PRACTICA N 5 TITULO: ANTIBIOGRAMA EJECUTOR: Aguilar Araca Rudy Fernando

RESUMEN
La observacion se realizo en el Laboratorio de Investigacion de la Universidad Nacional del Altiplano Puno(Medicina Humana). Los objetivos fueron: a) Conocer las propiedades del agar de Mller-Hinton y preparar el medio de cultivo, para realizar una prueba de sensibilidad antimicrobiana. b) Interpretar lo resultados (lectura de placas).La metodologia utilizada en esta oportunidad fue: antibiograma por difusion; este procedimiento se rige por la tecnica de Bauer-Kirby; pasos que se sigui: preparacion del medio de cultivo, preparacion de inculo, inoculacion de las placas y aplicacin de los discos, e incubacion. Los resultados obtenidos nos llevan a la conclusion de que los microorganismos que se utiliz eran poco infecciosos, se trataba de flora normal(colonia amarilla); y que el agar de Mller-Hinton es la mejor opcion para realizar una prueba de sensibilidad.

Palabras clave: antibiograma, discos de sensibilidad, halos de inhibicion, microbiologia aplicada, agar de Mller-Hinton Abstract : The observation was performed in the Research Laboratory of the Universidad
Nacional del Altiplano Puno (Human Medicine). The objectives were: a) Know the properties of Mueller-Hinton agar and prepare the culture medium for antimicrobial susceptibility testing. b) To interpret the results (plate reader). The methodology used on this occasion was: diffusion antibiogram, this procedure is governed by the Kirby-Bauer technique, followed steps: preparation of culture media, preparation of inoculum inoculation of the plates and applying discs, and incubation. The results lead us to the conclusion that the microorganisms used were not very infectious, it was normal flora (yellow colony) and the Mueller-Hinton agar is the best option to perform a sensitivity test

Keywords: susceptibility, sensitivity disks, halos of inhibition, applied microbiology, Mueller-Hinton agar I) INTRODUCCIN
Las pruebas de sensilidad antimicrobiana evaluan la capacidad de un antimicrobiano para inhibir in vitro el desarrollo bacterino, esta capacidad puede determinarse por el metodo de difusion o por el de dilucion, en esta oportunidad nos ocuparemos del antibiograma por difusion. Metodo de difusion de agar.- Este metodo, que sufrio diferentes modificaciones fue estandarizado por Bauer-Kirby, representa la prueba de susceptibilidad ms ampliamente utilizada en bacteriologia clinica, porque permite obtener resultados exactos mediante un mtodo estandarizado, sencillo, de ejecucion rpida, economico y facil de reproducir.(Negroni, Marta:Microbiologia estomatologica,

2da edicion). Dichos pasos y normas que se siguieron hace que lo resultados sean confiables, y esta manera se puede reproducir y comparar entre diferentes laboratorios. Al finalizar esta prueba se procede a la medicin y la interpretacin de la zona que circunda el disco ,ste informa si el microorganismo es sensible(S) , resistente(R) o intermedio(I);a partir de ah se procederia a seguir un tratamiento con el antimicrobiano mas optimo y prevenir posibles resistencias.

II)

OBJETIVOS
Conocer las propidades del agar de Mller-Hinton (MH) y preparar el medio de cultivo, para realizar una prueba de sensibilidad antimicrobiana. Interpretar los resultados (lectura de placas).

III)

MATERIALES Y MTODOS:
A) PREPARACIN DEL MEDIO DE CULTIVO.-Fundamento: Se requiere un medio de cultivo para recrear un medio artificial para lograr que el microorganismo a tratar logre establecerse y poder cumplir su ciclo de vida, para asi poder estudiarlo en el laboratorio; las condiciones y/o requisitos que debe reunir son, por ejemplo: contener nutrientes adecuados, poseer humedad suficiente, tener pH ajustado, estar esteril inicialmente,etc -Procedimiento: En esta prctica se trabajar con 5 placas petri. a) En las instrucciones del frasco del agar menciona que se necesita 37 gramos para 1000 ml de solucin(foto nmero 01), entonces para las 5 placas petri se necesitar(por regla de tres simple): 37g.(de agar M.H) 1000 ml. X g. (de agar M.H) 100 ml. Despejando x: X= 3.7 g. de agar de Mller-Hinton. (Foto nm. 02)

Foto nm. 01: agar MllerHinton

Foto nm. 02: 3.7 gramos de agar MH

b) Se esteriliz los instrumentos a utilizar, con ayuda del autoclave (Foto nm. 2.1).

Foto nm. 2.1: Esterilizacin (vaso precipitado, tubo de ensayo, caja petri)

c) En un vaso precipitado mezclamos la cantidad de agar que se necesitar (3.7 g.) con agua destilada, posteriormente aplicar en las capsulas petri. (Foto nm. 03 y
Foto nm. 04)

Foto nm. 03: Vaso precipitado, con la solucin de agar MH

Foto nm. 04: Mezclando el agar MH.

Foto nm. 03.1: Vaso precipitado

B) PREPARACION DEL INOCULO.-Fundamento: Consiste bsicamente en tomar una muestra del desarrollo del microorganismo a estudiar (dicho desarrollo se hizo en la prctica numero 4, necesariamente tendr que ser un cultivo puro), y suspenderlo en suero fisiolgico estril (para esterilizarlo). (Foto nm. 05)

Foto nm. 05: Muestra de Microorganismo puro

-Procedimiento : a) Tomamos la caja petri con el (los) microorganismo(s) a estudiar de un cultivo puro.

b) Suspensin homognea: -Esterilizar la punta del asa de platino (dicha esterilizacin se debe hacer acercando a un mechero el objeto a esterilizar)( Foto nm. 06). -Inmediatamente, con el asa de platino se toca 4 5 colonias (separademente). -Se le lleva a un tubo con solucin de suero fisiolgico estril, en el cual se debe remojar el asa con movimientos adecuados para que el microorganismo se deposite en la solucin (Foto nm. 07:). NOTA: Este procedimiento se debe realizar cerca de un mechero, y cuando se estiriliza la punta del asa de platino no debe calentarse hasta que adquiera un color rojo vivo, solo consiste en calentarlo mnimamente.

Foto nm. 06: Mechero, asa de platino

Foto nm. 07:Suero fisiolgico esteril, suemergiendose en la misma el microorgamismo.

c) Despues de realizar la suspensin homognea, se debe esperar 15 minutos, para realizar el procedimiento que a continuacin sigue (procedimiento C).

C) DISCO DE SENSIBILIDAD (Inoculacion de las placas y aplicacin de los discos).-Fundamento: Para tener un resultado-respuesta optimo, el cual se busca; se debe de sembrar la suspensin en el cultivo agar de Mller Hinton (el cual fue preparado en el procedimiento A, reproduciendo as las condiciones en que se encuentra el microorganismo dentro de los tejidos o liquidos orgnicos), para que le microorganismo lleve acabo su metabolismo, desarrollo y su reproduccin, solo as se podr determinar la resistencia o el grado de sensibilidad del microorganismo frente a diferentes antimicrobianos. -Procedimiento: a) Se sumerge un hisopo de algodn esteril en la suspension (osea en el inculo), se hace rotar presionando sobre las paredes del tubo por

encima del nivel de liquido, para remover el exceso de inculo.( Foto nm. 08)

Foto nm. 08: Se sumerge el hisopo en al suspension

b) A continuacin se siembra sobre la superficie del medio de cultivo (agar de MH), estrindolo 3 veces y en 3 direcciones diferentes, con el objeto de lograr una distribucin uniforme del inculo, pues debe asegurarse de cubrir perfectamente toda el rea.( Foto nm. 09)

Foto nm. 09: Siembra sobre la superficie del medio de cultivo.

c) Luego se proceder a dejar secar la placa a temperatura ambiente durante 3 a 5 minutos. d) Seleccionamos los discos de antimicrobianos a testear, luego tomamos con una pinza esteril cada uno de los discos y los aplicamos sobre la superficie del agar, presionamos suavemente en cada caso para asegurar el contacto con el medio. (Foto nm. 10, 10.1, 10.2)

Foto nm. 10:Esterilizacion de la pinza.

Foto nm. 10.1: Placas petri con discos de sensibilidad

Foto nm. 10.2: Placas petri con discos de sensibilidad

NOTA: Es aconsejable no colocar ms de 6 discos por placa para evitar la superposicin de los halos de inhibicin. D) INCUBACION.-Procedimiento: Se introduce la caja petri en posicin invertida en el autoclave (o estufa de cultivo) a 35 37 grados centgrados.

IV)

RESULTADOS.-

1).-Se destaca la importancia y cualidades de los discos de sensibilidad: -Deben tener un tamao de 5 a 7 mm y un espesor de 0.02 mm -Deben cargarse con una concentracin de antimicrobiano selectivo de manera que se obtenga una zona de inhibicin no mayor de 40 mm. -La cantidad de antimicrobiano selectivo que contiene cada disco debe ser justa, porque una sobrecarga falseara los resultados. - Los antimicrobianos que se utilizo fueron(Foto nm. 11):

Foto nm. 11: Antimicrobianos que se utiliz

*Tetraciclina(Foto nm. 12) *Rifampicina(Foto nm. 13) *Sulfametoxazol(Foto nm. 14) *Fosfomicina(Foto nm. 15) *Amoxicilina(Foto nm. 16) *Gentamicina(Foto nm. 17)

Foto nm. 12: Tetraciclina T 30 ug .

Foto nm. 13: Rifampicina RA 5 ug.

Foto nm. 14: Sulfametoxazol SXT 25 ug.

Foto nm. 15: Fosfomicina FO 50 ug.

Foto nm. 16: Amoxicilina AMX 25 ug.

Foto nm. 17: Gentamicina GM 10 ug.

2).-Fue indispensable el uso de mechero para esterilizacin de: Asa de platino, pinza (Foto nm. 18, 19, 20)

Fotos nm. 18, 19, 20: mechero, asa de platino y pinza respectivamente

3).- Autoclave, se us para tener la temperatura adecuada en cada procedimiento.

Foto nm. 21:Autoclave

V)

CONCLUSIONES. a) Se propone el uso del agar de Mller-Hinton poque: -Da resultados satisfactorios con las cepas de referencia. -Permite el desarrollo de la mayora de los microorganismos patgenos. -No antagoniza con ninguno de los antimicrobianos selectivos con los que se realiza la prueba. -Posee un pH de 7,2 a 7,4.

Foto nm. 21: agar de Mller-Hinton

b) Los resultados nos da muestra que los halos de inhibicin son amplios en la mayora de casos, lo cual nos lleva a la conclusin de que los microorganismos estudiados son poco infecciosos (se trata de flora normal), son colonia amarilla.( Foto nm. 22 y 23)( Foto nm. 22 y 23:)

Foto nm. 22 y 23:Halos de inhibicin amplios

Foto nm. 22 y 23: Halos de inbicion grandes, superpuestos

VI)

VII)

SUGERENCIAS. -Se sugiere usar microorganismos patgenos para comprender mejor el resultado de los diferentes halos de inhibicin que se presentaran con cada disco de sensibilidad. -Sugerimos que se respete y se siga los pasos del mtodo de difusin de agar, el cual fue estandarizado por Bauer-kirby y mejorado por la OMS (NCCLS en su documento M7-T), por ejemplo no se hizo la comparacin de turbidez del inculo con el estndar 0,5 de la escala de Mc farland BIBLIOGRAFA. -Negroni, Marta(2009):Microbiologia Estomatologica-Fundamentos y gua practica. -