PCR & SECUENCIACIN

Huella Gentica: nuestra firma molecular

La Unidad de Genmica del Parque Cientfico de Madrid (FPCM) pone a disposicin de sus usuarios la tecnologa ms puntera para determinar la huella gentica en individuos.

nes muy diversas. Por ejemplo en microbiologa es una herramienta muy til capaz de alcanzar una precisin a nivel de sub-especie, donde otras tcnicas no son capaces de llegar; en veterinaria, puede resultar enormemente til para los estudios de evolucin de especies salvajes, para determinar el grado de distanciamiento entre animales domsticos o para definir el posible aislamiento de poblaciones animales causadas por el impacto humano, entre otros muchos ejemplos. Microsatlites (STRs) frente al conocido SNP La Unidad de Genmica del Parque Cientfico de Madrid utiliza los microsatlites como marcadores genticos para la identificacin. Nuestro conocimiento actual de la organizacin del genoma humano nos est permitiendo identificar las regiones donde se acumulan las alteraciones que nos distinguen a unos individuos de otros. El tipo de alteracin gentica ms extendida es la sustitucin de una base por otra dentro de la cadena de DNA, cambio conocido como SNP, por Single Nucleotide Polymorphism. Sin embargo, existe otro tipo de variacin, tambin habitual y sobre todo enormemente informativa en identificacin, la STRs (Short Tandem Repeats), que consiste en la acumulacin de repeticiones de una secuencia muy corta. Estas regiones de elementos repetitivos consecutivos y de nmero variable se conocen como microsatlites. El elemento que se repite es siempre el mismo en cada regin, pero el nmero de veces en que se presenta es variable en cada persona, lo cual proporciona la posibilidad de utilizar a los microsatlites como autnticos marcadores genticos para la identificacin de los distintos individuos entre s. Comparando este tipo de variacin basado en la acumulacin de regiones cortas (STRs) con el anlisis de SNPs, la capa-

Ricardo Ramos, Elosa Sanz, Parque Cientfico de Madrid

La informacin gentica de los seres vivos est contenida dentro de una nica molcula de DNA, que transportan en forma de doble copia todas las clulas nucleadas de nuestro organismo. El DNA de todos los individuos de la misma especie comparte casi la totalidad de su secuencia, pero hay pequeos cambios genticos responsables de variaciones que nos diferencian, modificando nuestra capacidad de accin ante procesos tan importantes como la respuesta a frmacos (base de la farmacogenmica), la forma en que toleramos y asimilamos los alimentos (nutrigenmica), la susceptibilidad a enfermedades o la actuacin ante diversos estmulos. Adems de la importancia de la variabilidad gentica como objeto de estudio en s misma, capaz de explicar diferencias biolgicas entre individuos, el DNA es tambin un marcador personal, es decir, puede servir para identificar a una persona y distinguirla de forma inequvoca respecto al resto de la poblacin. Es lo que se conoce como la huella gentica de un individuo. Aplicaciones Las aplicaciones de la huella gentica son muy variadas: La huella gentica es una autntica firma molecular de utilidad siempre que se necesite veri2

ficar la identidad de una persona. Por ejemplo, es indispensable para identificar restos procedentes de accidentes masivos como los accidentes areos o los naufragios, en los que se requiere identificar las distintas vctimas con el nico acceso a restos de difcil identificacin por otros mtodos. El estudio de la huella gentica puede realizarse a partir de muestras minsculas tales como, un bulbo piloso, restos de tejido epitelial o volmenes muy pequeos de sangre. Asociada a las tcnicas actuales de purificacin de DNA, la determinacin de la huella gentica se ha convertido en una herramienta poderosa en las aplicaciones forenses. En medicina forense, una identificacin de tanta precisin sirve tanto para incriminar como sobre todo para exculpar a un sospechoso en base a las huellas genticas presentes. En el mbito de la clnica y la biologa molecular, la determinacin de la huella gentica es de utilidad para determinar relaciones de parentesco, ya que las huellas procedentes de familiares directos presentarn coincidencia de algunos marcadores al ser heredados de progenitores comunes, estableciendo una base firme sobre la cual realizar la confirmacin de paternidades. El anlisis de huellas permite establecer relaciones genticas hasta el punto de permitir rastrear la evolucin geogrfica de

La huella gentica es una autntica firma molecular de utilidad siempre que se necesite verificar la identidad de una persona
poblaciones humanas y el posible origen y las relaciones genticas entre poblaciones separadas. Permite deducir cmo se han producido los flujos migratorios en una escala temporal relativamente extensa, a lo largo de la historia y prehistoria humanas. Uno de los usos ms importantes desde el punto de vista de la sociedad actual es hacer disponible el servicio de huella gentica a las familias de hijos adoptados y para los nacidos mediante tcnicas de fertilizacin asistida con participacin de vulos o espermatozoides procedentes de donantes. De esta manera se obtiene informacin esencial para cualquier identificacin futura que se necesite, en ausencia de material gentico procedente de sus progenitores biolgicos. La utilidad de la huella gentica no se limita a la gentica humana, sino que tiene aplicacio-

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cidad resolutiva de la primera se ve enormemente favorecida cuando se trata del estudio de la huella gentica: En el caso de los SNPs, solamente se suelen presentar dos de las cuatro posibilidades tericas, lo cual limita la probabilidad de encontrar al azar una variante determinada. Por el contrario, el nmero de variantes distintas dentro de una poblacin para cada microsatlite es muy superior, por lo cual una sola determinacin tiene mucha mayor capacidad informativa por s misma, esto es, cada variante se presenta con menor frecuencia en la poblacin. De forma simplificada, si la aparicin de cualquier variante fuera igualmente probable, el anlisis de 4 SNPs proporcionara unos resultados con un margen del 6 % (6 de cada 100 individuos coincidiran al azar en esa combinacin de caracteres), mientras que el anlisis de 4 STRs, cada uno de los cuales con 6 alternativas posibles en nmero de repeticiones reducira el margen a 0,08 % (solamente 8 de cada 10.000 individuos podra coincidir en esa distribucin de alelos). Combinando un nmero suficiente de marcadores independientes y utilizando STRs donde el nmero de alternativas presentes en la poblacin sea amplia, podemos llegar a definir un perfil identificativo de cada persona, donde la probabilidad de que ese perfil exista por azar en cualquier otra persona del mundo sea absolutamente despreciable, salvo en el caso de los gemelos. Ese conjunto de polimorfismos especficos de cada persona tiles para identificarnos sin ambigedades es lo que conocemos como Huella Gentica y fue ideado hace varias dcadas como sistema de identificacin y diagnstico. Procedimiento El cuanto al procedimiento de determinacin, la Unidad de Genmica del Parque Cientfico de Madrid ofrece el servicio de

Figura 1: Determinacin de una huella gentica mediante el sistema ampFLSTR. Una vez que la muestra llega al laboratorio de DNA del Parque Cientfico de Madrid, el personal de la FPCM se encarga de purificar el DNA, amplificar en multiplex los STRs adecuados (incluyendo un anlisis de cromosoma X / cromosoma Y, para identificar tambin el sexo), resolver los fragmentos en electroforesis capilar y alinear los resultados con los perfiles de amplificacin posibles para cada alelo, asignando un perfil de marcadores que es nico para ese individuo.

La Unidad de Genmica del Parque Cientfico de Madrid utiliza los microsatlites como marcadores genticos para la identificacin
determinacin de huella gentica, basado en el sistema AmpFLSTR y realizado mediante el proceso de amplificacin por PCR anlisis en electroforesis capilar asignacin de marcadores en base al nmero de repeticiones (tamaos amplificados). El material gentico necesario para realizar una determinacin de huella gentica es enormemente simple. El proceso comienza cuando un usuario interesado acude a las Unidades de Desarrollo Tecnolgico que el Parque Cientfico de Madrid pone a disposicin de sus usuarios (Hospitales de la red asistencial, organismos pblicos de investigacin, grupos de investigacin universitarios, entre otros). Una vez all, basta una

pequea cantidad de sangre o cualquier otro material que contenga clulas nucleadas, como un frotis o lavado bucal, para poder disponer de material gentico suficiente para que el personal de la FPCM inicie el anlisis. El anlisis de huella gentica se basa en el uso de dos tcnicas complementarias: En primer lugar, las regiones variables objeto de estudio se amplifican mediante la tcnica de PCR (reaccin de polimerizacin en cadena), lo cual multiplica las secuencias diana mediante una reaccin de amplificacin de DNA controlada por la incorporacin de iniciadores (cebadores) especficos. Dichos cebadores dirigen la amplificacin de todos y cada uno de los fragmentos que sern objeto de anlisis, es decir, de tantos fragmentos de DNA como regiones hipervariables se estudien a continuacin. Los cebadores deben amplificar el DNA independientemente de la identidad concreta de alelos presentes en cada caso, y lo hacen en una reaccin denominada multiplex (todos a la vez), que resulta en la obtencin de millones de copias de cada fragmento a partir de cada molcula de DNA molde original. Este DNA amplificado se marca con compuestos fluorescentes mientras se desarrolla su sntesis, quedando en condiciones de ser analizado.

La segunda fase del proceso supone determinar la longitud de los productos analizados, y se efecta en equipos de electroforesis capilar conocidos como secuenciadores automticos. Estos equipos hacen atravesar la muestra a travs de una matriz molecular donde las molculas grandes encuentran dificultad para moverse, mientras que las de menor tamao atraviesan con mayor facilidad. De esta forma, registran las distintas molculas de DNA presentes en la mezcla inicial, separadas en funcin de sus tamaos, lo cual es una medida del nmero de repeticiones presentes en cada cadena. De todas las posibles variantes posibles para cada STR, cada individuo presentar dos formas allicas, una heredada de cada progenitor. El conjunto de todas las variantes analizadas corresponder a su perfil de huella gentica, que ser un rasgo distintivo, tan especfico como definan el nmero y significado de los marcadores analizados. Contando con todas las garantas de confidencialidad, el usuario recibe en un plazo de pocos das el resultado de la determinacin: un perfil gentico donde se especifican los alelos existentes para cada marcador, para su posible uso en cualquier tcnica de identificacin que se pueda necesitar en el futuro 3

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