METODOLOGA EXPERIMENTAL PRCTICA 3: TCNICAS CROMATOGRFICAS

A) HOMOGENEIZACIN

B) CENTRIFUGACIN

3 g de hojas de espinaca 1 g de cada muestra

Cortar en trozos pequeos

Colocar en tubos de ensaye el homogenado obtenido

Equilibrar los tubos junto con las camisas Colocar los tubos dentro de la centrfuga Colocar cada par de tubos en posiciones opuestas

Homogenizar fuertemente

10 mL de etanol absoluto a cada muestra

Colocar en morteros separados

Realizar sus observaciones 2500 rpm X 10 min

METODOLOGA EXPERIMENTAL PRCTICA 3: TCNICAS CROMATOGRFICAS C) SEPARACIN DE PIGMENTOS VEGETALES POR CROMATOGRAFA

1. CROMATOGRAFA EN PAPEL(HOMOGENIZADO DE ESPINACA) Cortar una tira de 3 x 20 cm Hacer las marcas con lpiz, no tocar el papel con las manos. EQUIPO

Fig. 1. Aplicacin de la muestra en cromatografa en capa fina y de papel.

2. CROMATOGRAFA EN CAPA FINA (HOMOGENIZADO DE PTALOS DE FLORES) Cuidando de no maltratarla o Cortar la placa de tocarla con los silica en dedos. rectngulos de 2x5 EQUIPO Fig. 1. Aplicacin de la muestra en cromatografa en capa fina y de papel. 1.5 cm Punto de aplicacin

Aplicar la muestra con el capilar aproximadamente a 1.5 cm del borde Tapar rpidamente

Placa

La mancha debe tener una coloracin lo ms intensa posible y lo ms compacta (por lo menos cinco aplicaciones en el mismo punto, dejar secar entre cada aplicacin)(dos muestras diferentes por placa) Correr la cromatografa en una cmara cromatogrfica pequea, previamente saturada (15 min) Lmite del solvente Fase mvil con butanol-cido actico concentrado-agua destilada (63:16:21)

1.5 cm Punto de aplicacin

Colocar sobre la tira de papel con ayuda de un capilar una muestra del sobrenadante de espinaca.

Tapa

Papel

La mancha debe tener una coloracin lo ms intensa posible y lo ms compacta (por lo menos cinco aplicaciones en el mismo punto, dejar secar entre cada aplicacin). Correr la cromatografa en una cmara cromatogrfica, previamente saturada (15 min) Lmite del solvente ter de petrleo-acetona-benceno (85:5:10)

Sacar el cromatograma, marcar inmediatamente con lpiz el frente del disolvente.

Marcar las manchas, dejar secar y calcular los Rf de cada componente.

Colocar la placa en la cmara de cromatografa cuidando que el solvente no toque la gota de muestra.

Sacar la tira de la cmara cuando el solvente se encuentre aproximadamente a 1 cm del borde superior.

Registrar los resultados en la tabla.

Anotar resultados

D1: Los trozos de espinaca, ptalos de flores y pastillas de la centrifugacin no son considerados residuos peligrosos, por lo que sern depositados en una bolsa de plstico proporcionada por su asesor. D2: Los cromatogramas tampoco representan ningn riesgo, pueden ser integrados en el reporte en la seccin de resultados. R1: Las mezclas de solventes para las cromatografas en papel, columna y capa fina, as como el ter de petrleo son solventes txicos, voltiles y flamables, por lo que se consideran peligrosos y debern ser depositados en los frascos debidamente etiquetados que estarn ubicados cerca de la tarja.

D1, D2 y R1

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C) SEPARACIN DE PIGMENTOS VEGETALES POR CROMATOGRAFA

3. CROMATOGRAFA EN COLUMNA Lavar y secar una columna para cromatografa y una pipeta Pasteur. Colocar un trozo de algodn en el fondo de ambas, cerrar y aadir un poco de fase mvil.

Ya mezcladas ambas fases se pueden introducir en la columna y en la pipeta, de manera lenta y cuidadosa.

Para empacar la columna primero se debe resuspender la fase estacionaria en la fase mvil.

La columna empacada debe tener 10 cm de longitud y la pipeta Pasteur a de su longitud.

Una vez empacadas adicionar una pequea cantidad de sulfato de sodio anhidro.

D1: Los trozos de espinaca, ptalos de flores y pastillas de la centrifugacin no son considerados residuos peligrosos, por lo que sern depositados en una bolsa de plstico proporcionada por su asesor. R1: Las mezclas de solventes para las cromatografas en papel, columna y capa fina, as como el ter de petrleo son solventes txicos, voltiles y flamables, por lo que se consideran peligrosos y debern ser depositados en los frascos debidamente etiquetados que estarn ubicados cerca de la tarja.

Una vez introducidas, permitir que se estratifiquen dentro de la fase estacionaria, dejar que la muestra corra sin que se seque la superficie.

Introducir en la columna y en la pipeta la muestra, con una pipeta Pasteur. Espinaca: 1mL Ptalos: 0.2 mL

D1, R1