ESTUDIO DE DIHBRIDOS (wdp x fb) EN Drosophila melanogaster CON LIGACION CROMOSOMICA AL SEXO (w-f) Y ENTRECRUZAMIENTO DE ALELOS (b-dp)

C. Sandra, R Andrea, R. Jennifer.

Laboratorio de Gentica, Universidad del Tolima, Barrio Santa Helena, Ibagu- Colombia.

Resumen Se realiz un experimento con lneas de mutantes de Drosophila melanogaster para comprobar los patrones hereditarios en un cruce black forked (bf) con white dumpy (wdp) , observando la expresin de caracteres dominantes, recesivos, ligados al sexo y los posibles entrecruzamientos. Se obtuvo de sucesivamente la Filial 1 y 2; fenotipos silvestres en hembras y Forked en machos se observaron para la primera generacin y 12 mutaciones diferentes para la segunda. Los resultados se analizaron mediante el uso de la prueba de Chi- cuadrado con el fin de verificar la asertividad en experimento. Finalmente se concluye que hay asociacin entre las variables estudiadas (ligamiento al sexo y probabilidad de recombinacin) pero sin embargo, los datos presentan un margen de error que se debe al azar, a problemas en el conteo realizado o con la identificacin de las mutaciones. Palabras clave: Drosophila melanogaster, mutaciones, dihbrido, ligado al sexo, entrecruzamiento, Chicuadrado. INTRODUCCION Uno de los organismos ms utilizados en experimentos de gentica, es la Drosophila melanogaster, o mosca de la fruta, que se caracteriza por ser de pequeo (de 2 a 3 mm), por tener un ciclo vital corto (10 11 das a 25C) y por tener un elevado nmero de descendientes por pareja aproximadamente poner 500 huevos. Drosophila es ideal como modelo biolgico experimental porque es fcil de reproducir y manejar la cual se puede mantener en viales de vidrio alimentndola con una papilla compuesta por fruta (banano), levadura, azcar y/o melaza, mezclada con agar-agar. Drosophila melanogaster tiene 4 parejas de cromosomas: Los cromosomas sexuales X y Y (I) y 3 parejas de autosomas (II, III, IV). Los cromosomas Y y IV son pequeos y telocntricos y la mayora de los genes se localizan en los cromosomas X, II y III que son metacntricos y grandes. El cromosoma Y es heterogametico y contiene algunos genes relacionados con la espermatognesis. La determinacin del sexo depende de la relacin entre el nmero de cromosomas X (nX) y el de complementos autosomicos que lleve el individuo (nA); si (nX / nA) = 1 el individuo ser hembra y si (nX / nA) = 0,5 el individuo ser macho. El fenotipo normal de la Drosophila melanogaster corresponde a cuerpo de color marrn claro, ojos grandes y rojos, y alas que sobrepasan la longitud del abdomen y son transparentes y ligeramente puntiagudas. Las nerviaciones de las alas estn compuestas por 5 venas longitudinales y dos transversales. En los machos, la parte distal dorsal del abdomen es oscura y en la parte ventral se encuentra el pene rodeado por las placas genitales (que le sirven para sujetarse a la hembra), son ms pequeos que las hembras y en el tarso del primer par de patas, poseen una estructura compuesta de unos pelos gruesos y cortos, llamada peine sexual que permite distinguir sexos

incluso en las pupas maduras, antes de que emerja el adulto. Las hembras tiene un abdomen ms grande, de coloracin clara y terminacin puntiaguda; en la parte ventral el ltimo segmento lleva la placa vaginal, de coloracin blanquecina. En Drosophila es posible encontrar diversas mutaciones como Black (b), White (w), Dumpy (dp), Forked (f), Yellow (y), Ebony (e)etc.

median el anclaje de los msculos de la cutcula. Esto explicara su utilidad como variacin morfolgica de los tejidos a travs de su regulacin de las propiedades mecnicas que podra poseer la mosca, como desplazamiento y dominio del vuelo. Black (b) corresponde a un mutante autosmico recesivo situado en la posicin 48.5 ubicado en el cromosoma dos. Se expresa con un color de cuerpo negro mate.

Los patrones Fig1. Drosophila

Fenotipo silvestre. Imagen tomada de Archivo Fig. 3. Mutacin black (b). Tomado de http://cienciasbiologicas.uniandes.edu.co/genetica/no do.php?id=57

El experimento llevado a cabo con Drosophila se fundamentaba en el estudio de las siguientes mutaciones: Dumpy (dp) es un mutante autosmico recesivo situado en la posicin 13 del cromosoma dos. Posee alas truncadas y reducidas a 2/3 de su longitud.

Este fenotipo se observa en expresin de los pigmentos que dan la coloracin del cuerpo. El gen produce la beta-alanina, debido a la descarboxilacin del aspartato origina entonces la melaninizacin, la mutacin ocurre por errores de marco de lectura, lo que genera el corrimiento de todos los codones, y cambia la secuencia de aminocidos que codifica una protena funcional. Estudios realizados revelan que hay cierto tipo defectos visuales en estos mutantes. El gen tambin se asocia a defectos en el proceso cuticular y no cuticular , el mutante negro en Drosophila responde anormalmente a estmulos visuales como el adecuado reconocimiento del objetivo y direccin, lo cual sugiere un problema con las funciones de orden superior visual. White (w).

Fig. 2. Mutacin dumpy (dp). Tomado de http://cienciasbiologicas.uniandes.edu.co/genetica/no do.php?id=57

Este gen corresponde a un fenotipo mutante que afecta el tamao y la forma de las extremidades, la cutcula torcica, la trquea y piezas bucales. De acuerdo con sus fenotipos de cutcula, Dumpy se expresa en varios sitios de adhesin celular cutculaepidrmica, incluyendo la trquea y las clulas del tendn del msculo, que

Fig. 4. Mutacin white (w). Tomado de archivo

White Se conoce como la primera mutacin encontrada en Drosophila melanogaster. Es una mutacin recesiva ligada al sexo en la posicin 1,5 del cromosoma X. Descubierta en 1910 por Thomas Hunt Morgan, quien en cierta ocasin recogi un solo macho mutante de ojos blancos de una poblacin de moscas que suelen tener los ojos rojos brillantes en estado silvestre. Morgan realizo cruces experimentales con dicha mutacin, los cuales, lo llevaron a la conclusin de que esta mutacin estaba de alguna manera conectada fsicamente al gen que determina el gnero en Drosophila. La protena producida por la mutacin del gen de tipo white sirve como un anclaje de unin de transporte de ATP, que lleva los precursores de los pigmentos del ojo color rojo y marrn, es decir guanina y triptfano, a los ojos durante el desarrollo de pupacin. Forked (f) que es un mutante recesivo ligado al sexo situado en la posicin 56.7 ubicado en el cromosoma X. Los individuos que la presentan poseen cerdas acortadas, retorcidas y dobladas con los extremos bifurcados o totalmente doblados.

Finalmente, como resultado del experimento es posible encontrar dimutantes como White- dumpy, mutante de ojos y ocelos color blanco y alas truncadas; White Black, que es un mutante de ojos y ocelos color blanco y cuerpo de color negro mate, Black forked mutante de cuerpo negro y setas retorcidas, dumpy forked con alas truncadas y setas retorcidas y trimutantes, como white-dumpyforked (wdpf), con ojos color blanco, setas retorcidas, alas truncadas y reducidas. Todas las anteriores mutaciones y posibles variaciones de las mismas son posibles en la cruza de individuos para Drosophila melanogaster. En general, en Drosophila melanogaster existen infinidad de mutaciones que son tiles en el ejercicio de cruces dihibridos o cualquier otra forma de cruza, lo anterior permite reiterar las leyes mendelianas que son imprescindibles en lo que el estudio de un gen se refiera. Mutaciones con diferentes patrones de herencia como White, black, forked y dumpy pueden estar ligadas al sexo, hacer recombinacin en la meiosis, o segregarse independientemente una de otra por lo las proporciones fenotpicas y genotpicas son variables y dependen de muchos factores.

Fig. 5. Mutacin forked (f). Cromosoma 1 y 2 en Drosophila. Fenotipos trabajados. Tomado de archivo.

Los patrones hereditarios fueron descubiertos y planteados por Gregory Mendel, quien realiz cruzamientos entre variedades o lneas puras que diferan en tres caracteres (AABBCC x aabbcc). A estos organismos se les conoce como polihbridos. Un polihbrido (ABC) es un individuo heterocigoto para n loci, es decir, un individuo cuyo genotipo contiene dos alelos distintos en cada locus. Si los loci en estudio son biallicos (por ejemplo: A,a ; B, b ; ... N,n) el genotipo polihbrido es AaBb...Nn. Los polihbridos producen tantos tipos de gametos distintos como combinaciones diferentes de n alelos hayan, es decir, se pueden formar 2n. Como los alelos se reparten al azar entre los gametos (ley de la segregacin independiente) para cada locus X,x la mitad de los gametos sern de "tipo X" y la otra mitad de "tipo x". Por otra parte, como los alelos se combinan independientemente, los alelos A y a se combinan con los alelos B y b con la misma probabilidad, y as lo harn al combinarse los alelos C y c. Es decir, los 2n tipos de alelos se formarn con la misma frecuencia (1/2n). Las proporciones fenotpicas se ven afectadas por el entrecruzamiento cromosmico (crossing over) donde dos cromosomas se aparean e intercambian secciones de su ADN. El resultado de este proceso es un intercambio de genes, llamado recombinacin gentica.

pequeo, espuma, cartulina plastificada, un frasco eterizador, tapa eterizadora, gotero). Fue necesario adems el uso de cloroformo para adormecer las moscas, medios de cultivo para alimentar cepas de Drosophila que en este caso se utilizo medio con banano, y por ltimo el material biolgico; cepas Black forked (bf) y White dumpy (wdp) Se realizo una separacin de hembras vrgenes correspondientes a Black forked (bf); mediante la revisin cada seis horas de los organismos, con el kit se adormecen todas las moscas y a travs de una buena inspeccin se seleccionan las hembras vrgenes, los adultos machos se descartan en la morgue (frasco con alcohol). Las hembras fueron depositadas en un medio de cultivo para su mantenimiento. Se realizo el mismo procedimiento con la cepa white dumpy (bdp), pero seleccionando solo los machos y descartando las hembras. Los organismos (bf) y (wdp) se depositaron en proporciones adecuadas (15 hembras y 15 machos, p.e) en un frasco estril con medio de cultivo, controlando los factores ambientales temperatura, humedad, iluminacin como tambin las condiciones del medio para que se reproduzcan. Pasados 6 das fue posible observar una serie de larvas vermiformes blancas comiendo vorazmente del medio, las cuales empiezan a ascender por las paredes del frasco hasta empupar. En ese momento se sacaron los parentales (P1) y se llevaron a la morgue. Luego de obtener un nmero adecuado de individuos en la F1 era necesario establecer el cruce terico con el fin de definir las proporciones fenotpicas esperadas as poder cruzar individuos de F1 que sern ahora los parentales de la segunda generacin cruzndolos de la manera anteriormente descrita. Finalmente despus de obtenida la F2 se separaron machos y hembras de

MATERIALES Y METODOS Para el trabajo de adormecimiento, sexado y clasificacin de las moscas fue necesario adecuar un kit de laboratorio (pincel 0.0, embudo

cada una las mutaciones posibles en un nmero mnimo de 500 individuos, teniendo una mayor precaucin con el aislamiento de dimutantes y trimutantes ya que se entregan vivas al cepario del laboratorio de gentica de la Universidad del Tolima. TABLA 1. CRONOGRAMA ACTIVIDADES.
Actividad Entrega de medios de Drosophila STOCK Siembra de hembras vrgenes y machos (P1) Emerge F1 Siembra F1xF1 Fecha 22/03/2011

dumpy y black no se expresan pero genotpicamente son heterocigotos para los alelos del macho. En la F1 se obtiene un numero total de 198 individuos, de los cuales, fueron utilizados 35 machos () y 40 hembras () como parentales para la F2. GRAFICO 1. NUMERO DE INDIVIDUOS UTILIZADOS COMO PARENTALES DE LA F2.

DE

Comentarios (bf) y fueron necesarios seis das para un correcto aislamiento. Nmero total de hembras 15. Machos: 15. Se siembra una rplica con 10 individuos de cada sexo Segn las proporciones TABLA 2. NUMERO DE INDIVIDUOS observadas se OBTENIDOS EN LA sembr F1xF1 Nmero total DESCENDENCIA F2. de hembras 15. Machos: 15. MUTACION/SEX Se siembran dos O replicas cada una f10 42 con 10 machos y hembras.

1/04/2011

8/04/2011 15/04/2011

Emerge conteo

F2

23/04/2011 26/05/2011 F2 arrojo un nmero individuos

Finalizacin conteo F2

RESULTADOS Y DISCUSIN En la filial 1 se obtiene fenotipo silvestre para hembras () las cuales genotpicamente son heterocigotos para cada carcter estudiado (color de ojos, cuerpo, forma de las alas y cetas). Los machos () son genotpicamente hemicigotos para los alelos de las mutaciones white forked (herencia ligada al sexo) expresndose solo el carcter forked y siendo silvestre dominante sobre el color de ojos White. Los caracteres

b w Dp gran de S Wf Dpf Wdp Wb bf Wdpf Wfb TOTAL TOTAL

37 69 18 115 15 6 10 5 14 1 7 339

116 43 0 40 267 0 17 0 0 21 0 0 504 843

GRAFICO 2. NUMERO DE INDIVIDUOS OBTENIDOS EN LA DESCENDENCIA F2.

Existe segregacin independiente para los alelos wf ligados al sexo y bdp para el cruce dihbrido en Drosophila melanogaster. Hiptesis alternativa: H1: X2 >0 Existe dependencia en de los alelos ligados entrecruzamiento para en el cruce dihbrido melanogaster. Para F2 se obtiene entonces en mayor proporcion al fenotipo silvestre (267, 115=382), seguido de la mutacin forked (116, 42=158),black (43, 37=80), dumpy(40,18=58),black forked(21, 14=35). Algunas mutaciones se expresaron solo para el genero masculino como: white (69), white forked (15), white dumpy (10), white black (5), white dumpy forked (1) white forked black (7). Es posible entonces comprobar la existencia de alelos dominantes y recesivos, los cuales pueden segregarse segn la ubicacin en el cromosoma durante la meiosis para un numero maximo de ocho fenotipos esperados en un cruce dihibridido. Sin embargo, los datos obtenidos no son completamente iguales a los esperados por lo cual es necesario hacer un ajuste con la prueba conocida como Chi cuadrado X2 para examinar la probabilidad de que estas desigualdades ocuran por azar. El ajuste se calcula as: X2= (No. Observado- No. Esperado)2 No. Esperado Para el anlisis de los datos fue necesario plantear una prueba de hiptesis gentica de la siguiente manera: Hiptesis nula: Ho: X2: 0 la segregacin al sexo wf y los alelos bdp de Drosophila

X2c= = 263.563 X2c= = 233.408

: 0.05 : 0.01

11.07

15.09

X2c:263.563

Grados de libertad: 6-1: 5

: 0.05
19.68

: 0.01
24.7 X2c:233.408

Grados de libertad: 12-1: 11 Como el valor calculado para X2c es mayor que el valor tabulado, se dice, que hay entrecruzamiento o recombinacin de los alelos bdp y ligamiento de los alelos wf para el sexo en Drosophila melanogaster. Puesto que los resultados son muy significativos al nivel del 1% hay evidencia suficiente para rechazar la hiptesis nula y aceptar la hiptesis alternativa. Los valores esperados se obtienen segn las frecuencias fenotpicas del cruce terico (vase anexos); mediante la multiplicacin del nmero de la muestra por la frecuencia para cada fenotipo.

TABLA 3. PROPORCIONES MACHOS ESPERADOS OBSERVADOS EN LA F2.

DE Y

problemas de fenocopia, contaminacin u omisiones en el procedimiento. CONCLUSIONES

FENOTIPO S F Dp B W Bf Wb Wdp Wfdp fdp wfb wfdp TOTAL

OBS. 115 42 18 37 69 14 5 10 15 6 7 1 339

ESP. 42.03 42.03 21.01 21.01 42.03 21.01 21.01 21.01 42.03 21.01 21.01 21.01 336.2
DE Y

Drosophila melanogaster es una excelente modelo para el trabajo de cepas en cruces de gentica. Las diferentes clases de mutaciones permiten corroborar patrones hereditarios y comprobarlos experimentalmente mediante la ejecucin de cruces tericos y la comprobacin de datos obtenidos mediante la prueba (Chi- cuadrado). Los fenotipos de la F1 permiten evidenciar las leyes mendeliadas en funcin de la dominancia y recesividad de genes ubicados en los cromosomas autosomicos. La cruza alelos w-f ligados al sexo y involucran el patrn de herencia cruzada, caracterstica para estos genes, por lo tanto la hembra de setas (Forked) cuando se cruza con machos silvestre para este carcter, toda la descendencia masculina en F1 ser igual a su progenitora. En el caso de que la mutacin ligada al sexo (w) aparece en el macho progenitor, da como resultado la desaparicin del rasgo (w) en la F1 pero re aparece solo en los machos de la F2, comprobndose as el patrn de herencia que salta una generacin para los genes ligados al sexo. Los alelos de genes recesivos ligados al sexo (f-w) se encuentran ms frecuentemente en los machos que en las hembras, puesto que los machos de la especie de Drosophila melanogaster son hemicigotos para los caracteres ligados al sexo; estos caracteres no aparecen en las hembras a menos de que el progenitor paterno tenga la mutacin.

TABLA 4. PROPORCIONES HEMBRAS OBSERVADAS ESPERADAS EN LA F2.

FENOTIPO s f dp b fdp bf TOTAL

OBS. 267 116 40 43 17 21 504

ESP. 124.99 124.99 62.49 21.01 62.49 73.33 469.3

El ajuste de datos no es bueno, las mutaciones esperadas en el cruce terico son efectivamente obtenidas, sin embargo las proporciones fenotpicas observadas no son muy precisas y se concluye que el modelo no es til para procesos futuros. Estos resultados se le pueden atribuir a errores en el conteo y/o sexado,

En las caractersticas ligadas al sexo, los gametos parentales y recombinantes formados por la hembra pueden observarse en los machos de la F2 sin importar el genotipo de los mismos. Los alelos para las mutaciones b-dp que se encuentran en el mismo cromosoma estn ligadas, sin embargo en el proceso de recombinacin las cromatidas no hermanas de cromosomas homlogos intercambian genes, proceso donde se producen gametos recombinantes, bsico para la variabilidad gentica de una especie, en Drosophila Melanogaster esto ocurre para hembras y no para machos. Las desviaciones mencionadas entre los valores observados y esperados del cruce en el modelo experimental dihibrido sugieren que deben ser consideradas como evidencia de ligamiento.

mostro preocupacin por el estado del presente trabajo. BIBLIOGRAFIA Cruzamiento Poli hbrido. Gua de trabajo online. Universidad Complutense de Madrid. Encontrado en: http://www.ucm.es/info/genetica/grupo d/index.htm Practicas de Anlisis mendeliano. Gua de trabajo online. Universidad Complutense de Madrid. Mutantes en Drosophila. Universidad del los Andes. Gentica de poblaciones. Encontrado en http://cienciasbiologicas.uniandes.edu. co/genetica/nodo.php?id=57. WILLIAN D STANFIELD, Gentica, tercera edicin, Editorial Mc Graw Hill, Mxico 1992. WILKIN. MB, STOPFORD B., Drosophila dumpy is a gigantic extracellular protein required to maintain tension at epidermal-cuticle attachment sites. University of Manchester, School of Biological Sciences, Manchester, M13 9PT, UK PHILLIPS AM, SMART R, STRAUSS R, BREMBS B, KELLY LE. The Drosophila black enigma: the molecular and behavioural characterization of the black mutant allele. Department of Genetics, University of Melbourne, Parkville, Victoria, Australia.

AGRADECIMIENTOS Se agradece a los asistentes del laboratorio de gentica de la Universidad del Tolima, los cuales mostraron inters por el estado del experimento y ayudaron en un mejor entendimiento del cruce terico. Agradecimiento al docente Alejandro Bastidas por su ayuda en clculos estadsticos y por supuesto a la docente Mara Elosa Aldana, quien