Infectologa y Microbiologa

Presencia de Acanthamoeba en muestras ambientales de la provincia de Mendoza. Identificacin por Caracterizacin Morfolgica y confirmacin por tcnica de PCR.
Lucchesi, O ; Santos, G ; Tonelli, R ; Jercic Lara, M ; Carrizo , LC ; Salomn, MC rea de Parasitologa. FCM. UNCu. Postulado a premio Inv. Joven en Inv. Clnica

Introduccin.
Las amebas de vida libre (AVL) son protozoos anfizoicos ampliamente distribuidos en la naturaleza. Algunas son de importancia mdica como agentes causantes de infecciones en el hombre y animales. El gnero Acanthamoeba ha sido aislado a partir de una amplia variedad de hbitats tales como aire, suelo y agua (1). Su presencia en agua de ros, lagos, abasto pblico y piscinas representa un riesgo para la salud ya que el contacto con stas fuentes es la principal va de infeccin (2). La queratitis acanthamebiana (QA) es una infeccin invasiva de la crnea, caracterizada por una prdida gradual de la agudeza visual, pudiendo llegar a provocar ceguera. El desarrollo de esta enfermedad est frecuentemente asociado a usuarios de lentes de contacto, debido a que las amebas proliferan en las soluciones oftlmicas o en los recipientes de las lentes y son transferidas a la superficie corneal al ser insertada la lente (3). Algunos casos estn asociados a lesiones oculares con posterior exposicin a agua o tierra contaminada y, generalmente, estn relacionados al desarrollo de actividades laborales en ambientes rurales o la prctica de actividades deportivas acuticas (4). La incidencia de QA ha aumentado en los ltimos aos. En Mendoza, el primer caso fue reportado por el Hospital Central en el 2003 (5). Al presente, hemos diagnosticado morfolgicamente 16 casos a partir del cultivo de biopsias corneales. Uno asociado a traumatismo ocular y el resto al uso de lentes de contacto, desconocindose en todos, la especie involucrada y la fuente de contaminacin. La amplia distribucin de estas amebas y la gran variedad de especies asociadas a infecciones, genera la necesidad de profundizar la bsqueda ambiental de los diversos nichos ecolgicos de Acanthamoeba, para definir estos hbitats desconocidos, pero potencialmente peligrosos. Asimismo, debido a las similitudes morfolgicas que existen entre los diferentes gneros de AVL, consideramos de vital importancia el desarrollo e implementacin de mtodos moleculares que confieran mayor especificidad y sensibilidad al diagnstico.

Objetivos.
Nos propusimos aislar e identificar morfolgicamente Acanthamoeba spp. mediante cultivo de muestras obtenidas de diversas fuentes ambientales de Mendoza y confirmar dicha identificacin por PCR para, de esta forma, establecer las potenciales fuentes de infeccin.

Metodologa.
1. Muestras ambientales: Se recolectaron un total de 100 muestras a partir de ambientes terrestres y acuticos relacionados con el desarrollo de actividades laborales y deportivas. Al presente han sido analizadas 25 de suelo y 25 de agua. 2. Concentracin de muestras: Las muestras de suelo fueron concentradas por el mtodo de Telemann modificado y las de agua mediante decantacin y centrifugacin. 3. Cultivo xnico de Acanthamoeba: Los sedimentos obtenidos se sembraron en agar no nutritivo al 1,5%, suplementado con Escherichia coli. Los quistes y/o trofozotos fueron observados en MO (100 y 400X). 4. Cultivo axnico: Las amebas desarrolladas en cultivo xnico, fueron transferidas a medio YPG con antibiticos. 5. Coloracin de Gram: Se realiz para evidenciar quistes y/o trofozotos en los cultivos positivos. 6. Lisis celular y extraccin de DNA: Los cultivos fueron concentrados por centrifugacin y las clulas lisadas en buffer UNSET. El ADN se extrajo con la mezcla fenol:cloroformo:alcohol isoamlico (25:24:1). 7. Amplificacin por PCR: Se amplific un fragmento del gen del ADNr 18S de Acanthamoeba con el set de primers JDP1/JDP2 especficos para Acanthamoeba spp. Control positivo: cepa de Acanthamoeba genotipo T4; controles negativos: ADN del hongo Botritis cinerea y ADN de vid.

Resultados.
1. A partir de la caracterizacin morfolgica de las 50 muestras sembradas, fue observado el desarrollo de protozoos compatibles con Acanthamoeba en 14 muestras de agua y 4 de suelo (Imagen 1). 2. En concordancia con los hallazgos morfolgicos, la PCR permiti confirmar la identificacin de los aislamientos correspondientes al gnero Acanthamoeba. A partir de las 14 muestras de agua y las 4 muestras de suelo en las que fue caracterizado morfolgicamente el parsito, se obtuvo el amplicn correspondiente al fragmento ASA.S1 de alrededor 500 pb (Imagen 2). Mientras que, no se obtuvo amplmero en las

muestras en las que no fueron observados elementos parasitarios compatibles con Acanthamoeba. 3. Los porcentajes relativos de hallazgos de Acanthamoeba spp. en muestras ambientales fueron del 56% en agua (14/25) (Imagen 3a) y 16% en suelo (4/25) (Imagen 4a). El parsito fue identificado en el 90% de las muestras de agua riego (9/10), el 40% de las muestras de pileta (2/5) y el 30% de las muestras de agua corriente (3/10) (Imagen 3b). En las muestras de suelo, el 23% de los hallazgos correspondi a superficie (3/13) y el 8.3% a profundidad (1/12) (Imagen 4b).

Conclusiones.
Nuestros resultados permiten inferir que el medio ambiente de Mendoza constituye una fuente de infeccin por Acanthamoeba spp. dado que hemos demostrado la presencia de este parsito tanto en agua como en suelo. Segn los porcentajes de hallazgos ambientales de Acanthamoeba, podemos concluir que el agua posee un mayor potencial infeccioso respecto del suelo. Adems, es importante destacar que los hallazgos en piletas de natacin representan un mayor riesgo de infeccin por este parsito debido a que existe un contacto ms estrecho del hombre con estas fuentes. Por otra parte, la aplicacin de la tcnica de PCR provee una herramienta complementaria que permite confirmar la identificacin de Acanthamoeba realizada mediante caracterizacin morfolgica, proporcionando una mayor sensibilidad y especificidad a la deteccin del parsito.

Bibliografa.
1. Tsvetkova N y col. 2004. The identification of free-living environmental isolates of amoebae from Bulgaria. Parasitol. Res. 92(5):405413. 2. Vesalouma M y col. 1995. Microbiological quality in Finnish public swimming pools and whirlpools with special reference to free living amoebae: a risk factor for contact lens wearers? Br. J. Ophthalmol. 79: 178-181. 3. Cruz M y col. 2004. Estudio clnico-microbiolgico de tres casos de queratitis por Acanthamoeba spp. Enf. Emerg. 6(2):98-102. 4. Radford C y col. 1998. Acanthamoeba keratitis: multicentre survey in England 1992-6. National Acanthamoeba Keratitis Study Group. Br. J. Ophthalmol. 82(12):1387-1392. 5. Lofti A y col. 2005. Reporte de la Primera Queratitis por Acanthamoeba sp. en el Servicio de Oftalmologa, Hospital Central Mendoza, Argentina. ABCL, suplemento 3.

Imagen 1

Caracterizacin Morfolgica de Acanthamoeba en muestras ambientales. A: N de hallazgos en el total de muestras analizadas B: MO de frescos y tincin de Gram de quistes (1 y 2) y trofozotos (3 y 4) de Acanthamoeba spp. 1 y 2: doble pared qustica (flecha), 3: vacuola contrctil (vc), 4: acanthopodo.

Imagen 2

Confirmacin de la identificacin morfolgica de Acanthamoeba spp. mediante PCR. Carriles 1: control positivo: cepa de Acanthamoeba T4, 2: control negativo de PCR, 3: ADN de Botrytis cinerea, 4: ADN de vid, 5 y 7: agua pileta, 6: agua corriente, 8 y 9: agua de riego, 10 y 11: tierra superficie, 12: tierra profundidad.

Imagen 3

Frecuencia de hallazgos de Acanthamoeba en agua de la provincia de Mendoza. A: Porcentaje relativo de hallazgos en el total de muestras analizadas B: Frecuencia de hallazgos en diferentes tipos de muestras de agua.