio; Mtodos normalizados usados fora dos escopos para os quais foram concebidos; Ampliaes e modificaes de mtodos normalizados.
O processo de validao de um mtodo deve estar descrito em um procedimento, e os estudos para determinar os parmetros de validao devem ser realizados com equipamentos e instrumentos dentro das especificaes, funcionando corretamente e adequadamente calibrados. Do mesmo modo, o responsvel pela realizao dos estudos deve ser competente na rea e precisa ter conhecimento suficiente sobre o trabalho, sendo capaz de tomar as decises apropriadas durante a realizao do mesmo. 8.1 Planejamento da validao No planejamento e execuo da validao, sugere-se a seguinte sequncia de trabalho:

Definir a aplicao, objetivo e escopo do mtodo; Definir os parmetros de validao e critrios de aceitao;

DOQ-CGCRE-008 Reviso 04 Jul/2011

Pgina 04/19

Verificar se as caractersticas de desempenho do equipamento esto compatveis com o exigido pelo mtodo em estudo; Qualificar os materiais, por exemplo, padres e reagentes; Planejar os experimentos de validao, incluindo o tratamento estatstico, e Fazer os experimentos de validao.

Os experimentos e os resultados devem ser documentados e registrados. 8.2 Parmetros de validao Os parmetros de validao devem estar claramente declarados no procedimento documentado e incluir, quando aplicvel:

Seletividade Linearidade Faixa de trabalho e Faixa linear Limite de deteco Limite de quantificao Tendncia/recuperao Preciso (repetitividade, preciso intermediria e reprodutibilidade) Robustez

Os parmetros que necessitam ser calculados durante o processo de validao podem variar de acordo com o tipo de ensaio, como mostra o quadro 1. Quadro 1 Parmetros de validao conforme o tipo de ensaio

Parmetros Qualitativo Preciso Seletividade Tendncia / recuperao Robustez Sensibilidade / linearidade / faixa de trabalho Limite de deteco Limite de quantificao

Tipo de ensaio Determinao do Anlise componente (ou de elementos analito) em maior menores e teor (1) Traos (2)

Propriedades Fsicas

Fonte: In-House Method Validation - A guide for Chemical Laboratories LGC / VAM, 2003

DOQ-CGCRE-008 Reviso 04 Jul/2011

Pgina 05/19

(1) Dependendo da faixa de concentrao do analito pode no ser necessria a determinao dos limites de deteco e de quantificao, como por exemplo: determinao de sacarose em balas e determinao do teor de gordura em carnes. por exemplo .componentes maiores com concentrao entre 1 a 100%, (2) So considerados como de menor teor concentraes entre 0,01 a 1% e elementos traos, os elementos em concentrao abaixo de 0,01% 8.2.1 Seletividade A matriz da amostra pode conter componentes que interferem no desempenho da medio. Os interferentes podem aumentar ou reduzir o sinal, e a magnitude do efeito tambm pode depender da concentrao. Experimentos para avaliao da seletividade descritos na literatura sobre validao de mtodos analticos envolvem ensaios com padres ou materiais de referncia, amostras com e sem o analito, alm da avaliao da capacidade de identificao do analito de interesse na presena de interferentes (quadro 2). Quando no h disponibilidade de interferentes, alguns autores sugerem a avaliao da habilidade de medio do analito por diferentes mtodos, tcnicas ou por meio de variaes nas condies instrumentais. Se a seletividade no for assegurada, a linearidade, a tendncia e a preciso estaro seriamente comprometidas. Quadro 2 Avaliao da seletividade Procedimento a) Fazer a anlise com a amostra e materiais de referncia pelo mtodo em estudo e outros mtodos validados. Demonstrar Habilidade do mtodo em estudo de identificar e dosar o analito na presena de interferentes. Comentrios Evidncias necessrias para dar suporte e gerar confiabilidade suficiente.

b) Analisar amostras Efeito de interferentes - a presena de contendo vrios interferentes interferente acentua ou inibe a deteco ou suspeitos na presena do quantificao do analito de interesse. analito de interesse.

Se alteram resultados, aperfeioar o mtodo ou selecionar outro mais adequado.

8.2.2 Linearidade A maioria dos equipamentos de medio existentes estabelece a sua faixa dinmica linear. necessrio, entretanto, verificar at que ponto a faixa de concentrao do analito coincide com a faixa dinmica linear e assegurar que nenhum outro fenmeno tenha impacto indesejvel na resposta. A quantificao requer que se conhea a dependncia entre a resposta medida e a concentrao do analito. A linearidade obtida por padronizao interna ou externa e formulada como expresso matemtica usada para o clculo da concentrao do analito a ser determinado na amostra real. A equao da reta que relaciona as duas variveis : y = a + bx (1)

DOQ-CGCRE-008 Reviso 04 Jul/2011

Pgina 06/19

sendo: y = resposta medida (absorbncia, altura ou rea do pico, etc.); x = concentrao; a = interseo com o eixo y, quando x = 0; b = inclinao da curva analtica = sensibilidade. O mtodo mais sensvel quando pequenas variaes de concentrao resultam em maior variao na resposta, ou seja, maior inclinao (b). Em geral, sero necessrios vrios nveis de concentrao, no mnimo cinco, para construir a curva analtica. O nmero de replicatas em cada nvel de concentrao deve ser o mais prximo possvel daquele empregado na rotina do laboratrio. A linearidade de um mtodo pode ser observada pelo grfico dos resultados dos ensaios em funo da concentrao do analito e verificada a partir da equao da regresso linear, determinada pelo mtodo dos mnimos quadrados. Para tal, deve ser verificada a ausncia de valores discrepantes para cada nvel de concentrao e a homocedasticidade dos dados, antes de fazer a regresso linear. A verificao da ausncia de valores discrepantes pode ser feita pelo teste de Grubbs (ISO 57253,1994 e ISO 5725-2, 1994) ou de resduo Jacknife (SOUZA; JUNQUEIRA, 2005) e a homocedasticidade, isto , homogeneidade da varincia dos resduos pelo teste de Cochran (ISO 5725-3:1994) ou teste de Levene (SOUZA; JUNQUEIRA, 2005) ou o teste de BrownForsythe (SOUZA; JUNQUEIRA, 2005). Calcular o modelo atravs da regresso linear, os resduos e o coeficiente de correlao linear (r). Este freqentemente utilizado para indicar o quanto a reta pode ser considerada adequada como modelo matemtico para o estudo de caso. Uma alternativa para avaliar a linearidade seria a realizao da anlise de varincia (ANOVA) na regresso. Alguns procedimentos analticos no demonstram linearidade mesmo aps qualquer transformao. Nesses casos, a resposta analtica pode ser descrita por uma funo que modela a concentrao do analito na amostra. 8.2.3 Faixa de Trabalho e Faixa Linear Para qualquer mtodo quantitativo, existe uma faixa de concentraes do analito ou valores da propriedade no qual o mtodo pode ser aplicado. Todo experimento de determinao da faixa de trabalho iniciado pela escolha de uma faixa preliminar. A faixa de trabalho deve cobrir a faixa de aplicao para a qual o ensaio vai ser usado e a concentrao mais esperada da amostra deve, sempre que possvel, se situar no centro da faixa de trabalho. No limite inferior da faixa de concentrao, o fator limitante o valor do limite de quantificao. No limite superior, os fatores limitantes dependem do sistema de resposta do equipamento de medio. Dentro da faixa de trabalho pode existir uma faixa de resposta linear e dentro desta, a resposta do sinal ter uma relao linear com o analito ou valor da propriedade. A extenso dessa faixa pode ser estabelecida durante a avaliao da faixa de trabalho.

DOQ-CGCRE-008 Reviso 04 Jul/2011

Pgina 07/19

Tabela 1 - Mtodos para determinao da Faixa de Trabalho e Faixa Linear.

Observaes: Branco = gua reagente Branco da amostra = matriz da amostra sem o analito de interesse 8.2.4 Limite de Deteco (LD) Quando so realizadas medidas em amostras com baixos nveis do analito ou de uma propriedade, como por exemplo, anlise de traos, importante saber qual o menor valor de concentrao do analito ou da propriedade que pode ser detectado pelo mtodo. A importncia desta determinao e os problemas associados a ela advm do fato de que a probabilidade de deteco no muda rapidamente de zero para um quando seu limiar ultrapassado. Os problemas tm sido investigados estatisticamente e diversos critrios de deciso tm sido propostos. Muitas controvrsias so originadas devido ao fato de no haver atualmente uma concordncia da terminologia aplicvel. O termo limite de deteco no aceito por todos, apesar de ser usado em alguns documentos setoriais. O limite de deteco para um procedimento analtico pode variar em funo do tipo da amostra. fundamental assegurar-se de que todas as etapas de processamento do mtodo analtico sejam includas na determinao desse limite de deteco. Para a validao de um mtodo analtico, normalmente suficiente fornecer uma indicao do nvel em que a deteco do analito pode ser distinguida do sinal do branco/rudo. Existem diversas formas de se calcular o limite de deteco. No quadro 3 so apresentadas algumas destas metodologias.

DOQ-CGCRE-008 Reviso 04 Jul/2011

Pgina 08/19

Quadro 3 - Determinao de Limite de Deteco (LD) Matriz Branco da amostra Clculos LD = X + t (n 1, 1 ) .s Observaes A mdia e o desvio-padro amostral dos brancos da amostra so dependentes da matriz. Vlido somente quando os valores dos brancos apresentarem um desviopadro amostral diferente de zero.

sendo: X = mdia dos valores dos brancos da amostra; t a distribuio de Student, dependente do tamanho da amostra e do grau de confiana e, s = desvio-padro amostral dos brancos da amostra. Ou Branco da amostra com LD = 0 + t (n 1, 1 ) .s A menor concentrao adio da menor aceitvel aquela tida como sendo: concentrao aceitvel a concentrao mais baixa t = distribuio de Student, do analito para a qual um grau aceitvel dependente do tamanho da de incerteza pode ser amostra e do grau de confiana e, alcanado. s = desvio-padro amostral dos brancos da amostra, com adio.

A parte estatstica somente uma orientao, e que o LD deva ser obtido experimentalmente, j que, conforme descrito, o limite de deteco para um procedimento analtico pode variar em funo do tipo da amostra e, por isso, no h uma frmula estatstica. fundamental que avaliaes independentes sejam realizadas em amostras com concentrao igual ao limite de deteco determinado. O nmero de replicatas muito elevado pode superestimar o limite de deteco, por isto, este nmero (n) deve expressar a rotina do laboratrio. recomendado um mnimo de 7 replicatas para a determinao do LD. Por exemplo, no caso de se analisar 7 alquotas, temos 7-1 = 6 graus de liberdade de uma matriz de branco da amostra com adio da menor concentrao aceitvel do analito. Para esses graus de liberdade, o valor de t unilateral, para 99% de confiana 3,143. O LD ser igual a 3,143 vezes o desvio padro amostral. O mtodo analtico deve ser especificado e o LD para cada analito deve ser expresso nas unidades apropriadas, de acordo com o preconizado no mtodo analtico. A matriz da amostra usada para determinar o LD deve ser identificada. 8.2.5 Limite de Quantificao Algumas vezes tambm denominado Limite de Determinao. Na prtica, corresponde normalmente ao padro de calibrao de menor concentrao (excluindo o branco). Este limite, aps ter sido determinado, deve ser testado com amostras independentes, para averiguar se a tendncia e a preciso conseguidas so satisfatrias. A descrio do quadro 4 pode ser considerada como sendo uma maneira de se calcular o limite de quantificao. A concentrao do analito corresponde ao valor da mdia do branco mais 5, 6 ou 10 desvios padro. Todavia, a maneira mais realista determinar o LQ experimentalmente, com base em critrios de aceitao pr-definidos.

DOQ-CGCRE-008 Reviso 04 Jul/2011

Pgina 09/19

Quadro 4 Determinao do Limite de Quantificao (LQ)


Matriz Determinao LQ = X + 5s ou LQ = X + 6s ou LQ = X + 10s onde: X = mdia dos valores dos brancos s = desvio-padro amostral dos brancos - Medir, uma vez cada replicata independente, a cada nvel de concentrao. - Calcular o desvio-padro amostral s do valor do analito, para cada concentrao. - Fazer o grfico concentrao versus s, e atribuir um valor para o LQ, por inspeo.

Branco da amostra

Branco com adio de concentraes variadas do analito, prximas ao LD

O mtodo analtico deve ser especificado e o LQ para cada analito deve ser expresso nas unidades apropriadas, de acordo com o preconizado no mtodo analtico. A matriz da amostra usada para determinar o LQ deve ser identificada. Nota: Para a anlise em nvel de traos, recomendado adotar o LQ como a concentrao mais baixa da curva analtica.

8.2.6 Tendncia/Recuperao Os processos normalmente utilizados para avaliar a tendncia de um mtodo so, entre outros: uso de materiais de referncia certificados (MRC), participao em comparaes interlaboratoriais e realizao de ensaios de recuperao. A tendncia, quando aplicada a uma srie de resultados de ensaio, implica numa combinao de componentes de erros aleatrios e sistemticos. A determinao da tendncia com relao aos valores de referncia apropriados importante no estabelecimento da rastreabilidade aos padres reconhecidos. A tendncia pode ser expressa como recuperao analtica, definida como:
valorobservado x 100%. valoresperado

Esta tendncia deve ser corrigida ou demonstrada ser desprezvel, mas em ambos os casos, a incerteza associada com a determinao da tendncia permanece como um componente essencial da incerteza global. Nota: A exatido avaliada numericamente atravs da tendncia. 8.2.6.1 Materiais de referncia certificados Sempre que possvel, os materiais de referncia certificados (MRC) devem ser utilizados no processo de validao de um mtodo de ensaio. Um MRC possui um valor de concentrao, ou outra grandeza, para cada parmetro, e uma incerteza associada. muito importante, portanto, que o fornecimento desses MRC seja realizado por organismos reconhecidos e confiveis, como por exemplo: INMETRO, NIST, LGC, etc.

DOQ-CGCRE-008 Reviso 04 Jul/2011

Pgina 10/19

O uso correto dos MRC consiste na sua anlise para avaliar o desempenho do laboratrio. Na avaliao da tendncia utilizando um material de referncia certificado, os valores obtidos pelo laboratrio mdia e o desvio padro amostral de uma srie de ensaios em replicata devem ser comparados com os valores certificados do material de referncia. Para esta comparao podem ser utilizados diversos critrios de deciso, entre os quais: erro relativo; ndice z (z-score), e erro normalizado. Quando o valor obtido no estiver dentro do intervalo da regio de aceitao para o valor certificado, o laboratrio deve procurar as causas desse desvio e procurar elimin-las. 8.2.6.1.1 Erro relativo (ER) Uma forma de avaliar a exatido do mtodo por meio do clculo do erro relativo (ER), expresso em percentagem por meio da expresso:

ER
Sendo:

X lab X v . 100 Xv

(2)

Xlab = valor obtido experimentalmente ou mdia aritmtica de valores obtidos Xv = valor aceito como verdadeiro (valor certificado do MRC)

8.2.6.1.2

ndice z (z score)

O ndice z tambm um modo de avaliar o desempenho do laboratrio em comparaes interlaboratoriais.

z
Sendo:

( X lab s

Xv)

(3)

Xlab = valor obtido pelo laboratrio; Xv = valor aceito como verdadeiro; s = desvio-padro do ensaio de proficincia. A avaliao feita com o seguinte critrio de deciso, de acordo com a ISO Guia 43: |z| 2 => resultado satisfatrio;

2 < |z| < 3 => resultado questionvel; |z| 3 => resultado insatisfatrio.

8.2.6.1.3 Erro normalizado Quando o laboratrio calcular a incerteza expandida do seu resultado (Ulab), o valor verdadeiro (Xv) deve estar dentro do intervalo (Xlab. Ulab). Quando isso no acontece, esse intervalo pode estar subestimado. Nesses casos empregado o conceito de erro normalizado (En):

En

( X lab U
2 lab

Xv) U
2 ref

(4)

DOQ-CGCRE-008 Reviso 04 Jul/2011

Pgina 11/19

Sendo: Uref = incerteza associada ao MRC Se | En | 1, ento pode ser considerado que o resultado do laboratrio adequado.

8.2.6.2 Ensaios de recuperao A recuperao do analito pode ser estimada pela anlise de amostras fortificadas com quantidades conhecidas do mesmo (spike). As amostras podem ser fortificadas com o analito em pelo menos trs diferentes concentraes: baixa, mdia e alta, da faixa de uso do mtodo. A limitao deste procedimento a de que o analito adicionado no est necessariamente na mesma forma que a presente na amostra. A presena de analitos adicionados em uma forma mais facilmente detectvel pode ocasionar avaliaes excessivamente otimistas da recuperao. A recuperao calculada segundo: Recuperao (%)

C1

C2 C3

100

(5)

Sendo: C1 = concentrao do analito na amostra fortificada, C2 = concentrao do analito na amostra no fortificada, C3 = concentrao do analito adicionada amostra fortificada. 8.2.6.3 Preciso Normalmente determinada para circunstncias especficas de medio e as trs formas mais comuns de express-la so: por meio da repetitividade, preciso intermediria e da reprodutibilidade, sendo usualmente expressas pelo desvio padro e coeficiente de variao. O coeficiente de variao (CV, usualmente expresso em %), tambm conhecido como desvio padro relativo (DPR), calculado da seguinte forma:

C.V. = DPR = Sendo: DP = desvio-padro;

DP 100 CMD

(6)

CMD = concentrao mdia determinada 8.2.6.3.1 Repetitividade As condies de repetitividade podem ser caracterizadas utilizando: Mesmo procedimento de medio; Mesmo observador; Mesmo instrumento usado sob mesmas condies; Mesmo local, e Repeties no menor espao de tempo possvel. A repetitividade pode ser expressa quantitativamente em termos da caracterstica da disperso dos resultados e pode ser determinada por meio da anlise de padres, material de referncia ou adio do analito a branco da amostra, em vrias concentraes na faixa de trabalho.

DOQ-CGCRE-008 Reviso 04 Jul/2011

Pgina 12/19

O nmero de replicatas para cada nvel de concentrao deve expressar a rotina do laboratrio. 8.2.6.3.1.1 Limite de repetitividade (r) A partir do desvio-padro dos resultados dos ensaios sob condio de repetitividade aconselhvel calcular o limite de repetitividade (r) que capacita o analista a decidir se a diferena entre anlises realizadas nas condies de 10.7.1 significante. O limite de repetitividade (r) dado por:

r
Sendo:

t (n-1,1-

2.

(7)

S = desvio-padro amostral associado aos resultados considerados para cada nvel de


concentrao Caso o laboratrio obtenha resultados diferentes para r nos diferentes nveis de concentrao, o limite de repetitividade (r) calculado de acordo com a norma ISO 5725-2. 8.2.6.3.2 Preciso intermediria

A preciso intermediria, de acordo com a ISO 5725-3, refere-se preciso avaliada sobre a mesma amostra, amostras idnticas ou padres, utilizando o mesmo mtodo, no mesmo laboratrio, mas definindo exatamente quais as condies a variar (uma ou mais), tais como:

diferentes analistas; diferentes equipamentos; diferentes tempos.

Esta medida de preciso representa a variabilidade dos resultados em um laboratrio. Na maioria dos casos, o valor de preciso intermediria funo do nvel de concentrao do ensaio e o seu clculo efetuado, preferencialmente, a partir dos resultados obtidos, aps eliminao dos resultados discrepantes. A visualizao grfica dos valores tambm pode ser til para identific-los. Dependendo do ensaio e do tipo de aplicao do estudo da preciso intermediria, existem vrios mtodos para determinao e controle desse parmetro, tais como:

por meio de grfico de controle do desvio padro, que poder ser aplicados para replicatas de
amostras e para padres estveis ao longo do tempo;

por meio da expresso:

Spi( j ,k )

1 t (n 1)

y jk
j 1 k 1

yj

(8)

Spi( j ,k ) = desvio padro de preciso intermediria


t = total de amostras ensaiadas (no confundir com o t de Student); n = total de ensaios efetuados por amostra; j = n da amostra, j = 1, t k = n do ensaio da amostra j, k = 1, n yjk = valor do resultado k para a amostra j yj = representa a mdia aritmtica dos resultados da amostra j.

DOQ-CGCRE-008 Reviso 04 Jul/2011

Pgina 13/19

Nesse caso, a determinao da preciso intermediria feita por meio de t valores de n ensaios de amostras ou padres. A preciso intermediria baseia-se na disperso entre ensaios. recomendado que o valor t (n-1), seja, pelo menos, igual a 15. Quando n = 2 a equao (8) toma a forma:

Si( j ,k )
Sendo

1 . 2.t

( y j1
j 1

y j 2 )2

(9)

y j1

= primeiro resultado obtido para a amostra j;

y j 2 = segundo resultado obtido para a amostra j


Um mtodo simplificado para estimar a preciso intermediria baseia-se na execuo de n medies (n 15), em condies pr-definidas, sobre: uma mesma amostra; amostras supostamente idnticas; padres

A estimativa da preciso internediria Si ( ), neste caso, dada por:


Si( j ,k ) 1 n 1
n

( yk
k 1

y )2

(10)

em que Si (j,k) o desvio padro de preciso intermediria relativo a esse grupo, onde os smbolos relativos s condies intermedirias de preciso podem aparecer entre parntesis (Ex: Si (T.O) significa tempo e operadores diferentes). Este mtodo revela-se menos eficiente quando comparado com os anteriores. Sendo: n = n de ensaios efetuados por amostra ou padro; yk = cada resultado obtido; y = representa a mdia aritmtica de cada resultado obtido. 8.2.6.3.3 Reprodutibilidade Embora a reprodutibilidade no seja um componente de validao de mtodo executado por um nico laboratrio, considerada importante quando um laboratrio busca a verificao do desempenho dos seus mtodos em relao aos dados de validao obtidos por meio de comparao interlaboratorial. A partir do desvio padro obtido sob condies de reprodutibilidade possvel calcular o limite de reprodutibilidade (R), o qual permite ao analista decidir se a diferena entre os valores da duplicata das amostras analisadas sob condies de reprodutibilidade significante.

DOQ-CGCRE-008 Reviso 04 Jul/2011

Pgina 14/19

O clculo terico do desvio padro da reprodutibilidade baseado na concentrao do analito pode ser obtido pela equao de Horwitz, modificada por Thompson, de tal forma que: - para c (concentraes) > 0,138 - para 1,2x10 7 c (concentraes) - para c (concentraes) < 1,2 x107 0,138 = 0,01 c 0,5 = 0,02 c 0,8495 = 0,02 c

8.2.6.3.3.1 Limite de reprodutibilidade (R) Do mesmo modo que para repetitividade, o limite de reprodutibilidade (R), dado por

R
Sendo:

t (n-1,1-

2 . SR

(11)

SR = desvio-padro associado aos resultados de todos os laboratrios SR= Slab 2 + Sr 2 Onde: Slab = mdia das varincias dos resultados de cada laboratrio Sr = varincia das mdias dos laboratrios O clculo da reprodutibilidade efetuado para cada nvel, separadamente, aps eliminao dos valores discrepantes (ISO 5725-2). No quadro 5, est apresentado um resumo da determinao da repetitividade, preciso intermediria e reprodutibilidade. Quadro 5 Repetitividade, Preciso Intermediria e Reprodutibilidade Analisar: Padres, materiais de referncia ou amostras fortificadas vrias concentraes ao longo da faixa de trabalho a) Mesmo analista, equipamento, laboratrio, perodo curto (repetitividade) b) Analistas e equipamentos diferentes, mesmo laboratrio, perodo estendido (preciso intermediria) c) Analistas, equipamentos e laboratrios diferentes, perodo estendido (reprodutibilidade) Repeti-es (independentes) 7

O qu calcular a partir dos dados?

Comentrios

Determinar o desvio- Determinar o desvio-padro padro amostral (s) de amostral da repetitividade de cada concentrao cada concentrao. Determinar o desvio-padro Determinar o desvioda reprodutibilidade padro amostral (s) de intralaboratorial de cada cada concentrao concentrao. Determinar o desvio-padro Determinar o desvio- da reprodutibilidade padro amostral (s) de interlaboratorial de cada cada concentrao concentrao. Requer estudo colaborativo

O Laboratrio deve realizar o maior nmero de repeties tcnica e economicamente viveis, pois se no nmero de repeties for pequeno, as concluses, para uma determinada confiabilidade, podem no ter utilidade prtica ou o erro maior que o admissvel. A ISO 5725-3 que trata de preciso intermediria recomenda que sejam efetuadas no mnimo 15 repeties.

DOQ-CGCRE-008 Reviso 04 Jul/2011

Pgina 15/19

8.2.6.3.4 Comparao da preciso entre mtodos Consiste na comparao dos resultados obtidos utilizando um mtodo a ser validado com os resultados conseguidos por meio de um mtodo de referncia validado. O objetivo estudar o grau de proximidade dos resultados obtidos pelos dois mtodos, ou seja, avaliar a exatido do mtodo em processo de validao com o de referncia. As anlises so efetuadas em replicata, utilizando os dois mtodos, em separado, sobre as mesmas amostras, em toda faixa de concentraes em que se pretende validar o mtodo. Existem vrias tcnicas para comparar os resultados obtidos por dois mtodos de ensaio, entre as quais: testes de hiptese e planejamento de experimentos. Considerando adequada a exatido dos mtodos, quando se pretende avaliar se dois mtodos (A e B) tem diferenas significativas entre si, em termos de preciso, pode-se recorrer ao teste F. Este baseia-se no clculo da razo entre as varincias dos dois mtodos (Fcalc = sA2/sB2), colocando-se a maior no numerador, de modo que a razo seja maior ou igual a 1. Em seguida, compara-se este valor obtido com o valor tabelado de F. Se Fcalculado Ftabelado, os dois mtodos no apresentam diferenas significativas entre si, relativamente s suas precises. O teste t student pode tambm ser utilizado para verificar se as mdias dos resultados de dois mtodos podem ser consideradas estatisticamente iguais. 8.2.6.3.5. Avaliao da aceitabilidade das caractersticas de preciso de um mtodo de anlise No caso de no haver mtodo com os quais possam ser comparadas as caractersticas de preciso, ento, valores tericos de repetitividade e reprodutibilidade podem ser calculados a partir da equao de Horwitz [1]. A forma mais adequada o uso dos valores de HORRAT par avaliar a aceitabilidade das caractersticas de preciso de um mtodo. O valor de HORRAT dado por: DPR(R) derivado do estudo colaborativo DPR(R) previsto da equao de Horwitz Assim, HOR, o valor HORRAT para reprodutibilidade, o valor do desvio padro relativo (CV) da reprodutibilidade dividido pelo valor do desvio padro relativo (CV) da reprodutibilidade calculado a partir da equao de Horwitz, na concentrao de interesse. 8.2.6.3.5.1 Interpretao Se os valores de HORRAT forem menores ou iguais a 2, os valores da reprodutibilidade do mtodos podem ser considerados satisfatrios. Os laboratrios devem se assegurar de que os mtodos que eles empregam atendem esse critrio. 8.2.6.3.5.2 Clculo do valor de Horwitz O valor de Horwitz derivado da equao de Horwitz, que estabelece para qualquer mtodo: DPRR = 2 (1 0,5 logC) (12)

DOQ-CGCRE-008 Reviso 04 Jul/2011

Pgina 16/19

E que este valor independe da matriz/analito. Os principais valores so: Razo de Concentrao 1 (100%) 10-1 10-2 (1%) 10-3 10-4 10-5 10-6 (ppm) 10-7 10-8 10-9 (ppb) 8.2.6.4 Robustez Para determinar a robustez de um mtodo de ensaio, pode-se recorrer ao teste de Youden. Tratase de um teste que permite no s avaliar a robustez do mtodo, como tambm ordenar a influncia de cada uma das variaes nos resultados finais, indicando qual o tipo de influncia de cada uma dessas variaes. Convm salientar que quanto maior for a robustez de um mtodo, maior ser a confiana desse relacionamento sua preciso. 8.2.6.5 Comparaes Interlaboratoriais O ABNT ISO/IEC Guia 43-Parte 1 faz distino entre o uso de comparaes interlaboratoriais para ensaios de proficincia para a determinao do desempenho do laboratrio, e para outros propsitos tais como: estabelecer a eficcia e a comparabilidade de novos mtodos de ensaio ou de medio, acompanhar mtodos estabelecidos e determinar as caractersticas de desempenho de um mtodo, geralmente conhecidos como estudos colaborativos. Para a avaliao dos resultados das comparaes interlaboratoriais tambm so aplicveis os critrios de deciso descritos em 8.2.6.1. Nos processos de comparao interlaboratorial, caso no se alcancem as condies satisfatrias, deve ser efetuado um plano de aes corretivas para verificar as causas e reavaliar o ensaio. 9 DOCUMENTAO DE MTODOS VALIDADOS Todos os dados relevantes no estudo de validao de um mtodo, como o planejamento, experimentos e resultados obtidos, devem ser documentados e registrados de forma a possibilitar a rastreabilidade de todo o processo. Documentaes que registrem etapas da validao so necessrias tambm para fins de avaliao e podem ser exigidas por razes contratuais ou at mesmo por organismos regulamentadores. Depois de cumpridas todas as etapas do processo de validao, importante elaborar o procedimento operacional de forma que o mtodo possa ser implementado de maneira clara e sem ambigidades. A documentao apropriada auxilia na aplicao consistente do mtodo, possibilitando sua execuo conforme descrito; caso contrrio o desempenho real do mtodo no ir corresponder quele previsto nos dados de validao. Portanto, a documentao deve minimizar a introduo de variao acidental no mtodo. Os mtodos documentados formam uma parte importante do sistema da qualidade do laboratrio e devem estar sujeitos a um controle eficaz de documentos, assegurando desse modo que somente mtodos e procedimentos validados sejam utilizados. O mtodo documentado deve informar quando foi autorizado para uso. Convm que a documentao seja clara, precisa e concisa, dentro dos limites estabelecidos pelo seu campo de aplicao. Um formato padronizado assegura que nenhum ponto importante foi esquecido, que as informaes a serem includas no procedimento so fornecidas sempre na mesma ordem e que qualquer assunto desejado pode ser encontrado rapidamente PDPRR 2 2,8 4 5,6 8 11 16 23 32 45

DOQ-CGCRE-008 Reviso 04 Jul/2011

Pgina 17/19

10 DOCUMENTOS DE REFERNCIA AMERICAN PUBLIC HEALTH ASSOCIATION. Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater, 21st ed. Washington, 2005. AOAC (Association of Official Analytical Chemists). AOAC Official methods of analysis. Appendix D: guidelines for collaborative study procedures to validate characteristics of a method of analysis. Washington: AOAC, 2002. ASTM E178:2002 Standard Practice for Dealing With Outlying Observations. BARRET, V.; LEWIS, T. Outliers in statistical data. 3 ed. New York: John Wiley, 1994. 604 p. BELSLEY, D.A.; KUH, E.; WELSCH, R.E. Regression diagnostics: identifying influential data and sources of collinearity. New York: Wiley, 1980. 292 p. BROWN, M.B.; FORSYTHE, A.B. Robust tests for the equality of variances. J. Am. Stat. Assoc., v. 69, p. 364-367, 1974. BRUCE, P.; MINKKINEN P.; RIEKKOTA M.L. Practical Method Validation: Validation Sufficient for an Analysis Method. Mikrochim. Acta. 128, 93-106. 1998. COCHRAN, W. G. The distribution of the largest of a set of estimated variances as a fraction of their total, Ann. Eugenics, 11, 47, 1941. EAL.- P11. Validation of Test Methods - General principles and concepts. EAL European cooperation for Accreditation of Laboratories. 1997. EURACHEM. The Fitness for Purpose of Analytical Methods. A laboratory Guide to Method Validation and Related Topics. 1st ed. 1998. GARFIELD, F.M. Quality Assurance Principles for Analytical Laboratories. AOAC. Arlington. 1997. GREEN, J.M. A Practical Guide to Analytical Method Validation. Analytical Chemistry. 1996. (68) 305A-309A GRUBBS, F. E.; BECK, G. Extension of sample sizes and percentage points for signicance tests of outlying observations. Technometrics, 14:847-856, 1972. GRUBBS, F. E. Procedures for detecting outlying observations in samples. Technometrics, v. 11, p. 1-21, 1969. HORWITZ, W. Evaluation of Analytical Methods Used for Regulation of Food and Drugs. Analytical Chemistry, 54 (1982) 67A HUBER, Ludwig, Validation and Qualification in Analytical Laboratories. Interpharm Press. 1999. ISO 5725-1:1994. Accuracy (trueness and precision) of Measurement Methods and Results Part 1: General principles and definitions. ISO 5725-2:1994(1998). Accuracy (trueness and precision) of Measurement Methods and Results - Part 2: basic method for the Determination of Repeatability and Reprodutibility of a Standard Measurement Method. ISO 5725-3:1994(2001). Accuracy (trueness and precision) of Measurement Methods and Results - Part 3: Intermediate Measures of Precision of a Standard Measurement Method. ISO 5725-4:1994. Accuracy (trueness and precision) of Measurement Methods and Results Part 4: Basic Methods for the Determination of the Trueness of a Standard Measurement method. ISO 5725-6:1994(2001). Accuracy (trueness and precision) of Measurement Methods and Results - Part 6: Use in Practice of Accuracy Values.

DOQ-CGCRE-008 Reviso 04 Jul/2011

Pgina 18/19

IUPAC; HORWITZ, W. Protocol for the design, conduct and interpretation of methodperformance studies. Pure &Appl. Chem., 67(2): 331-343, 1995. KELLY, P.C. Outlier detection in colaborative studies. J. Assoc. Off. Anal. Chem., v. 73, p. 5864, 1990 LEVENE, H. Robust tests for equality of variances. In: OLKIN, I.; GHURYE, S.G.; HOEFFDING, W.; MADOW, W.G.; MANN, H.B. (Ed.) Contributions to probability and statistics. Stanford: Stanford University Press, 1960. p. 278-292. LGC / VAM In-House Method Validation - A Guide for Chemical Laboratories. 2003. NATA. Technical Note 17. Format and Content of Test Methods and Procedures for Validation and Verification of Chemical Test Methods. 1997. RELACRE. Guia Relacre 13. Validao de Mtodos Internos de Ensaio em Anlise Qumica. Portugal. 2000. SOUZA, S.V.C.; JUNQUEIRA, R.G. A procedure to assess linearity by ordinary least squares method Analytica Chimica Acta, Vol. 552, issue 1-2, November 2005, p. 25-35. TAYLOR, J.K . Quality Assurance of Chemical Measurements. Lewis Publishers, 1987. THOMPSON, M. Recent trends in inter-laboratory precision at ppb and sub-ppb concentrations in relation to fitness for purpose criteria in proficiency testing. Analyst, v.125, p. 385-6, 2000. VIM - Vocabulrio Internacional de Termos Fundamentais e Gerais de Metrologia (VIM). Traduo do documento VIM JCGM 200-2008, dezembro de 2008. WEISBERG, S. Applied linear regression. New York: Wiley, 1985. 324 p. WOOD, R., How to validate analytical methods. Trends in Analytical Chemistry, v. 18, n. 9, 10 September 1999, pp. 624-632(9).

11. HISTRICO DA REVISO Reviso geral do documento, que inclui: a mudana do ttulo de Orientao sobre a Validao de Mtodos de Ensaios Qumicos para Orientao sobre Validao de Mtodos Analticos. reordenao de itens para tornar mais claro o documento. retirada das definies de termos referenciando-as a documentos normativos. atualizao do documento adequando-o terminologia e metodologias de validao mais recentes. retirada de frmulas para clculos, por exemplo, no teste de seletividade do mtodo, por entender-se que h bastante bibliografia da qual os laboratrios podem se utilizar para este fim. ____________________

DOQ-CGCRE-008 Reviso 04 Jul/2011

Pgina 19/19

ANEXO RELAO DOS PARTICIPANTES DA ELABORAO DESTE DOCUMENTO De forma a auxiliar aos laboratrios de ensaios, especialmente os postulantes acreditao, na tarefa de validar os mtodos por eles desenvolvidos, a Diviso de Acreditao de Laboratrios (Dicla) da Cgcre reuniu a sua Comisso Tcnica de Qumica (CT-05), congregando os especialistas, abaixo listados, que dedicaram um tempo de suas atividades elaborao e reviso deste documento. A Dicla agradece pela contribuio prestada no apoio ao fortalecimento da atividade de acreditao de laboratrios. Emisso e reviso 01: Hlio Lionel (in memoriam) Especialista em Qumica do Petrleo; Snia Elisa Pereira (Coordenadora do trabalho) - Instituto Nacional de Tecnologia / INT; Suzana Saboia de Moura - INMETRO / Dicla; Eduardo Castello Branco T. Guimares - UERJ / LABCON; Margareth Westin D. de Azevedo - CETEC / Fundao Centro Tecnolgico de Minas Gerais; Lina Yamachita Oliveras - CIENTEC / RS; Tnia Barreto Simes Corra - EMBRAPA / CTAA; Alfredo Rodrigues de Oliveira - Hidroqumica; Vanderla de Souza - INMETRO / DQUIM; Albert Hartmann - Millennium Chemicals; Lcia Helena Noanta de Souza - PETROBRAS / CENPES; Vera Harcar - Rede de Tecnologia do Rio de Janeiro; Srgio Motta - SENAI / CETIND; Kikue Higashi - Especialista em Qumica Ambiental; Paulo Afonso Lopes da Silva - Ph. D., Estatstico; Reginaldo Ramos - Especialista em Qumica Ambiental; Walderez Bindilatti Qumica __________________________ Membros do Grupo Tcnico responsvel pela reviso 02: Eduardo Castello Branco T. Guimares (Coordenador do trabalho) - UERJ / LABCON; Akie Kawakami vila - FIOCRUZ / Biomanguinhos; Alfredo Rodriguez de Oliveira - Especialista em Qumica Ambiental; Ilse Maria Guilhermino Lemos - Especialista em Qumica do Petrleo; Janana Marques Rodrigues Caixeiro - INMETRO / DQUIM; Kikue Higashi - Especialista em Qumica Ambiental; Olga Benrio Ramos Leal - INMETRO / DICLA; Patrcia Ritter Martins - PETROBRAS / CENPES, com a colaborao de: Paulo Afonso Lopes da Silva - Ph. D., Estatstico; Renata M. Borges INMETRO / Dicla __________________________ Membros do Grupo Tcnico responsvel pela reviso 03: Eduardo Castello Branco T. Guimares - Coordenador do trabalho - IQ / UERJ; Adriane Castro Pereira - Laboratrio Biominerais Ltda.; Akie Kawakami vila - Fundao BIO RIO; Eliane Cristina Pires do Rego INMETRO / DQUIM; Ilse Maria Guilhermino Lemos - Especialista em Qumica do Petrleo; Lina Yamachita Oliveras - CIENTEC/RS; Luzia Cristina Valente Rodrigues - LAMIM / CPRM; Neimar Arajo IBP; Olga Benrio Ramos Leal; Dicla / INMETRO; Paula Fernandes de Aguiar - IQ / UFRJ; Paulo Afonso Lopes da Silva - Ph. D, Estatstico; Paulo Paschoal Borges INMETRO / DQUIM; Patrcia Ritter Martins - CENPES / PETROBRAS; Renata M. Borges INMETRO / DICLA; Roberto Gonalves Junqueira - ALM/FAFAR /UFMG; Tnia Barretto Simes Corra - Especialista em Alimentos ______________________