PRODUKSI ASAM LEMAK OLEAT OLEH MMROBA ENDOFIT Sporodiobolus salmonicolor D A N 'IUMBUHAN KINA (Cinchonapubescens Vahl.

ESTI MUMPUNI', AMALIA', TITI PARWATI' DAN PARTOMUAN SIMANJUNTAK~~ 'Fahltas Fonnasi. Universitm Pancasilo, Srengseng Sawah, Jagakarsa Jakarta 12610 '~usotPeneIitian Bio&@ologi-WPI, JJalrm Roya Bogor Km 46 Cibinong 16911
ABSTRAK Fermentasi mikroba endofit dari tanaman kina (Cinchona pnbescens Vahl ) dalam medium Phoma telah dilakukan. Hasil fermentasi selama 8 hari diekstraksi dengan diklormetan diperoleh asam lemak yaitu asam oleat bentuk cis. Hasil ini dipertegas oleh spectra RMI (proton dan karbon) dan spectra massa (W-MS). Kntn hnei :Tmumum kina: Cinchonapibescens: Sprodiobalus salmonicolor; avmt ole&: endofit I. PENDAHULUAN Indonesia merupakan salah satu negara tropis yang kaya akan sumber daya alam hayati seperti tumbuh-tumbuhan, hewan, dan mikroorganisme, baik yang ad; di darat maupun di laut yang telah dimanfaatkan oleh manusia untuk berbagai keperluan hidup sebagai sumber bahan kimia yang berguna untuk beragam obat, pestisida, makanan dan bahan aktif lainnya. Kekayaan inilah yang ha& digali dan dipelajari potensinya. Penggunaan tanaman obat telah diterima makanan untuk mikroba, sedangkan mikroba mentransformasikannya, dan menghasilkan senyawa bioaktif dan beberapa sdnyawa yang melindungi tanaman dari tie$ai serangga, atau mikroba. Mikroba endofit biasanya hidup dalam intraselular kulit batang, 'aka, atau daun tanaman (Song, Y., 1998) Penggunaan mikroba endofit sebagai penghasil zat yang sama dengan inangnya banyak diteliti dan terus berkembang. Pada 'tahun 1996, Strobel dkk berhasil mengisolasi paklitaksel dari mikroba endofit yang tumbuh pada Tmis brevifolia(Stierle, A. and G.A. Strobel, 1995; Strobel, G.A., 1996; Stierle, A,, and D.Stierle, 1995) dan tahun 2002, Simanjuntak dkk berhasil mengisolasi jamur endofitik yang menghasilkan senyawa alkaloid kinin dari Cinchona pibescens Vahl(Simanjuntak, P., dkk., 1999; Simanjuntak, P., dkk. 2002, Simanjuntak, P., ). Oleh karena itu, berdasarkan penelitian-penelitian yang telah dimemegang peranan penting dalam memproduksi senyawa bioaktif Mikroba endofit dapat diisolasi dari jaringan tanaman dan ditumbuhkan pada medium fermentasi dengan komposisi tertentu. Mikroba endofit di dalam medium fermentasi akan menghasilkan senyawa metabolit sekunder. Alchemy, Vol. 3, No. 2, September 2004: 1621

. di

kalangan masyarakat, karena merupakan

pengobatan alternatif yang cukup efektif Salah satu tanaman obat yang bermanfaat dalam bidang kesehatah adalah tanaman kina (Chinchona spp.), terutama bagian kulit batangnya yang menghasilkan beberapa senyawa kimia, antara lain kinin, kinidin, sinkonin dan sinkonidin. Kinin merupakan obat antimalaria terhadap Plmmodium Ada beberapa tanaman kina yang falciform.

terdapat di Indonesia, sepem Cinchona s~ccinibra. lakukan menunjukkan bahwa mikroba endofit C. plrbescens, dan C. ledgerianu. Salah satu kelompok mikroorganisme yang sangat penting adalah mikroba endofit. Mikroba endofit adalah mikroba yang hidup dalam jaringan tanaman dimana mempunyai tipe interaksi antara endofit dan tanaman inangnya adalah mutualisme, tanaman memberikan nutrien

Beberapa keuntungan memproduksi senyawa metabolit sekunder dengan m a fermentasi mikroba antara lain mikroorganisme dapat mudah d i b i i a n dalam medium fermentasi; perbanyakan produksi relatif lebih mudab dalam mikroorganisme; senyawa metabolit sekunder yang berbeda dapat diproduksi dengan merubah kondisi dan komposis kultur dan menguntungkan dari segi ekologi serta ekonomi. Sehingga perlu dilakukan penelitian produksi senyawa bioaktif dari mikroba endofit yang dapat menghasilkan metabolit sekunder. Pada penelitian ini digunakan isolat mikroba endofit F,, (Sporidiobol~tssalmonicolor). Mikroba endofit ini hidup dalam jaringan . kulit batang tanaman kina merah (Cinchona plrbescens Vahl), lalu diisolasi dan diinkubasi dalam medium yang sesuai. lsolat Fll yang telah diperoleh diperiksa kemurniannya secara periodik, kemudian difermentasikan pada medium Phoma yang mengandung makronutrien dan mikronutrien yang cukup lengkap (Mumpuni, Esti, 2003). zat Selanjutnya, medium phorna diekstraksi,
\

(Nacalaitesque); Besi (111) klorida heksabidrat (Wako); Mangan (11) sulfat (Wako); Asam borat (Wako); Kalium Iodida (Wako); Silika gel 60 (Nacalaitesque); Selit 545 f,E.Merck); Pasir laut

B 20-50 mesh (Nacalaitesque); Serium (II) sulfat

(Brataco); bromida Diklorometan (E.Merck); (Brataco); Deutero Kalium kloroform

(Nacalaitesque); Tetrametilsilan (Nacalaitesque); n-heksan (Brataco); Etanol95% (E.Merck)

Alat
Perangkat alat untuk isolasi dan inokulasi mikroba seperti Jarum ose; Lampu spiritus dengan diameter 2 mm; Autoklaf; Laminar air ,floiv (LAF); Bejana kromatografi; Mikropipet kolom; merah Eppendorf; Labu Erlenmeyer; Beaker glass; Timbangan menggunakan analitik; Kromatografi infra Instrumen untuk identifikasi senyawa isolate Spektrofotometer (Shimadzu); Kromatografi gas-spektrometer massa

(HP GC 5890 seri 11-MS 5989 B); Spektrometer

resonansi magnetik inti karbon dan proton (RMI
JEOL)

kimia yang dihasilkan, diisolasi dan diidentifikasi dengan pengambilan data-data spektrometri seperti infra merah, spektroskopi massa dan resonansi magnetik inti proton dan karbon.

Cam Kerja

1. Persiapan mediom

Bahan-bahan medium ditimbang untuk 200 ml medium prekultur dan 600 ml sebanyak 2 kali untuk medium kultur. masing-masing media dilarutkan dengan air murni dalam labu Erlen-

11. METODOLOGI PENELITIAN

meyer, lalu dipanaskan dan dihomogenkan dengan pengaduk magnetik sampai hahan media larut, dan disterilisasi selama 15 menit pada otoklaf dengan suhu 12l0C 2. Medium regederasi Sejumlah 3.9 g Potato Dextrose Agar (PDA) dilarutkan dalam 100 ml air murni dalam labu Erlenmeyer, lalu dipanaskan dan dihomogenkan menggunakan pengaduk magnetik sampai larut. Kemudian dimasukkan ke dalam

Bahan
Bahan penelitian utama adalah khamir yang diisolasi dan dimurnikan dari kulit batang tanaman kina merah (Cinchona pabesceiw Vahl); Potatoes dextrose agar (Difco); Sukrosa (Wako); Baktopepton (Difco); Ekstrak malt (Difco); Kalsium nitrat (Wake); Seng sulfat heptahidrat (Wako); Kalium nitrat (Wako); Kalium klorida (Wako); Natrium dihidrofosfat monohidrat

PYorluksi Asam Lemak.. . (Esti Mumpuni, dkk)

tabung reaksi. Medium disterilisasi menggunakan otoklaf pada suhu 121C selama 15 menit. Medium dikeluarkan dari autoMaf lalu ditempatkan pada posisi miring dan dibiarkan hingga memadat.
3. Medium prekultur

8. Ekstraksi

Setelah kultur berumur 8 hari,

kultur

diekstraksi dengan diklorometan 50 ml sebanyak tiga kali dengan menggunakan wrong pisah, sehingga terpisah fase diklorometan dan fase airnya. Masing-masing fase kering.
9. Ausliis Kromatografi Lapis Tipis (KLT)

diuapkan sampai

Sukrosa (10 g), baktopepton (1 g), ekstrak malt (0,5 g), kalsium nitrat (0,025 g), kalium klorida (5 mg), natrium dihidrofosfat monohidrat (2 mg), besi @I) Morida heksahidrat (2 mg), mangan (II) sulfat (0,5 mg), asam borat (0.14 mg), kaliun iodida (0,7 mg), dilarutkan dalam 100 ml air murni. 4. Medium Kultur Komposisinya sama dengan medium prekultur.

Pada tahap awal, identifikasi tiap fase dengan KLT menggunakan lempeng silika gel
GF254, untuk mengetahui fase yang diduga

mengandung metabolit sekunder.

Identifikasi

dengan KLT juga dilakukan terhadap hasil fraksi dari kromatografi kolom. Semua fraksi diamati bercak yang timbul pada lempeng KLT, diamati lalu pada WZSA disemprot dengan serium (11) sulfat 1%.
10. Pemurnian dengau kromatografi kolom

5. Inokulasi khamir dalam medium regenerasi

Ke dalam medium regenerasi po'lafoes dextrose agar (PDA) yang telah disterilkan, digoreskan secara aseptis satu ose isolat F,, (Sporidiobolzrs salmonicolor) di ruang laminar, kemudian didiamkan selama 7 x 24 jam pada suhu kamar.
6. Iuokulasi khamir dillam mediumprekultur

Pada tahap awal, fase diklorometan yang mengandung metabolit sekunder, dilakukan pemisahan secara kromatografi kolom. Sejumhh ekstrak yang mengandung metabolit sekunder yang akan dipisahkan ditambahkan selit 545 untuk menghomogenkan ekstrak. Pelamt yang digunakan adalah campuran n-heksan : diklorometan secara gradien. Eluat dari masing-masing 10 ml fraksi yang ditampung dalam tabung reaksi, diuapkan,

Ke dalam medium prekultur (Phoma) 200 ml sebanyak 2 kali yang telah disterilkan, masingmasing diinokulasi secara aseptis 20 ose isolat F11 (Sporidiobolus salmonicolor) yang berumur tujuh hari di ruang laminar, kemudian digojog dengan kecepatan 150 rpm selama 24 jam pada suhu kamar.

dm diidentifikasi dengan KLT. Fraksi yang

mempunyai kromatogram yang sama digabungkan. 11. ldentifikasi Senyawa isolate mumi hasil kromatografi kolom diidentifikasi dengan cara mengambil data spectra dari infra merah dengan tujuan mengetahui gugus-gugus fungsional yang terdapat pada senyawa. Pengambilan data spectra Infra merah dilakukan dengan metode pellet KBr. Resonansi magnet inti (RMI proton, karbon. DEPT) untuk mengelahui jumlah proton dan karbon yang dikur Alchemy, Vol. 3, No. 2, September 2004: 16-21

7. Inokulasi khamir dillam medium kultur

Larutan prekultur (10% volume kultur) diinokulasikan kedalam medium kultur yang komposisinya sama dengan media prekultur. Kultur kemudian digojog dengan kecepatan 150 rpm selama 8 h i .

pada instrument NMR E O L 500 MHz dalam pelarut CDCb. Sedangkan pengambilan data spektra masa dilakukan untuk mengetahui bobot molekul dari senyawa yang diukur pada instrument GC-MS dengan kondisi sebagai berikut : Nama instrumen : Hawlett Packard 5890 sen I1 dengan detektor : FID (detektor pengionisasi panas). Kolom kapiler : HP - FFAP (mengandung asam nitropterephtalat dan polietilenglikol); Panjang : 30 Gambar 2. Hasil analisis KLTdari fraksi-fraksi kromatografi kolom Fraksi 111yang menunjukkan isolat murni, kemudian diidentifikasi dengan pengambilan datadata spektra dari spektrofotometri infra merah

m, diameter 0,25 mm, tebal film 0,25 pm; Gas

pembawa : helium. Suhu kolom : Suhu awal 150C. ditahan 1 menit dan dinaikkan 10C per menit sampai 250C; Suhu injektor : 200C; Suhu detector : 250C; Aliran gas pembawa : 0,9 mllmenit.

(M, I) resonasi magnet inti (RMI proton, karbon,

dan analisis eksperimen DEPT) dan spectra massa (GGMS).

Analisis spektrofotomeh+ infra mernh (1M)

Hasil analisis spektrofotometri infra merah senyawa isolat ditunjukkan oleh Gambar 3. Sedang spektra infra merah senyawa baku cisasam oleat : hasil analisis spektra IM menunjukkan bahwa terdapat gugus-gugus seperti hidroksil (OH) pada bilangan gelombang 2990 cm-'; karbonil (C=O) pada bilangan gelombang 1700 cm-'.
.

m. HASU DAN PEMBAHASAN

Analisis kromoiogrofilempeng tipis (RLV
Ekstrak diiorometan yang diperoleh mempunyai bobot sebesar 0,3975 gl1200 mL. Analisis KLT untuk ekstrak diklorometan pada lempeng silika gel GF2s4(lempeng dieluasi dalam pelarut n-heksan diklorometan
=

,.*
8 '

., 1
I

1.1, dengan
a .
-0

!.! ,

1,;

'..

I
! !

penampak bercak serium sulfat 1%) mempunyai beberapa bercak seperti pada Gambar 1

""
s o

".

it

8%

!I!

if

Gambar 3. Spektrum infra merah senyawa isolat

Gambar 1. Kromatogram KLT untuk senyawa hasil fermentasi. Pemurnian dengan analisis kromatografi kolom (Si02, CH&-n-heksan
= 2

: 1)

menghasilkan 9 fraksi. Kromatogram kesembilan fraksi tersebut ditunjukkan oleh Gambar 2.

Gambar 4. Spektrum infra merah senyawa baku cis-asam oleat.

Roduksi Asam Lemah...

(EdMurtqruni, dkk)

Annlisis ~esonnnsi n ~ n~e( tR M I ) ~ karbon

H a d analisis RMI karbon untuk senyawa isolat, ditunjukkan oleh Gambar 5 dm Tabel 1, sedang spekaa eksperimen DEPT ditunjukkan oleh Gambar 6.

ekspenmen DEPT (D~sloi?ionless Enhancement by

PoIcmmhon TrmLsfer)memberikan jumlah karbon

tersebut terbagi dalam 1 gugus CH3, 2 gugus CH yang berikatan rangkap dua, 14 gugus CH2 dm 1 gums karbonil ( C=O )

A d i s i s Resonansi Magnet Znhnh(RMo proton

H a d analisis RMI proton menunjukkan sinyal-sinyal pada medan magnet tinggi, yaitu 6H 0,88(t,CH3),6H 1.25-2,77(d,CH~),6H4,15 dm 6H 429 ( d, CH=CH ) Spektra RMI proton Gambar 5. Spektra RMJ karbon senyawa isolat untuk senyawa isolat ditunjukkan oleh Gambar 7

Gambar 6: Spektra eksperimen DEPT Tabel 1. Pergeseran kimia karbon untuk senyawa isolat dan hasil anlisis . DEPT
(Distortionless Enhancemenf
by

Gambar 7 Spektra RMI proton smyawa isolat

Annlisis spektra mnssa

Analisis spektra massa (GC-MS) dan hasil fragmentasinya menunjukkan bahwa bobot molekul senyawa isolat mempunyai m/z pada 282, dan mempunyai 6agmentasi m h pada 69, 83, 97, 111, 129, 148, 185, 213, 235, 253, 282 SpekUum massa untuk senyawa isolat ditunjukkan oleh

~.

Gambar 8.

H a d analisis resonansi magnet inti karbon menunjukkan bahwa pada senyawa isolat terdapat 18 atom karbon dan berdasarkan analisis Alchemy, Vol. 3, No. 2, September 2004: 16-21 Gambar 8. Spektmm massa untuk senyawa isolat

Berdasarkan data-data spektrofotometri i n h merah yang menunjukkan adanya C=C, C=O,

DAFTAR PUSTAKA

OH; dari resonansi magnet inti karbon (18 atom

C); resonansi magnet inti proton adanya gugus CH3, CHZ, CH=CH dan spektrometri massa yang menunjukkan bobot molekul 282, maka senyawa isolat yang diperoleh dari hasil fermentasi mikroba endofit dari tumbuban kina adalab senyawa asam 9-oktadekanoat (cis-asam oleat) seperti ditunjukkan oleh Gambar 9. Penentuan bentuk cis dari asam lemak tersebut ditunjukkan dengan membandingkan data spektra

Mumpuni, Esti., 2003IsoIasi dan elusidasi stmktur kimia senyawa hasil fermentasi mikroba endofit dari tanaman Cinchona pbescens Vahl [fesis Pasm smjm]. Jakarta. Jurusan Farmasi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Universitas Indonesia; skripsi,. hal. 44,3649. Song, Y., 1998, Isolation and cultivation of endophytic fungi. Asian network on microbial resrarchm;255-258. Stierle. A. and G.A. Strobel.. 1995. The research for a taxol producing microorganism among the endophytic fungi of the pacific yew T a u s brevifolia. Journal of nafural producf;1315-1324. Strobel, G.A., 1996, Endophytic fungi. New sources for old and new pharmaceuticals. Pharmacetrtical news;3:7-9. Stierle, A,, and D Stierle, 1995, Bioactive rnetabolitesof the endophytic fungi of pacific yew Tmrs brevifolia. American chemical society;81-97. Sirnanjuntak, P. Titi Parwati, Nia Kurnia, Judhi Rahmat, dan Nita Rosalinda., 1999, Investigation of bioactive compounds from microbial resources in indonesia : bioactive metabolites from endophytic microbes of "kina", Cinchona spp. Proceeding on JSPS-NCRT:DOST/LIPI/ VCC Joinf Seminar in Penang< Malaysia, Nov. 22-24, 161-164

iM

untuk

pembanding asamoleat bentuk cis (Lihat Gambar 4). Hasil ini juga ditunjang oleh data RMI karbon yang mernberikan pergeseran kimia yang khas pada 6H 129,6 ppm dan 129,9 ppm (C=C) yang karaktersitik untuk bentuk cis.

Gambar 9. Stnrktur kimia asam oleat bentuk cis N. KESIMPULAN Mikroba endofit

Simanjuntak P., Titi Panvati, Bustanussalam, T.K. Prana, S. Wibowo, & H. Shibuya., 2002, Produksi alkaloid kuinin oleh beberapa mikroba endofit dengan penambahan zat induser. Majalah farmasi Indonesia, vol. Sporod~oboli~s 13(1), 1-6. Simanjuntak, P., Titi Panvati, Bustanussalam & H. Shibuya. Isolasi dan kultivasi mikroba endofit pengbasil senyawa alkaloid kinolin dari Cinchona spp., J. mikrobiol. Indonesia, vol. 7 , no 2,27-30.

salmonicolor dari kulit batang tanaman kina (Cinchonapubescens Vabl.) yang difennentasikan

dalam medium Phoma selama 8 hari mampu menghasilkan asam oleat [ as-9-oktadekanoat

Wl

. .

Prodnksi Asam Lemok ... (E.4 Mumpuni, dkk)