PRCTICA PRUEBAS DE INMUNOPRECIPITACIN

INTRODUCCIN Las pruebas de inmunoprecipitacin son procedimientos serolgicos que demuestran la existencia de anticuerpos capaces de provocar la precipitacin de sus correspondientes antgenos cuando ambos reactivos se encuentran en solucin. Pueden ser realizadas en medios lquidos como en medios semi-slidos (geles). En los primeros, la interaccin de antgeno y anticuerpo resulta a menudo perturbada por la formacin de corrientes y otros disturbios debido a cambios de temperatura y/o de pH. Los geles, por el contrario, forman mallas que estabilizan la solucin, facilitando el revelado de la reaccin antgeno-anticuerpo. Para que tenga lugar la inmunoprecipitacin, es necesario que interactuen en solucin anticuerpos que sean por lo menos bivalentes, con antgenos multivalentes; solo as, es posible que se configuren los agregados moleculares que, al entrelazarse, adquirirn la propiedad de precipitar. Los anticuerpos ms frecuentemente involucrados en el fenmeno de inmunoprecipitacin pertenecen a la clase IgG de las inmunoglobulinas, las IgM tambin pueden participar. La interaccin de antgeno y anticuerpo puede ser facilitada dejndolos difundir espontneamente en el seno de un gel (prueba de inmunodifusin) o acelerando su encuentro utilizando un campo elctrico (electroinmunodifusin). Tambin se pueden separar las fracciones moleculares de un muestra mediante electroforsis y luego realizar una inmunodifusin (inmunoelectroforsis). Las pruebas de inmunoprecipitacin se pueden utilizar para identificar y cuantificar inmunoglobulinas u otras protenas, identificacin de bacterias, etc. En el estudio de estructuras de enzimas, hormonas y otras sustancias. As mismo, los mtodos de inmunodifusin nos permiten identificar compuestos antignicos que pueden estar jugando un papel importante en la patogenicidad de una enfermedad. Para las pruebas de inmunoprecipitacin, es necesario contar con antgenos hidrosolubles. INMUNODIFUSIN EN GELES INMUNODIFUSIN DOBLE (PRUEBA DE OUCHTERLONY) La inmunodifusin doble se caracteriza porque el antgeno y el anticuerpo (colocados en pozos diferentes en un medio semislido) difunden espontneamente en

el gel; en el sitio donde se encuentran en zona de equivalencia forman una lnea de precipitacin visible. La interaccin de ambos reactantes es consecuencia de la agitacin trmica de las molculas e iones y la velocidad ser proporcional a la diferencia de concentraciones que existen entre el pozo y el gel circulante, la cual disminuir progresivamente a medida que el reactivo se vaya diluyendo al difundir en la agarosa. Otros factores como temperatura de reaccin, tamao molecular de los reactantes y las carcteristicas fsico-qumicas del gel influencian la difusin de ambos reactantes. En general, la tcnica de doble-inmunodifusin es sencilla y sensible (0,2 mg/ml) y usualmente nos permite observar los tres patrones bsicos de precipitacin: 1. REACCIN DE IDENTIDAD Cuando los antgenos son idnticos y el antisuero reacciona con ambos, se originan dos lneas de precipitacin que se unen formando un arco simple.

2. REACCIN DE SEMI-IDENTIDAD Cuando hay antgenos serolgicamente diferentes, pero que comparten determinantes antignicos y existen anticuerpos para cada uno de los determinantes antignicos, se producir un a reaccin cruzada y se observarn dos lneas de precipitacin que se interceptan con una pequea prolongacin hacia uno de los orificios de los antgenos. 3. REACCIN DE NO IDENTIDAD En este caso, los antgenos son diferenes entre s y el antisuero posee anticuerpos contra determinantes antignicos distintos, presentes en cada uno de ellos, se forman dos lneas de precipitacin independientes, que se cruzan entre s.

INMUNODIFUSION DOBLE
Reaccin de Identidad
XY XYZ

Semi-identidad

No identidad
XY X A g A g Y A

X YZ A g ZY

X Z A

X Z A

ANLISIS SEMICUANTITATIVO DEL ANTISUERO

X X 1/2

X 1/32

A
gX

X 1/4

X 1/16

X 1/8

Molde tpico para la comparacin semicualitativa de Ags o

: Anticuerpo (antisuero) Ag: Antgeno (diluciones seriadas)

PRUEBA DE COGGINS PARA EL DIAGNSTICO DE LA ANEMIA INFECCIOSA EQUINA Una de las principales aplicaciones de la prueba de inmunodifusin doble en medicina veterinaria es para el diagnstico de la Anemia Infecciosa Equina (AIE). Esta prueba fue descrita por Coggins y colaboradores, en Cornell Veterinaria en Abril de 1970. La prueba est basada en la migracin concurrente del antgeno y el anticuerpo a travs del agar-gel. El antgeno AIE es un extracto de bazo de caballos infectados con anemia infecciosa.

OBJETIVOS DE LA PRCTICA Realizar prueba de inmunodifusin doble: Familiarizarse con la preparacin de lminas y placas con agar para inmunodifusin Aplicar la inmunodifusin doble para el anlisis semicuantitativo (titulacin) de los sueros obtenidos durante la prctica N2 Aplicar pruebas de inmunodifusin para identificar reacciones de identidad y no identidad entre varias preparaciones de protenas. MATERIALES Placas de petri Lminas de vidrio Pipetas de 5 y 10 ml Fiolas de Erlenmeyer Pipetas pasteur Bao de Mara Solucin de agarosa al Sueros Micropipetas METODOLOGA Preparacin de placas con agar para Inmunodifusin: 1. El laboratorio dispondr de la solucin de agar preparada previamente (de acuerdo a las especificaciones de la tcnica) en un buffer adecuado, la misma se mantendr en bao de Mara a 56 C. 2. Depositar 15 ml de la solucin de agar caliente en cada cpsula de petri y 4 ml sobre las lminas de vidrio limpias y secas. Dejar solidificar a temperatura ambiente. 3. Labrar en el gel los pozos de acuerdo a un molde previamente seleccionado. Posteriormente se procede a retirar el agar de cada pozo mediante una aguja. Tenga mucho cuidado de no romper el agar alrededor del pozo. 4. Colocar el antgeno (suero de la especie animal contra la cual Ud. elabor el antisuero) en el orificio del centro y las diluciones del antisuero en los pozos de la periferia. 5. Anotar las caractersticas de los reactivos y sus posiciones respectivas en una hoja aparte. 6. Incubar las placas en cmara hmeda durante 24 horas a 37C 7. Efectuar la lectura de las lneas de precipitacin y anotar los resultados.

PREPARACIN DE LAS DILUCIONES DE LOS ANTISUEROS PARA TITULACIN 1. En placa de microtcnica y utilizando la micropipeta, colocar 100l del suero a titular en el primer pozo 2. Colocar 50 l de solucin salina o del buffer adecuado en los siguientes 5 pozos. 3. Transferir 50 l del suero del primer pozo al segundo, mezclar bien y tomar 50 l para transferirlos al tercer pozo y as sucesivamente hasta el ltimo pozo donde se descartan los 50 l restantes. De este modo las diluciones quedarn 1/1, 1/2, 1/4, 1/8, 1/16 y 1/32.

Nota: Realizar estas diluciones con cada uno de los sueros obtenidos por Ud. durante la prctica N 2.