BAB II HEAT SHOCK PROTEIN

II.1 Gambaran Umum Heat Shock protein dan Chaperone

Protein adalah bagian penting dari mikroorganisme yang merupakan komponen utama metabolisme suatu sel. Pada satu organisme ada perbedaan ekspresi protein dari jaringan satu dengan jaringan yang lain tergantung kondisi lingkungan. Perbedaan tersebut terletak pada kompleksitas dan nukleotidanya. Pada manusia terdapat lebih dari 500.000 protein yang terekspresi dan masing masing mempuyai fungsi yang berbeda-beda. Karena protein berperan penting dalam kehidupan suatu organisme maka dapat dipakai sebagai petanda keberadaan keadaan patologis tertentu.1 Sintesis protein pada semua sel akan terganggu oleh adanya stres lingkungan (hipertermia, radiasi ultraviolet, defisiensi nutrisi, bahan kimia, infeksi virus, iskemia, dll ). Gangguan tersebut terutama dalam hal stuktur dan fungsi protein, dimana protein adalah bagian penting dari mikroorganisme yang merupakan komponen utama metabolisme suatu sel. Ketika sel mengalami stres lingkungan, sel tersebut akan berhenti atau paling tidak memperlambat sebagian besar fungsi dasarnya, seperti proses transportasi, sintesis DNA, RNA dan protein. Namun, terdapat protein yang unik, yang disebut sebagai protein stres, yang diekspresikan secara khusus pada kondisi ini. Salah satu contoh respon stres yang mendasar adalah peningkatan tibatiba temperatur , yang disebut sebagai heat shock. Respon heat shock pertama kali ditemukan oleh Feruccio Ritossa (1962) yang mengamati pembesaran bagian spesial dari kromosom Drosophila melanogaster (fruit fly) setelah terapi panas pada lalat tersebut. Kemudian menjadi jelas bahwa segmen kromosom ini mengkode kelas protein yang khusus. Sepuluh tahun kemudian Tiessiere (1972), menunjukan bahwa pembengkakan ini berkaitan dengan hambatan sintesis protein normal dan adanya sintesis sejenis protein yang diberi nama protein.1,2,3,5 heat shock

Heat shock proteins (Hsp) adalah suatu protein yang dihasilkan karena adanya Heat Shock Respons (HSR). HSR adalah suatu respon berbasis genetik untuk menginduksi gen gen yang mengkode molecular chaperon, protease dan protein protein lain yang penting dalam mekanisme pertahanan dan pemulihan terhadap jejas selular yang berhubungan dengan terjadinya kesalahan melipat dari protein. HSR juga merupakan suatu tanggapan sel terhadap berbagai macam gangguan , baik yang bersifat fisiologik maupun yang berasal dari lingkungan.1,45 Jika terjadi stress yang berat maka akan mengakibatkan kerusakan dan kematian dari sel, sedangkan stress yang sublethal akan memicu reaksi selular berupa HSR, HSR ini diatur oleh suatu mekanisme yang melibatkan Heat Shock Transkripsion Factor (HSF), yang pada manusia ditemukan 3 jenis gen HSF-1,2 dan 4 dan yang paling berperanan dalam memodulasi HSR adalah HSF-1. Pada gambar 1 ini menjelaskan beberapa faktor yang mengaktivasi HSF-1. HSF-1 ini dapat dihambat dengan mekanisme umpan balik negativ melalui interaksi nya dengan Hsp 70 dan Hsp 90, dimana ekpresi yang berlebih dari kedua Hsp ini pada suatu sel akan mengakibatkan terminasi ekpresi gen HSF (Proses autoregulasi).1,4,5

Gambar 1.Peran Heat Shock Faktor (HSF)45 3

Gambar 1 ini juga menerangkan bahwa aktivasi HSF akan menginduksi ekpresi Hsp yang berfungsi dalam mencegah terjadi nya kesalahan dalam melipat protein , menginduksi cytoprotektif, mempromosikan jalur pensinyalan untuk pertubuhan sel, mencegah apoptosis, dan menghambat penuaan.45 Heat shock proteins (HSP) diinduksi oleh beberapa stimulasi selain hipertermi itu sendiri. Tabel dibawah ini mencantumkan beberapa contoh stres lingkungan yang mengarah pada ekspresi dari HSP melalui HSF.4

Type Stres atau Stressor Fisik Oksigen

Diskripsi Panas (demam),dingin,radiasi,sinar UV ROS (reaktif oxygen spesies),Hydrogen peroksida, perubahan dari anaerob ke aerob (reperfusi), Hyposia dan anoxia (iskemia) Alkalosis, asidosis Infeksi, Inflamasi, Demam Emosional, Ketidakseimbangan Hormonal Perubahan konsentrasi garam, gula dan komponen osmotic lainnya Kelaparan Puromycin, tetrasiklin, asam nalidiksat Etanol, methanol, butanol Kadmium, tembaga, kromium, seng, timah, aluminium, merkuri, timah, nikel kompresi Pengeringan, benzena dan turunannya, fenol dan turunannya, teratogen, karsinogen, mutagen, arsenite, arsenate, analog asam amino, nikotin, anestesi, insektisida, pestisida

PH Biologik Psikologik Osmotik Nutrisi Antibiotok Alkohol Metal

Mekanikal Lain-lain

Tabel 1.Stres sel .4 Hsp terdiri atas beberapa keluarga molekul dan merupakan protein yang paling berhasil bertahan selama proses evolusi. Banyak yang diekspresikan pada sel mamalia dalam keadaan normal (Hsp Kostitutif). Sebagian hanya muncul jika ada stressor (Hsp inducible) yang dapat memutuskan sistesi protein normal.3,8

Hsp yang diekpresikan dalam keadaan normal dapat juga meningkat jika ada stressor. Respon yang cepat ini merupakan mekanisme proteksi. Protein ini juga mempuyai fungsi

penting pada sel yang tidak dalam keadaan stress, misalnya mengatur lipatan protein, penyusunan, dan peletakan protein intrasellular.1,3,8 Dengan kata lain Hsp bertugas memastikan setiap protein dalam tubuh dalam bentuk yang seharusnya, ditempat yang seharusnya dan diwaktu yang seharusnya, disamping itu juga Hsp menjadi pengawas untuk memastikan kematian sel, menentukan sel yang sudah rusak atau yang sudah tua untuk dihancurkan dalam proses kematian sel.1,4,8 Pada keadaan normal Hsp banyak ditemukan didalam sel yang berperan sebagai molekul pendamping yang disebut sebagai Chaperone (gambar 2). Chaperone berasal dari bahasa Prancis yang secara harafiah berarti pengantar.1,4

Gambar 2.Diagram Protein dan Chaperone.4

Dari gambar 2 ini, terlihat fungsi chaperone sebagai molekul pendamping, dimana pada awal Translasi dari messenger RNA (mRNA) terjadi di ribososme (1). Pelipatan (folding) 5

polipeptida tua dimulai, dibantu oleh chaperone (2). Polipeptida berlanjut menuju pelipatan posttranslasional (post-translational folding) (3). Protein yang baru dilipat dengan benar ke dalam struktur tersiernya (4). Beberapa protein ditranslokasikan kedalam organel, seperti mitokondria (5). Polipeptida yang tidak terlipat (unfolded) atau salah terlipat (misfolded) mengalami agregasi (6). Dan presipitasi dalam suatu inclusion body (7). Polipeptida tidak terlipat (unfolded) atau terlipat sebagian (partially folded) dibebaskan dari agregasi oleh chaperone (8). Dan dilipat ulang (refolded) (4). Atau mengalami degradasi di proteasome (9). Panah merah menyatakan jalur menuju pelipatan (folding). Panah hitam putus-putus menunjukkan jalur menuju pembukaan lipatan (unfolding) dan agregasi yang diinisiasi oleh stresor sel. Panah hijau menyatakan jalur menuju degradasi. Jalur dari tahapan 8 menuju tahapan 4 sangat aktif pada kelainan pelipatan protein dan menyediakan target paling mungkin untuk menyusun strategi terapeutik berdasarkan susunan chaperone atau gen chaperone.4,8 Chaperone tidak bekerja sendiri tetapi bekerja sebagai bagian dari tim yang terdiri berbagai macam molekul, termasuk chaperone dan co-chaperone. Co-chaperone berinteraksi dengan chaperone, seperti HSP 70 dan HSP 90, dan membantu mereka dalam berbagai peran mereka; sebagai contoh, cochaperone untuk nucleotide-exchange factor B-cell lymphoma 2associated athanogene 1 (BAG-1) memfasilitasi siklus ATP-ADP yang dijalani oleh HSP70 dalam prosesnya membantu pelipatan protein. Kompleks chaperone dan co-chaperone membantu rantai polipeptida yang sudah tua disepanjang jalur pelipatan, melipat ulang molekul yang rusak, atau mengarahkan mereka menuju protease untuk degradasi bila mereka tidak bisa lagi diperbaiki. Domain fungsional yg khusus pada molekul chaperone mengenali polipeptida yang membutuhkan bantuan, berinteraksi dengan tim untuk membentuk kompleks chaperone, dan jaringan dengan kompleks chaperone lainnya atau dengan proteasome membentuk sistem ubiquitin-proteasome. Beberapa chaperone mengikat ATP dan memiliki aktivitas ATPase.4,12 Tim chaperone utama bagi sel terdiri atas Hsp 70, Hsp 40 dan nucleotide-exchange factor) / chaperonin yang mengandung komplek tailless complex polypeptide 1(TCP-1) dengan 8 sub unit, prefoldin chaperone dengan 5 subunit; small Hsp chaperone yang membentuk multimer dalam berbagai ukuran ; dan Cpn 60 - Cpn10 kompleks molecular chaperone, dimana Cpn merepresentasikan chaperonin (juga dikenal sebagai Hsp60-Hsp10). Kompleks Cpn 60 Cpn 10 berlokasi dalam mitokondria, sementara yang lainnya berlokasi di sitosol, nukleus atau kompartemen selular lainnya.4 6

Ini merupakan penjelasan dari gambar 3; Mesin chaperone adalah sebuah tim yang terdiri dari tiga protein, protein heat shock (Hsp70), Hsp 40 dan faktor pengubah nukleotida. Hsp 70 mengikat polipeptida dan bekerjasama dengan anggota tim lainnya , membantu polipetida membentuk ikatan yang tepat dengan demikian dapat mecapai bentuk aslinya. Prefolding terdiri dai 5 sub unit yang berbeda yang tersusun seperti medusa.Chaperonin mitokondrial terdiri dari dua susuna multimetrik. Susunan yang lebih besar memiliki 14 subunit Hsp60; yang lebih kecil memiliki 7 subunit Hsp10. Chaperon yang mengandung komplek TCP-1 mirip dengan struktur secara keseluruhan pada chaperon mitokondria ,tetapi 8 subunit yang berbeda (A sampai H) .Hsp kecil disebut sebagai Small HSP, sebagai contoh Kristallin yang normal nya merupakan monomer. Pada respons terhadap stress selluler mereka membentuk multimer yang berpartisipasi dalam melindungi polipeptida.4

Gambar.3 Tim Chaperone 4

II.2 Penggolongan Heat Shock Protein

Hsp diklasifikasikan kedalam grup berdasarkan phylogeny dan struktur, atau massa molekular dalam kilodalton misalnya, family Hsp 60 , berat molekul nya 60 kDa (klasifikasi yang berguna untuk analisa laboratorium klinis).1,6

Tabel dibawah ini menunjukan penggolongan Hsp :

Famili Hsp 90

Anggota Chaperone Hsp 90 Grp 94

Lokasi Sitoplasma, Retikulum Endoplasmik (RE) Sitoplasma Sitoplasma RE Mitokondria

Fungsi Menstabilkan bentuk tidak aktif reseptor hormon tertentu; berinteraksi dengan protein kinase tertentu untuk membantu melewati membran plasma; mencegah agregasi denaturasi ptotein Stabilisasi protein sebelum pelipatan /membuka struktur untuk translokasi / lipatan; perakitan immunoglobins; Target protein ke lisosom untuk didegradasi, protein sekresi; antigen presentasi; thermotolerance; interaksi dengan imunosupresan tertentu Stabilisasi struktur protein untuk pelipatan/perakitan, mengeluarkan kembali precursor ke ruang membran Aktivitas chaperone; pendamping bersama Hsp 70 untuk meningkatkan ATPase dan mengeluarkan substrat Mencegah agregasi polypetida, thermotolerance melalui stabilisasi dari mikrofilamen; mungkin berperan dalam pertumbuhan sel

Hsp 70

Hsc 70 Hsp 70 Bip Grp 70 Grp 75

HSP 60

HSP 60

Mitokondria

HSP 40

HSP 40

Mitokondria/ sitoplasma/nuk leus Sitoplasma Sitoplasma

Small HSP HSP 27 A dan B crystallin

Tabel.2 Penggolongan Hsp9

II.3 Struktur dan Fungsi Heat Shock Protein II.3.1 Heat shock protein 90 Secara keseluruhan struktur dari Hsp 90 meyerupai dengan struktur protein lain, yang berisi N-terminal domain (25kDa), Middle domain (40kDa) dan C-terminal domain (12kDa) (gambar 4) ATP terikat pada struktur N-domain, dimana Hsp 90 membutuhkan ATP dalam menjalankan fungsinhya.5

Gambar 4. Struktur Hsp 905

Hsp 90 ditemukan dalam sitosol eukariot dan retikulum endoplasma mamalia. Hsp 90 pada vetebrata berhubungan dengan berbagai protein selular yang mentransformasi retrovirus, tirosin kinase, reseptor hormone steroid, telomerase, gen penekan tumor P53, aktin dan tubulin.2,3,5 Hsp 90 juga berperan dalam aktivasi / inaktivasi reseptor hormon steroid yang

apabila reseptor hormon tersebut berikatan dengan hormon steroid yang sesuai makan ikatan dengan Hsp 90 akan terlepas, Hsp 90 juga berfungsi membantu memecah ATP menjadi ADP dan Pi sehingga menimbulkan tenaga.13 Dengan demikian, melalui pemanfaatan sejumlah cochaperones (Hsp40 / Hsp70) dan ATP, fungsi pendamping HSP90 sangat penting terutama menjaga sel agar bebas dari tekanan sehingga dapat mengatur regulasi protein yang sangat penting dalam pertumbuhan dan perkembangan.2,5

II.3.2 Heat shock protein 70 Hsp 70 banyak ditemukan di dalam sitosel eukariot, nucleus, mitokondria dan reticulum endoplasma. Induksi terhadap Hsp 70 sebagian besar terjadi karena berlebihan nya jumlah rantai polipeptida yang belum terlipat. Perlu dingat bahwa banyak anggota dari kelas ini, seperti juga dari kelas Hsp lain, dalam keadaan normal juga ada didalam sel. Kelas Hsp 70 mempunyai tingkat konversi yang tinggi dalam evolusinya. Semua anggota dari kelas Hsp 70 mempuyai dua domain yang berbeda, yaitu domain ATPase yang terletak dekat ujung N-Terminal dan bagian CTerminal yang terdapat domain yang mengikat peptida.5 9

Gambar 5. Struktur Hsp 709 Semua family Hsp 70 mengikat ATP.16 Hsp 70 dan Hsp 75 terikat pada protein saat protein memasuki matrik dari sitosol. Hsp 70 yang terdapat disitosol terdiri dari Hsp 73 yang konstitutif dan Hsp 72 yang inducible, yang erat kaitan nya dengan sintesis, pelipatan, sekresi protein. Hsp 72 dan 73 mempunyai struktur dan komponen yang sama. Pada sel yang normal Hsp 72 dan 73 dapat saling mensubtitusi satu sama lain.17 Selain itu juga Hsp 70 mempuyai co chaperon berupa Bip (GRP78) yang berada dilumen reticulum endoplasmic dan GRP 75 yang berada di mitokondria. Hsp 72 mempuyai tingkat induksi sangat tinggi dan sering dijadikan petanda adanya respon terhadap stress kardiak.5

Tabel 3. Famili Hsp 70 pada eukariotik.17

Fungsi lain dari Hsp 70 dan family nya adalah mengikat dan menstabilkan polypeptide yang baru muncul dari ribosom dan mentranslokasikan protein melewati membran ke retikulum endoplasma atau mitokondria, dan pada setiap interaksi nya Hsp 70 selalu dimediasi oleh ATP dan selalu memerlukan satu atau lebih molekul co-chaperon. Kenaikan kadar Hsp 70 telah dikaitkan dengan penghambatan terhadap apoptosis. Dan studi terus menunjukkan bahwa perubahan dalam tingkat yang berbeda Hsp 70 dapat bermanfaat klinis untuk diagnosis banyak penyakit manusia.5

10

II.3.3 Heat shock protein 60 Dalam kondisi fisiologis atau normal, Hsp60 dalam bentuk oligomer dengan 60

kilodalton yang terdiri dari monomer yang membentuk kompleks diatur sebagai dua cincin heptameric. Setiap subunit Hsp 60 memiliki tiga domain; apikal domain, equatorial domain dan intermediated domain. Equatorial domain berisi tempat pengikatan ATP dan cincin heptametrik lain nya serta intermediated domain mengikat equatorial domain dan apical domain secara bersama-sama.5 Hsp 60 adalah protein yang banyak ditemukan pada matrik mitokondria dan mempuyai fungsi penting dalam memfasilitasi pelipatan kembali protein yang datang dari sitoplasma. Hsp 60 pada bacteria disebut juga GroEL. Hsp 60 mempuyai molekul co-chaperon yaitu Hsp 10 (sebagai chaperonin) yang ikut berperan dalam pelipatan dan perakitan sintesi protein baru yang masuk dari sitoplasma ke mitokondria.5

Gambar 6.Fungsi Hsp 60.5

II.3.4 Heat shock protein 40 Hsp 40 merupakan ko factor atau subfamily dari Hsp 70 yang bekerja selalu bersama

sama dalam mengatur sintesa protein terutama pada pelipatan, transportasi dan degradari protein. Pada prokariotik Hsp 40 disebut DnaJ, tetapi pada manusia disebut Hsp 40 sesuai dengan berat molekulnya. Hsp 40 mempuyai tiga type I,II dan III yang masing masing mengandung 70 asam amino dengan terdapat bagian J-domain yang berhubungan dengan ATP ase dari Hsp 70 11

dan berfungsi dalam stimulasi aktivasi ATPase. Oleh karena kinerja Hsp 40 selalu memdampingi Hsp 70, maka sebagian besar fungsi Hsp 40 meyerupai Hsp 70 dalam hal pelipatan, transportasi dan degradasi serta aktivitas ATPase dalam sintesis protein.18,19,20

II.3.5 Small Heat shock protein Small heat shock protein memiliki gambaran structural yang sama, karakteristik nya adalam memiliki urutan asam amino 80-100 residu yang berperanan pada proses stabilisasi.5 Small heat shock protein (sHsps) merupakan heat shock protein dengan berat molekul yang kecil (11-42 kilodalton) dimana banyak terdapat pada prokariotik dan eukariotik. Pada manusia terdapat kurang lebih 10 sHsps antara lain; Hsp27 (HspB1), MKBP (myotonic dystrophy protein kinase-binding protein), HspB3, A-crystallin, B-crystallin, Hsp20, cvHsp (cardiovascular heat shock protein), Hsp22, HspB9, dan yang baru-baru ini dilaporkan adalah ODF1 (outer dense fiber protein). Fungsi utama sHsps adalah sebagai molekul pendamping yang mencegah aggregasi dan kesalahan pelipatan protein target, dan menjaga protein dalam komponene lipatan yang benar, selain itu juga sHsps molekul pendamping yang tidak tergantung pada ATP.21 Gambar dibawah ini merupakan struktur Hsp 27 dimana daerah yang diarsir gelap menandai sehingga disebut WDPF domain, daerah yang diarsir cahaya menandai wilayah konservatif di bagian terminal N dari sHsp dan daerah hitam menunjukkan konservasi konservatif crystallin domain. P daerah fosforilasi; gambar zigzag merupakan daerah C terminal.5

Gambar 7. Struktural Hsp 27 Pada family sHsps , Hsp27 (HspB1) banyak berperan pada manusia terutama dalam mencegah aggregasi dan memperbaiki pelipatan protein serta mengirim subtrat protein untuk dilipat kembali melalui mesin pendamping yang menggunakan ATP (Hsp60 ,Hsp70, Hsp90). Adapun family lain dari sHsps adalah -crystallin (subunit A dan B) yang konsentrasi nya tinggi di dalam lensa mata dan berfungsi mencegah aggregasi protein oleh karena paparan cahaya yang merusak.5,21

12

Gambar 8.Small Hsp.21

Pada beberapa penelitian lain menyebutkan fungsi dari sHsps selain sebagai molekul chaperon adalah sebagai stimulasi mitogenik, penuaan (aging), kematian sel, dan proteksi terhadap bebrapa jenis stress terhadap protein.21

II.4 Heat Shock Protein dalam berbagai keadaan

II.4.1 Heat shock protein dan Inflamasi Sel yang mengalami stress lingkungan akan menimbulkan respon stress yang berupa heat shock respon (HSR). HSR merupakan mekanisme respon perlindungan terhadap sel dengan melibatkan sementara ekpresi gen dan heat shock protein (Hsp) yang berguna membantu suatu organisme dalam menghadapi tekanan lingkungan dan keadaan fisiologis. Dalam keadaan tidak stress Hsp berfungsi sebagai molekul pendamping, menjaga protein dan memfasilitasi transport protein. Dalam kondisi stress Hsp menjaga aggregasi protein, melipat kembali protein yang rusak dan mendegradasikan protein yang sudah tidak bisa diperbaiki. Dalam hal ini komponen HSR termasuk Hsp 70 dan Hsf-1 dapat bertindak sebagai molekul pro dan anti inflamasi. Sebagai anti inflamasi HSR memodulasi sinyal transduksi cytokine dan ekpresi gen melalui penghambatan terhadap nuclear factor-kappa B (NF-B) sehingga mencegah pelepasan mediator inflamasi. Sebagai mediator pro inflamasi Hsp dapat melepaskan zat nekrotik dan non nekrotik kedalam 13

lingkungan ektrasellular yang akan memproduksi berbagai respon immune dan inflamasi termasuk mengaktivasi beberapa efektor sistim imun dan pelepasan cytokine.22,23,24 Hsp sebagai anti inflamasi, Kluger et al. 1997, penelitian terhadap hewan didapatkan peningkatan kelangsungan hidup yang dihubungkan dengan peningkatan kadar Hsp70 intrasellular dengan penurunan kadar proinflamasi cytokin seperti tumor necrosis factor alpha (TNF-) tetapi tidak pada interleukin 6 (IL6). Banyak penelitian penelitian pada binatang menyebutkan dengan adanya peningkatan Hsp 70 akan menurunkan ekpresi dari proinflamasi cytokine. Hati adalah jaringan yang sering digunakan untuk mengukur HSR terutama Hsp 70 dikarenakan menurut penelitian Flanagan et al. 1995. jaringan hati merupakan jaringan yang menandung akumulasi terbesar Hsp70. Dokladny et al. 2009, dengan menggandakan pemberian Hsp 70 pada hati hewan coba didapatkan penurunan kadar TNF- dan IL6 setelah pemberian endotoksin. Dari data ini menunjukkan bahwa ekspresi Hsp70 yang cukup dapat mengubah produksi pro inflammatory cytokine, meningkatkan toleransi endotoxin dan meningkatkan

kelangsungan hidup pada organisme dan lebih lanjut menyarankan bahwa organ tertentu seperti hati mungkin mempuyai efek penting dari HSR.22

Gambar 9.Hubungan antara Hsp dan jalur signal transduksi cytokine.22

Hsp sebagai pro inflamasi. Pada kondisi intrasellular Hsp dapat sebagai anti inflamasi dimana dapat menurunkan pro inflamasi cytokine melalui sel efektor immune, meningkatkan 14

toleransi cytokine terhadap sel dan jaringan, dan melemahkan perubahan permeabilitas epitel sebagai barier. Pelepasan Hsp pada lingkungan ektrasellular akan membangkitkan respon immune juga, dimana menurut Matzinger, 2002 merupakan sinya bahaya terhadap sistem immune, oleh karena Hsp ektrasellular merupakan ko stimulasi pengenalan imun. Pelepasa Hsp ke lingkungan ektrasellular merupakan penelitian yang menarik, karena disana ada bukti bahwa sekresinya dapat dirangsang secara aktiv dan pasif. Dalam hal ini berbagai macam sel seperti monosit (Lancaster dan Febraio,2005), tumor (Broquet et al. 2003), glia (Guzhova et al. 2001), sel B dan sel T (Hunter-Lavin et al. 2004) akan secara aktiv melepaskan Hsp 70 ke lingkungan ektrasellular. Akan tetapi Hsp 70 ektrasellular juga dapat dideteksi pada keadaan patologis dan non patologis yang berhubungan dengan kondisi sistem kekebalan tubuh untuk merubah fungsi selular.22 Hsp juga berperan dalam sejumlah proses selular lainnya yang terjadi selama dan setelah paparan terhadap stres oksidatif, yang mempuyai gambaran karakteristik kondisi patologik tertentu dimana yang termaksud didalamnya yaitu kondisi iskemia, penyakit jantung dan neurodegeneratif.23 Dalam kondisi ini, stres oksidatif terjadi sebagai akibat dari

ketidakseimbangan antara produksi spesies oksigen reaktif (ROS) dan kemampuan tubuh untuk mendetoksifikasi zat reaktif tersebut. Ketidakseimbangan ini dapat menghasilkan produksi ROS yang berlebihan seperti dapat dilihat pada kondisi iskemia atau keadaan dimana enzim antioksidan yang menurun, sebagai hasil nya terjadi penurunan kondisi intrasellular yang mengarah ke aggregasi protein dan DNA dan pada akhir nya terjadi kegagalan fungsi dari normal sel.23 Penumpukan protein yang teroksidasi ini akan mengaktifkan jalur inflamasi dan adanya perubahan reaksi redox selular juga mengaktifkan kaskade apoptosis. Karena fungsinya yang bermacam macam Hsp ikut berperan dalam berbagai tingkatan pada situasi ini. Pertama-tama, beberapa Hsp, terutama anggota keluarga Hsp70 dan co-chaperones nya , memainkan peran penting dalam memilah protein dan mengkontrol kualitas protein dengan memilih dan mengarahkan protein ke proteasome atau komponen yang rusak untuk di degradasi, dengan demikian protein yang rusak dapat dimusnahkan dengan bantuan Hsp dan protein yang bisa diperbaiki dilipat kembali untuk diselamatkan. Di sisi lain, beberapa Hsps, seperti Hsp27, Hsp70 dan Hsp90, dapat mengikat dan menghambat kaskade apoptotic, sedangkan beberapa Hsp (Hsp70) memiliki fungsi anti-inflamasi.22,23,25 Dengan demikian, peningkatan sintesis Hsp tidak

15

hanya dapat memperbaiki protein salah melipat oleh karena stress lingkungan tetapi dapat secara aktif mencegah kerusakan protein oleh karena stres oksidatif.22

Gambar 10. Peran Hsp dalam stress oksidatif dan jalur apoptosis.22

II.4.2 Heat shock protein dan kanker Hanahan and Weinberg, 2000 mengatakan hampir sebagian besar tumor berkembang secara bertahap dimana terjadi perubahan dari sel normal ke sel tumor melalui perubahan fisiologi sel dalam hal signal pertumbuhan, kurang sensitifnya penghambatan terhadap pertumbuhan sel, program kematian sel yang terganggu, replikasi sel yang tak terkendali, pembentukan angiogenesis, invasi ke jaringan dan adanya metastasis. Heat shock respons berperan dalam perkembangan tumor melalui peningkatan jumlah atau dapat juga melalui penurunan Hsp yang spesifik.26 Atau dengan kata lain Hsp dapat berperan sebagai pro apoptosis dan dapat sebagai anti apoptosis (gambar 8).22,28 Burdon.1986, Ciocca et al.1991, Ciocca et

al.1992, Lim et al 2005, bahwa diantara beberapa penyebab tumor seperti virus yang bersifat oncogenik (adenovirus, human papiloma virus, hepatitis B virus, hepatitis C virus) dapat meningkatkan ekspresi dari Hsp.27

16

Tabel dibawah ini menunjukan hubungan agen onkogenik dengan Hsp.27 Agen Etiologi Virus, H phylori Normal Sel Memodulasi respon Hsp Perubahan dalam sel Perubahan dalam sitokleton, adhesi dan differensiasi sel, dan ekpresi iNOS, fasilitasi dan transportasi pro virus, aktivasi signal inflamasi, memperbaiki kelangsungan sel.

Perubahan dalam Oncoprotin

Memodulasi HSF-1/Hsp Pengikatan Hsp

Stabilisasi protein yang rusak atau yg bermutasi, memodul asi system imun, memperta hankan kelangsungan sel Perubahan regulasi kolagen perbaikan pemb darah dan metastase

Hypermethylasi

Hsp 40

Radiasi, Agen karsinogenik

Aktivasi Hsp, Kerusakan DNA

Perbaikan repair DNA, protek protein yang mutasi/rusak, per baikan signal proliferasi sel, imun modulasi, survive sel

Tabel 4. Hubungan agen karsinogenik dan Hsp.27 Pada keadaan kanker Hsp dapat ditemukan pada beberapa tingkat sel basal yang dapat di induksi dan sebagai mekanisme pertahanan terhadap stress. Ekpresi dari Hsp dapat bermanfaat terhadap kelangsungan dari sel dan dapat dikembangkan dalam hal mencegah resistensi beberapa obat anti tumor. Di antara molekul chaperones, Hsp90 penting untuk menstabilkan banyak reseptor, protein kinase dan faktor-faktor transkripsi, lebih dari 200 anggota protein terdapat dalam Hsp 90 ini yang berperan secara esensial dalam transduksi signal yang berhubungan dalam pertumbuhan dan perkembangan dari sel.5,26 Hsp 90 juga memegang peranan penting dalam rugulasi anti apaoptosis yang dapat menjaga kelangsungan hidup dari sel tumor, akan tertapi baru-baru ini didapatkan penghambatan terhadap Hsp 90 {geldanamycin,17-allylamino17-demethoxy-geldanamycin (17AAG)} sebagai target therapy terhadap tumor, penghambatan /

17

inhibisi terahadap ekpresi yang berlebihan Hsp 90 dapat meng induksi apoptosis pada beberapa maacam tumor. Akan tetapi ini masih dalam penelitian klinik phase I dan II.26 Hsp 70 dan Hsp 27 juga mempuyai peran yang krusial pada perkembangan tumor pada manusia, dimana inaktivasi dan penurunan ekpresinya pada keadaaan kanker akan dapat menstabilkan program kematian dari sel. Oleh karena fungsi nya yang besar daalam proses anti apoptosis, Hsp 27, Hsp 70 dan Hsp 90 (gambar 8) maka peran nya sangat besar dalam perkembangan sel tumor, maka penghambatan terhadap Hsp ini akan meningkatkan proses apoptosis yang akan mencegah karsinogenesis dan juga akan meningkatkan sensitivitas obat anti kanker.26,28 Beberapa Hsp inhibitor sedang dalam penelitian klinik yang nanti nya diharapkan akan menjadi terget pengobatan anti tumor.26

II.4.3 Heat shock protein dan kardiovascular Dalam kaitan dengan arteriosklerosis, keluarga dari Hsp 60 dan Hsp 70 telah banyak di teleliti. Kol et a., 1998, meneliti Hsp 60 muncul secara selektif pada lesi arterioklerotik sebagai perlawanan dari dinding pembuluh darah. Bobryshev & Lord. 2002, lesi atrerioklerotik yang lanjut terjadi ekpresi yang berlebihan Hsp 70 pada beberapa sel termasuk monosit, magrofag dan sel dendritik serta pada smooth muscle sel, tetapi pada lesi arteriosklerotik yang awal, hanya sel dendritik yang didapatkan ekpresi dari Hsp 70. Selain itu imunitas humoral, imunitas selular berperanan dalam proses arterogenesis. Ayada et al.2007, adanya Hsp 60 spesifik sel T lymphosit dalam sirkulasi akan meningkatkan risiko arteriosklerosis. Knoflach et al. 2007, pada respon spesifik selular Hsp 60 berkorelasi dengan ketebalan dari tunika intima pada pasien usia muda pada tahap awal stadium atrerioklerosis. Xu et al. 2000, dalam populasi yang besar meneliti hubungan Hsp 60 dengan kolesterol HDL. Pockley et al. 2002, kadar anti Hsp 70 antibodi meningkat pada pasien hipertensi dibandingkan dengan pasien normotensi. Hsp juga digunakan sebagai factor prognostik yang signifikan dalam memprediksi kesakitan dan kematian karena arterioklerosis. Hoppichler et al. 2000, kohort 79 laki-laki dengan riwayat penyakit arteri koroner didapatkan anti Hsp 65 meningkat secara signifikan dibandingkan denga mereka yang tidak memiliki kejadian kardiovaskular.32,35 Percobaan in vitro dan in vivo telah menunjukkan bahwa faktor risiko klasik aterosklerosis dapat bertindak sebagai stressor endotel yang memicu ekspresi simultan dari molekul adhesi dan Hsp 60 dalam mitokondria, di sitoplasma, dan pada permukaan sel, di mana ia bertindak sebagai "sinyal bahaya" untuk reaksi imun seluler dan 18

humoral.33 Dari pengamatan yang ada kadar Hsp 70 yang tinggi pada sirkulasi dapat sebagai proktesi penyakit kardiovaskular dengan mekanisme Hsp 70 sebagai anti inflamasi yang secara langsung berefek manjaga fungssional endothelial dari sel.38 Ekpresi Hsp 90 juga dapat dihubungkan dengan gambaran plak yang tidak stabil lesi lanjut pada manusia, adanya penghambatan Hsp 90 akan menurunkan respons inflamasi pada arteriosklerosis. Hal ini diduga melalui mekanisme penghambatan tempat pengikatan ATP, oleh penghambat Hsp 90 (ansamycins) yang akan meningkatkan ekpresi Hsp 70.34 Hsp 90 terlihat berperan sebagai salah satu faktor dalam kaskade sinyal untuk aktivitas eNOS (endothelial nitric oxide), sejauh ini dengan meningkatnya aktivitas eNOS maka produksi NO (nitric Oxide akan meningkat yang akan menginhibisi produksi superoxide.46 Gambar dibawah ini (gambar 9), merupakan skema peranan potensial Hsp 60 dalam proses arterogenesis. Berbagai pemicu stres, seperti infeksi, biomekanik stres, oxLDL, radikal bebas, racun, sengatan panas, dan stres lainnya, menginduksi produksi Hsp 60 di dinding arteri, yang dilepaskan ke dalam darah untuk membentuk HSPs larut (soluble HSPs). sHSPs mengikat TLR4/CD14 kompleks sehingga terjadi respon proinflamasi dan autoimun reaksi (sebagai autoantigen), yang berkontribusi terhadap aterosklerosis.38

Gambar 11. Skema hubungan Hsp dengan Arteriosklerosis.36

19

II.4.4 Heat shock protein dan ginjal Adanya stress akan mengggangu fungsi normal dari ginjal, keadaan seperti perubahan PH, perubahan komposisi ion atau osmolaritas, serta hipoksia lanjut. Pada banyak kasus, perubahan fisiologi yang di induksi oleh ekpresi Hsp membuat ginjal sebagai organ yang dapat merespon stress berikutnya. Basile et al.2004, penelitian pada binatang tikus dimana peningkatan terhadap ekpresi Hsp 70 pada ginjal akan membuat ginjal lebih tahan terhadap iskemia. Tetapi beberapa studi menunjukan hasil yang tidak konsisten terhadap hal ini. Respon stres yang besar terhadap sel ginjal akan menyebabkan sel itu mati, dan akan meyebabkan disfungsi organ tersebut. Dalam hal ini ada dua Hsp yang berpengaruh sebagai cytoprotektif protein pada ginjal yaitu Hsp 27 dan Hsp 70.39 Telah disebutkan diatas hubungan Hsp dengan ROS. Pada ginjal, adanya ROS didapat dari bebrapa sumber, termasuk diantaranya oksidasi NAD(P)H, gangguan mitokondria, advance glykosilasi, peroksidase, xanthine oksidase, dan sintesis nitrit okside. Dimana produk stress oksidatif ini akan meningkatkan radikal bebas seperti super okside (O2-) dan hidroksi radikal ( OH), dan non radical species seperti hydrogen perokside (H2O2) serta asam hydrochloride (HOCL). Sel yang normal dapat mempertahan kan diri dari kerusakan yang ditumbulkan ROS melalui proteksi enzime. Dan banyak bukti menunjukan bahwa oksidatif stress ini memainkan perana penting dalam progresifitas gagal ginjal kronik dan fibrosis ginjal. Munucha W.2005, pada model tikus denga uropati obstruktif yang diberi losartan sebagai anti hipertensi dapat menurunkan oksidatif stress dan fibrosis selain menurunkan tekanan darah, dan hal yang penting efek perlindungan ini dihubungkan dengan penigkatan dari ekpresi Hsp 70. Mao bet al.2008, meneliti ekspresi Hsp 70 pada kultur sel ginjal menurunkan TNF yang di induksi transformasi mesenchimal epithelial dan menurunkan fibrosis pada obstruksi uretral kronik ginjal tikus. Goering et al.1992; Kim et al.2000; Nath et al.1996, paparan akut logam berat akan meningkatkan de novo sintesis Hsp 70 dan Hsp 90 baik in vitro maupun in vivo, hal ini menunjukan bahwa Hsp dapat melindungi atas peningkatan beban yang menyebabkan denaturasi dari protein sebagai akibat dari oksidatif stress itu sendiri.39 Ada beberapa bukti penelitian pada hewan, bahwa ekpresi Hsp 72 akan melindung sel terhadap racun uremik sebagai respon terhadap stress guna melindungi sel dari apoptosis dan dapat sebagai adaptasi terhadap keadaan berbahaya dari sel. Penelitian Hubungan Hsp dengan gagal ginjal pada manusia masih terbatas pada dua penelitian saja, yang pertama Marzek L et 20

al.2009, yang menggambarkan penurunan ekpresi Hsp 72 pada monosit darah tepi pasien dewasa yang di hubungkan dengan kelelahan sel sebagai mekanisme adaptif, sesuai dengan apoptosis yang berlebihan dan gangguan imunitas pada gagal ginjal kronik, penelitian ini dilakukan pada pasien yang menjalanin hemodialisa, serta didapatkan hasil lain penurunan mRNA pasien dibandingngkan dengan control. Penelitian yang lain, Musial K. 2010, penurunan anti Hsp 70 pada anak dengan gagal ginjal kronik, hal ini menggambarkan respon adaptif terhadap komplikasi kardiovaskular yang dapat dilihat dari peningkatan risiko arteriosklerosis pada padien gagal ginjal kronik.40,44 Hubugnan dialysis dengan hsp digambarkan pada penelitian Raj

DS.2007, dimana sesi single dialysis dengan membrane polysulfonate akan meningkkan ekpresi Hsp 70, Musial k.2009, meningkatkan Hsp 60 dengan penurunan anti Hsp 60 dan anti Hsp 70 setelah hemodialisis. Hsp dihubungkan dengan ketebalan tunika intima carotis pada pasien dengan hemodialisa dimana didapatkan hubungan korelasi yang terbalik antara Hsp 27 dengan ketebalan tunuika intima carotis hanya pada pasien yang memiliki hipertensi sebagai factor risiko.43 Pengetahuan tentang hubungan Hsp dengan penyakit ginjal khusus nya gagal ginjal kronik perlu ditingkatkan, bentuk Hsp intrasellular seperti hsp 70 dengan familinya dapat menurunkan progresifitas gagal ginjal kronik melalui aktivitas anti apoptosis dan cytoprotektif. Adapun peran ektraselular hsp masih menunjukan variabilitas.40,42

II.4.5 Heat shock protein dan Penuaan Penuaan sering disebutkan sebagai konsekuensi dari terganggunya fungsi proses perbaikan seperti; sistem imun, perbaikan DNA, eliminasi radikal bebas dll. Pendamping molekul oleh Hsp berguna untuk pelipatan kembali dari protein yang rusak, hal ini mungkin merupakan salah satu bagian proses perbaikan yang sangat penting. Bersesuaian dengan

hipotesisi ini, organisme yang mengalami penuaan, mengandung sejumlah besar protein yang salah terlipat, dan induksi dari Hsp70 terganggu baik pada manusia ataupun tikus yang sudah menua.1 Penelitian serupa dilakukan pada kultur dari fibroblast paru manusia dan epidermal melanocyt yang mengalami kematian dini dan lanjut, fibroblast kulit yang diambil dari dari donor lebih muda (usia 27-44 tahun) dan donor lebih tua (usia 78-92 tahun), didapatkan kadar protein Hsp 70 pada fibroblast paru rendah pada usia kematian lanjut dibandingkan dengan sel pada usia kematian dini. Penelitian lain, kadar basal dari Hsp 70 lebih rendah pada kultur 21

fibroblas dari donor yang lebih tua dibandingkan dengan kultur serupa yang diambil dari donor lebih muda. Serupa dengan itu, peningkatan Hsp 70 sesudah adanya stres lebih rendah pada fibroblas dari donor lebih tua dibandingkan dengan yang didapat dari donor lebih muda. Heat shock factor-1(HSF-1) ditemukan pada fibroblast dari donor muda dan tua, tetapi kadar pada donor yang lebih tua lebih rendah dibanding donor yang lebih muda. Kadar dari faktor transkripsi HSF-1, suatu regulator ekspresi gen chaperone, menurun seiring jumlah kematian sel yang meningkat untuk kedua populasi fibroblast, menunjukkan bahwa jumlah dari faktor transkripsi menurun seiring dengan meningkatnya usia sel.4 Kadar Hsp 90 dan kapasitas pendampingan (chaperoning capacity) sitosol hepatosit pada tikus lebih tua terlihat lebih rendah dibandingkan dengan pada hepatosis tikus lebih muda. Temuan ini menarik karena telah digunakan untuk mengevaluasi kapasitas chaperone langsung pada sel hewan tua dan muda, dan menunjukkan bahwa kadar Hsp 70 dan Hsp 90 pada sel yang berasal dari tikus muda dan tua tidak berbeda. Oleh karenanya, laporan ini berlawanan dengan laporan lainnya yang menemukan penurunan pada kedua chaperone ini terjadi seiring usia.4 Penurunan pada kadar serum Hsp 70 ditemukan pada populasi orang Cina usia 30 sampai 50 tahun, dibandingkan pada orang berusia 25 sampai 30 tahun62. Kadar tertinggi ditemukan pada orang berusia 25 sampai 30 tahun. Sesuai dengan hal ini , penurunan kadar Hsp 70 ditemukan pada limfosit subjek yang berusia lebih tua (>40 tahun), disbanding terhadap kontrol yang lebih muda. Temuan ini mengindikasikan bahwa serum chaperone merupakan biomarker potensial untuk status kesehatan, terutama pada usia lanjut. Kita dapat menduga, mengingat banyaknya peran chaperone, bahwa seseorang dengan kadar serum chaperone yang rendah dapat memiliki penurunan fungsi vital yang lebih nyata seiring usia dibandingkan dengan seseorang dengan kadar chaperone yang lebih tinggi. Namun, masih belum jelas kenapa, atau dengan mekanisme apa ?.4

22