PRCTICA No.

2 ENSAYO INMUNOENZIMTICO (ELISA) PARA LA DETECCIN DE ANTICUERPOS CONTRA EL TRIPANOSOMA CRUZI INTRODUCCIN La triponomiasis americana o enfermedad de Chagas es una parasitosis hemtica y tisular causada por la infeccin con Trypanosoma cruzi que se encuentra en las heces de los triatominos vectores que contienen tripanosomas metacclicos.1 Los sujetos infectados, generalmente en los primeros aos de la vida, pueden desarrollar una enfermedad aguda autolimitada seguida de una fase crnica. En las dos terceras partes de los infectados en fase crnica asintomtica no hay indicio de enfermedad, la infeccin se reconoce slo por la presencia de anticuerpos sricos a T. cruzi. Sin embargo, en la fase crnica sintomtica hay parsitos en tejido y parasitemia espordica y fugaz. Esta ltima condicin hace posible la transmisin de la tripanosomiasis a travs de la transfusin sangunea.2,3 La tripanosomiasis iatrognica post-transfusional es la segunda va de infeccin en zonas endmicas,y la nica en pases donde no hay tripanosomiasis o la infeccin por vector es muy rara, como en Canad y en los Estados Unidos. All se ha probado que inmigrantes hispanoamericanos han transmitido tripanosomiasis americana por va transfusional.4 En Mxico la tripanosomiasis americana se conoce desde 1940, pero slo en los ltimos 15 aos ha habido inters creciente en el estudio de la enfermedad. Hasta donde sabemos no se han descrito casos post-transfusin y hay pocos estudios de seroprevalencia entre donadores de sangre.5 A esto hay que sumar que desde 1987 se prohibi la donacin remunerada, y tambin se han modificado los mtodos serolgicos de diagnstico; lo anterior hace necesarios nuevos estudios para determinar la frecuencia de donadores seropositivos a T. cruzi.6 I. Enfermedad de Chagas.

La enfermedad de Chagas o Tripanosomiasis Americana, descubierta en Brasil, en el ao de 1909, por el Dr. Carlos Justiniano Riveiro das Chagas en Brasil es endmica en la mayora de los pases latinoamericanos, donde constituye un serio problema de salud publica, con unas 20 a 25 millones de personas infectadas con el parasito y unas 6 a 8 millones de ellos con alguna manifestacin clnica de la forma crnica de la enfermedad. Epidemiologa El hombre y ms de 150 especies de animales domsticos y salvajes (cnidos, felinos, roedores, marsupiales, edentados y quirpteros) actan como reservorios del parsito a partir de los cuales se infecta el vector; y de ser primitivamente una zoonosis causada por Tripanosoma (Schizotrypanum) cruzi, que inicialmente se transmita principalmente entre pequeos mamiferos salvajes, pas a los animales domsticos y a los seres humanos a travs de triatominos, insectos del orden Hemptera, Reduviidae, subfamilia Triatominae, principalmente los gneros Rhodnius, Triatoma y Panstrongylus; vectores ampliamente distribuidos en regiones tropicales y subtropicales en el continente americano desde el sur de los estados Unidos de Amrica hasta el sur de Chile y Argentina. De esta manera, ocurren ciclos domiciliarios en el cual la participacin humana es fundamental y ciclos silvestres con exclusin total del hombre en la cadena epidemiolgica. Los triatominos colocan hasta 300 huevos durante toda su vida que tiene una duracin aproximadamente de 400 das y se desarrollan a travs de 5 estadios ninfales (ninfas I; II; III; IV y V) desde el huevo hasta alcanzar el estado adulto. Son insectos hematfagos obligados y chupan sangre desde el estadio I, contagindose con T. cruzi desde un animal o humano infectado y una vez en el insecto, el T. cruzi permanece en su intestino de por vida. Vas de Transmisin. La principal va de transmisin es la vectorial, que se estima en ms del 80% de los casos conocidos, en reas tradicionalmente endmicas y en nuevas reas, explicando la mayora de las 200,000 nuevas infecciones que ocurren anualmente en Amrica Latina, de acuerdo a la incidencia estimada para el ao 2000. La transmisin vectorial se realiza indirectamente, por el contacto de la materia fecal con parsitos, ya sea con el orificio de la piel producido por la picadura del triatomino para succionar sangre, o por el depsito de heces sobre mucosas del husped. Otra va de transmisin vectorial posible es la transmisin oral descrita desde la dcada de 1960, en casos aislados y en forma de brotes. Sin embargo, existen otras

vas como la transfusin sangunea, transmisin congnita, trasplante de rganos y la relacionada con accidentes de laboratorio u ocupacionales en trabajadores de la salud. Clasificacin Clnica La enfermedad de Chagas evoluciona en tres fases: aguda, indeterminada y crnica; cada una de ellas con caractersticas clnicas y criterios diagnsticos y teraputicos diferentes.

La Fase Aguda se inicia al momento de adquirir la infeccin por cualquiera de sus vas y dura entre 2 y 4 meses. Se caracteriza por presentar positividad en los estudios parasitolgicos directos en sangre y los sntomas son inespecficos. La Fase Indeterminada corresponde a la etapa que sigue a la fase aguda y comienza cuando la parasitemia se vuelve indetectable por los mtodos parasitolgicos directos. Ser forma indeterminada cuando no presenta sntomas ni signos de lesin visceral clnicamente evidentes con electrocardiograma y estudio radiolgico de trax y aparato digestivo normales. La fase indeterminada puede durar toda la vida, o derivar en la fase crnica en la cual al cabo de 15 a 20 aos aparece alguna manifestacin orgnica cardiaca, digestiva, mixta o neurolgica.

Diagnstico El diagnstico etiolgico de la Enfermedad de Chagas se basa en la: Clnica, epidemiologa y laboratorio. Para el diagnstico de laboratorio, los exmenes adecuados dependen de la etapa clnica del paciente. En la etapa aguda los estudios se centran en la bsqueda y reconocimiento del Tripanosoma cruzi en sangre (metodologa parasitolgica directa), porque en las etapas iniciales de la enfermedad se encuentran parasitemias importantes, y a medida que transcurre la infeccin van disminuyendo hasta hacerse mnimas y aleatorias. En las etapas crnicas (inaparente o indeterminada y sintomtica) las parasitemias son transitorias y por ello el diagnstico se realiza fundamentalmente mediante el hallazgo de anticuerpos circulantes contra el T. Cruzi. Clasificacin de enfermedad de Chagas en fase aguda

Caso Agudo sospechoso: Persona con fiebre de ms de 5 das de duracin, de etiologa no identificada, acompaada o no de escalofros y que presente uno o ms de los siguientes sntomas o signos: Mialgias o Artralgia Debilidad General Astenia Diarrea Dolor Abdominal Disnea Dolor Torcico Taquicardia/palpitaciones Hepatomegalia Adenopatas Edema facial y/o Miembros Inferiores Eritema Nodoso (adultos) En caso de recin nacidos son sospechosos los cuadros clnicos caracterizados por prematurez, hepatoesplenomegalia y fiebre prolongada.

Caso Agudo Confirmado: caso sospechoso o no, confirmado por laboratorio mediante la positividad de uno o ms de los siguientes resultados:

Parasitemia: Presencia del T. cruzi en examen directo, por cultivo, por aislamiento en animales de
laboratorio, por xenodiagnstico o PCR.

Seroconversin o aumento de ttulos 4 diluciones de anticuerpos positivos contra el T. cruzi mediante

2 mtodos de investigacin: - Inmunofluorescencia Indirecta (IFI), Ensayo Inmunoenzimtico (ELISA) Aglutinacin Directa (AD) con y sin Mercaptoetanol.

Mediante examen anatomopatolgico, inmunohistoquimica o PCR.

en

caso

de

fallecimiento,

compatible

por

Caso Agudo Probable: caso sospechoso sin confirmacin de laboratorio, pero vinculado a un brote de transmisin vectorial o con nexo epidemiolgico domiciliario Caso Agudo Descartado: caso probable con serologa repetida negativa a los 30 das de la primera muestra.

Para el diagnstico etiolgico de enfermedad de Chagas en fase aguda:

Mtodos Parasitolgicos: se trata de los mtodos ms recomendados en la investigacin de

tripanosomiasis aguda y se refieren en orden creciente de complejidad y sensibilidad los siguientes Gota Fresca y Gota Gruesa, Mtodo de Strout, Mtodo de Capilares, Hemocultivo, Xenodiagnstico y PCR (Reaccin en Cadena por la enzima Polimerasa). Cabe mencionar que la bsqueda de T.cruzi en gota gruesa a partir de sangre perifrica es un mtodo 100 % especfico, pero de muy baja sensibilidad , dando numerosos falsos negativos, ya que la observacin de los mismos depende del tamao de la gota y la cantidad de parsitos circulantes. Por el contrario el mtodo de Strout concentra los elementos parasitarios mediante centrifugacin y tiene una especificidad del 100% y una sensibilidad del 95 % . Mtodos Serolgicos: En la etapa aguda la capacidad de identificar anticuerpos se registra a partir de la 4a.semana de la infeccin. Para establecer un diagnstico de fase aguda mediante serologa convencional debe registrarse una seroconversin (de negativo a positivo) entre dos muestras pareadas de suero obtenidas con un mes de diferencia como mnimo. Los mtodos serolgicos determinan inmunoglobulinas humanas de los tipos M y G. El resultado positivo del diagnstico parasitolgico es la certificacin de la infeccin, sin embargo un resultado parasitolgico negativo no indica necesariamente ausencia de infeccin; por lo que se recomienda complementar la investigacin de casos sospechosos con el seguimiento de la evolucin de ttulos serolgicos en el tiempo en los casos sospechados de infeccin. Los mtodos recomendados en esta etapa son la Inmunofluorescencia Indirecta (IFI), el Ensayo Inmunoenzimtico (ELISA) y Aglutinacin Directa (AD) con y sin Mercaptoetanol. Interpretacin de los resultados serolgicos. En la fase aguda es bien limitada, al menos en un primer momento, la produccin de anticuerpos de la clase IgG, por lo cual las reacciones serolgicas, en general, son negativas, positivizndose las ms sensibles (TIF) recin a los 15 o 20 das de evolucin por lo cual debe priorizarse la investigacin parasitolgica. Resultados serolgicos contradictorios: En el caso de encontrar resultados No concordantes entre las dos pruebas serolgicas empleadas, se recomienda: - Repetir nuevamente ambos ensayos, para descartar errores operativos. - Efectuar una tercera reaccin serolgica o remitir la muestra a un laboratorio de mayor complejidad para su resolucin. - En caso de persistir la discordancia de resultados, analizar una nueva muestra en un lapso de 20 a 30 das. Tratamiento etiolgico de enfermedad de Chagas en fase aguda. Medicamentos para tratamiento especifico de tripanosomiasis aguda: Para tratamiento en el perodo agudo chagsico se dispone de tratamiento especfico con dos productos disponibles: Nifurtimox (Nitrofurfuriliden-amino) y Benznidazol (Nitroinmidazolacetamida); sin embargo slo est accesible el Benznidazol de la Casa Roche que se administra a la dosis de 5 7 mg/kg/da, a cualquier edad, durante 30 das.7 SIGNIFICACIN CLNICA DEL MTODO La enfermedad de Chagas, es una infeccin parasitaria producida por el Tripanosoma cruzi. Las formas agudas predominan entre los nios y se caracterizan por linfoadenopatas, hepatoesplenomegalia y edema facial. La miocarditis aguda es un signo comn y puede ser fatal. Pero en la mayora de los casos la enfermedad evoluciona hacia fase crnica, que suele ser prcticamente asintomtica o acompaarse de miocardiopatas y otras manifestaciones tardas (megaesfago y megacolon), cuyas consecuencias tambin pueden ser fatales. El diagnstico de laboratorio depende del estadio en el cual se encuentre la enfermedad, si bien la infeccin por T. cruzi estimula la produccin de anticuerpos de tipo IgG especificos en el husped, tales anticuerpos se encuentran en muy bajas concentraciones en el suero del pacientes con Chagas agudo. De tal forma que: Durante la fase aguda, el diagnstico se efecta directamente mediante la comprobacin de los parsitos en la sangre (por microscopa, cultivos en agar-sangre, xenodiagnsticos) o por mtodos inmunolgicos de detecten IgM

 Durante la fase crnica, se pueden usar mtodos inmunolgicos cuya practicidad hace posible su empleo como prueba tamiz, especialmente en el control de donantes para los bancos de sangre y en el estudio epidemiolgicos (primera etapa de la erradicacin de la enfermedad) Este ltimo tipo de pruebas se comenzaron a aplicar en 1913, a partir de la Reaccin de Fijacin de Complemento de Machado y Guerreiro. Luego se desarrollaron numerosos mtodos de inmunodiagnstico, tales como las reacciones de aglutinacin de ltex, floculacin, hemaglutinacin, aglutinacin directa, inmunofluorescencia y ltimamente ELISA. FUNDAMENTOS DEL MTODO La muestra se diluye en el soporte en el que se encuentra inmovilizado el antgeno. Si la misma contiene los anticuerpos especficos, stos formarn un complejo con los antgenos y permanecern unidos al soporte. La fraccin no unida se elimina por lavado tras lo que se agregan anticuerpos antiinmunoglobulina humana conjugados con peroxidasa. Si se produjo la reaccin en la primera etapa del proceso, se unir el conjugado. Luego de un nuevo lavado se agrega el sustrato enzimtico. En los casos en que se haya unido el conjugado habr participacin de color celeste. La reaccin se detiene con cido sulfrico, con lo que el color celeste vira al amarillo. REACTIVOS PROVISTOS Microplaca: 12 tiras de 8 pocillos que contienen Ag citoplasmticos y de membrana de Tripanosoma cruzi inmovilizados. Lote 710337 (30/04/09) Conjugado: anti-inmunoglobulinas humanas (cabra) conjugadas con peroxidada. Lote 710357 (30/12/08) Revelador A: perxido de hidrgeno 60mmol/L en buffer citrato 50mmol/l pH 3,2 Lote: 710946 (30/04/09) Revelador B: tetrametilbencidina (TMB) 0,01mol/L en HCl 0,1N Lote: 710947 (30/04/09) Solucin de paro: cido sulfrico 2N Lote: 710943 (30/04/09) Buffer de lavado concentrado: cloruro de sodio 1,4mol/L en buffer fosfatos 100mmol/L y tensioactivo no inico 0,1g/L Lote: 709470 (30/03/09) Diluyente de muestras: albmina bovina en solucin fisiolgica tamponada con buffer fosfatos pH 7,2 Lote: 710943 (30/04/09) Control negativo: dilucin de suero no reactivo, inactivado Lote: 710928 (30/04/09) Control positivo: dilucin de suero inactivado conteniendo Ab contra Tripanosoma cruzi Lote: 710929 (30/04/09) INSTRUCCIONES PARA SU USO Buffer de lavado: para usar diluir 1:4 con agua destilada. A baja temperatura los componentes del reactivo pueden precipitar. En tal caso, colocar en bao de agua a 37C unos minutos, mezclando luego por inversin. Microplaca: sensibilizada: lista para usar. Conjugado: listo para usar Revelador A y B: listo para usar Solucin de paro: listo para usar. Diluyente de Muestras: listo para usar. El color del diluyente de Muestras puede variar de lote a lote sin que se afecte la funcionalidad del mismo. Control Positivo y Control Negativo: listo para usar. PRECAUCIONES Todas las muestras de pacientes deben manipularse como si fueran capaces de transmitir infeccin. Los controles se encuentran inactivados, sin embargo, deben emplearse como si se tratara de material infectivo.

Los sueros controles han sido examinados para antgeno de superficie de hepatitis B (HBsAg) y virus
de inmunodeficiencia humana (HIV) encontrndose no reactivos.

Todos los materiales empleados en el ensayo deben ser destruidos a fin de asegurar la inactivacin de

agentes patgenos. El mtodo recomendado para este procedimiento es autoclavar durante una hora a 121 C. los lquidos de desecho pueden ser desinfectados por hipoclorito de sodio 8concentracin final 5%) durante por lo menos 60 minutos. No intercambiar reactivos de distintos equipos y lotes. No emplear reactivos de otro origen. Las microplacas deben incubarse en estufa. No usar bao de agua. Debe evitarse abrir la estufa durante este proceso. Evitar que los vapores de hipoclorito provenientes de los recipientes para desechos biolgicos u otras fuentes, entren en contacto con la policubeta ya que el hipoclorito afecta la reaccin.

 Los reactivos son para uso in vitro.

Evitar el contacto del cido sulfrico con la piel y mucosas. Evitar el derrame de lquidos y formacin de aerosoles. ESTABILIDAD E INSTRUCCIONES DE ALMACENAMIENTO Los Reactivos Provistos son estables en refrigerador (2 a 8C) hasta la fecha de vencimiento indicada en la caja. No congelar. Buffer de lavado: es estable 3 meses a temperatura ambiente. Microplacas sensibilizada: las tiras de pocillos con antgeno inmovilizado se proveen cerradas al vaco y con desecante. No abrir el paquete hasta el momento de usar, ni antes que haya tomado temperatura ambiente, de lo contrario se favorecer la hidratacin del contenido. Las tiras de pozos no utilizadas deben conservarse dentro del sobre con el desecante, cerrado con cinta autoadhesiva entre 2 a 8 C. Las tiras conservadas en estas condiciones pueden ser utilizadas dentro de los 5 meses posteriores mientras no se supere la fecha de vencimiento del equipo. MUESTRA Suero o plasma

a) b)

Recoleccin: obtener suero de la manera usual. No debe usarse muestras inactivadas por calor.

Aditivos: no se requieren. Si se emplea plasma puede utilizarse cualquier anticoagulante de uso corriente en la prctica transfusional. c) Sustancia interferentes conocidas: la hemlisis, hiperlipemia y otras causas de turbiedad pueden provocar resultados errneos. Estas muestras deben ser clarificadas por centrifugacin. d) Estabilidad e instrucciones de almacenamiento: las muestras no diluidas pueden conservarse durante 7 das entre 2 y 8C. para la conservacin por periodos ms prolongados, deben ser congelados a -20C o menos. Evitar la congelacin y descongelacin reiterados. Existen evidencias que muestran que los congelamientos sucesivos pueden ser causa de resultados errneos. Si las muestras deben de ser transportadas, empacar de acuerdo a las especificaciones legales relativas al envo de materiales infecciosos. MATERIAL Micropipetas capaces de medir volmenes indicados. Reloj alarma o cronmetro. Estufa a 37 C 1 vaso de precipitados de 250ml Tubos vacutainer con heparina y ligadura Centrfuga Pipetas Pasteur con bulbo CONDICIONES DE REACCIN Longitud de onda: 450nm. Longitud de onda secundaria (dicromtica):620-650nm.

Calibracin del instrumento: llevar a cero el espectrofotmetro con Blanco de Reactivos procesndolo de la misma forma que una determinaron pero omitiendo colocar Muestra. Tiempo de reaccin: 90 minutos. Temperatura de reaccin: 37 C y Temperatura ambiente. Volumen de muestra: 10 L. PROCEDIMIENTO Llevar a temperatura ambiente los reactivos y las muestras antes de iniciar la prueba. Una vez iniciado el anlisis debe completarse sin interrupcin.

Procesar simultneamente 2 Controles Positivos (CP), 3Negativos (CN) y las Muestras (M). al depositar la muestra y/o controles sobre Diluyente de Muestras, debe asegurarse de colocar los mismos en e seno del lquido y no sobre las paredes o el fondo del pozo. Enjuagar la pipeta con el Diluyente, depositarlo en el pozo para asegurar la correcta homogenizacin. En los pozos a utilizar de la Microplaca colocar: M CP CN

Diluyente de muestra Control Positivo Control Negativo Muestra

200 L 10 L

200 L 10 L -

200 L 10 L -

Mezclar aplicando suaves golpes en los laterales de la microplaca durante 10 segundos una vez cargadas las muestras en cada tira. Para evitar la evaporacin, cubrir la placa con una cinta autoadhesiva e incubar en la estufa 30 minutos a 37C. Luego aspirar cuidadosamente el lquido de cada pozo recibindolo en un recipiente para desechos biolgicos que contenga 5% de hipoclorito sdico. A continuacin, lavar 5 veces con Buffer de Lavado empleando aproximadamente cada vez 300 L/pozo. Despus de cada lavado, el lquido se descartar tambin en el recipiente con hipoclorito. Al finalizar el ultimo lavado, eliminar por completo el lquido residual, invirtiendo la microplaca y golpendola varias veces sobre papel adsorbente, ejerciendo una leve presin con la mano sobre los laterales mayores del soporte, para evitar la cada de las tiras de pozos. Luego agregar en cada pocillo: Conjugado 1 gota 1 gota 1 gota

En caso de utilizar micropipeta automtica, dispensar 60 L. Mezclar aplicando suaves golpes en los laterales de la microplaca durante 10 segundos. Para evitar la evaporacin, cubrir la placa con una cinta autoadhesiva e incubar en la estufa 30 minutos a 37C. Luego aspirar cuidadosamente el lquido de cada pozo recibindolo en un recipiente para desechos biolgicos que contenga 5% de hipoclorito sdico. A continuacin, lavar 5 veces con Buffer de Lavado empleando aproximadamente cada vez 300 L/pozo. Despus de cada lavado, el lquido se descartar tambin en el recipiente con hipoclorito. Al finalizar el ultimo lavado, eliminar por completo el lquido residual, invirtiendo la microplaca y golpendola varias veces sobre papel adsorbente, ejerciendo una leve presin con la mano sobre los laterales mayores del soporte, para evitar la cada de las tiras de pozos. Luego agregar en cada pozo: Revelador A Revelador B 1 gota 1 gota 1 gota 1 gota 1 gota 1 gota

Mezclar aplicando suaves golpes en los laterales de la microplaca durante 10 segundos.

Leer en espectrofotmetro a 450 nm o dicromtica a 450/620-650 nm o evaluar el resultado a simple vista por comparacin con los controles Positivos o Negativos.

ESTABILIDAD DE LA MEZCLA DE REACCION FINAL El color de la reaccin es estable durante 30 min., por lo que los resultados deben observarse durante ese lapso. CRITERIOS DE VALIDACION DE LA CORRIDA La corrida se considera vlida si se cumple simultneamente las siguientes condiciones: a) b) Las lecturas de al menos 2 de 3 de los Controles Negativos corregidas contra el Blanco de Reactivos deben ser menores o iguales a 0.150 D.O La lectura media de los Controles Positivos corregida debe ser mayor o igual a 0.600 D.O.

Si una o ambas de estas condiciones no se cumplen, repetir la corrida. Para ambos casos recordar que las lecturas obtenidas dependern de la sensibilidad del aparato empleado INTERPRETACION DE LOS RESULTADOS a) Con instrumental ptico: La presencia o ausencia de anticuerpos anti-T cruzi se determina relacionando la absorbancia de la muestra al Valor Cut-off. Cut-off=CN + 0.200 D.O. Donde CN: promedio de las lecturas del control Negativo. Zona de indeterminacin: Cut-off 10%

Muestras No Reactivos: se consideran aquellas con absorbancias menores al lmite inferior de la zona de indeterminacin.

Muestras Reactivas: se consideran aquellas con absorbancias mayores al lmite superior de la zona de indeterminacin. Muestras indeterminadas: se consideran aquellas con absorbancias que caen dentro de la zona de indeterminacin. Estas muestras deben ser ensayadas nuevamente.

b)

Interpretacin visual: Si se opta por este tipo de interpretacin debe considerarse No reactiva toda muestra que no presente una coloracin mayor que la de los Controles Negativos. Por lo contrario, una muestra netamente amarilla se considera Reactiva. Colores tenues mayores que el del Control Negativo, requieren la interpretacin instrumental.

LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO Ver sustancias interferentes conocidas en MUESTRA. Constituyen causas de resultados errneos:

Lavado incorrecto de los pozos de reaccin. Contaminacin cruzada de muestras No Reactivas con anticuerpos procedentes de una nueva muestra Reactiva. Contaminacin de la solucin cromognica con agentes oxidantes (cloro, etc.) Contaminacin de la solucin de Paro Contaminacin del Buffer de Lavado diluido. Verificar la limpieza de los recipientes donde se prepara y almacena. Si se observa turbidez o precipitado al prepararlo, desechar. Conservacin inadecuada de las tiras de pozos no utilizadas Ocasionalmente, al efectuar lecturas dicromticas pueden obtenerse absorbancias negativas que no invalidan la determinacin. Esto se debe a que algunas muestras dan lecturas inferiores al Blanco de Reactivos. No utilizar muestras inactivas por calor ya que pueden ocasionar resultados falsos positivos - No utilizar bao de agua para la incubacin.

Un resultado negativo no excluye la posibilidad de exposicin o infeccin por T. cruzi. Verifique que el sistema lavador que est usando, aspire totalmente el contenido y que la altura de la solucin lavadora depositada sea pareja.

CARACTERISTICAS DE FUNCIONAMIENTO:

a)

Sensibilidad: sobre un panel de 94 muestras con serologa positiva coincidente por dos mtodos de referencia (hemaglutinacin indirecta e inmunofluorescencia indirecta), la sensibilidad es del 100%. b) Especificidad: sobre un panel de 348 muestras con serologa negativa coincidente por dos mtodos de referencia (hemaglutinacin indirecta e inmunofluorescencia indirecta), la sensibilidad es del 99.6%. c) Estudio poblacional: en una poblacin general que incluye individuos somos, donantes, chagsicos y con otras patologas, la correlacin con respecto a mtodos confirmatorios, fue del 99.7% No obstante la sensibilidad del mtodo, sus resultados, al igual que los de cualquier mtodo, sus resultados, al igual que los de cualquier mtodo sexolgico, slo constituyen un dato auxiliar para el diagnstico. Es por esta razn que los informes deben de ser considerados en trminos de probabilidad de parasitosis por T. cruzi. Cualquier resultado reactivo debe de ser verificado por otra tcnica, tal como inmunofluorescencia, fijacin de complemento, hemaglutinacin indirecta, aglutinacin directa, etc. Recomendado por la OMS, segn el cual es necesaria la concordancia de dos pruebas realizadas simultneamente para tener un inmunodiagnstico preciso. RESULTADOS Todos los sujetos dieron negativos a la prueba.

En el caso de nuestro equipo la prueba salio mal debido a una falta de coordinacin en el equipo, debido a que se adicion la solucin stop antes de los reveladores, razn por la cual se pidieron los resultados de otro equipo para realizar las discusiones de los resultados.

Se realiz la prueba por segunda ocasin y en esta ocasin la prctica si salio bien como se puede observar en las siguientes imgenes:

DISCUSIN DE RESULTADOS Se realiz la prueba de ELISA para la enfermedad de Chagas causada por Treponema Cruzi.

Primeramente al agregar los controles positivos, negativos y las muestras a las microplacas de poliestireno lo que se hizo fue proveer que se pegaran los antgenos a las placas y as mismo los anticuerpos a los antgenos, razn por la cual se realiz la incubacin a 37C (que es la temperatura corporal). El diluyente debido a que contiene albmina en solucin fisiolgica tamponada con buffer de fosfatos a pH 7.2, su funcin fue la de rellenar los huecos que existan entre antgeno y antgeno (es de cir, entre Tripanosoma y tripanosoma) para evitar que se dieran falsos positivos. Los lavados con el buffer sirvieron para desechar los anticuerpos que no eran especficos para el antgeno. Por medio del conjugado se diferencia la presencia de antgenos ya que contiene antiinmunoglobulinas humanas (cabra) conjugadas con peroxidasa, es decir: anti anticuepo + enzima peroxidasa donde el sustrato va a ser el perxido de hidrgeno que contiene el revelador A. Despus al volver a lavar aquello que no reaccion se desecha.

Al agregar el revelador A como ya se mencion, este al contener al sustrato de la enzima (H 2O2), la peroxidasa del conjugado lo desdobla produciendo una reaccin de tipo redox.

2 H 2 O Peroxidasa 2 H 2 O + O2
protena. El revelador B al poseer el TMB que esta oxidado se reduce y cambia a una coloracin azul. Al meterse a incubar de nuevo se produce la reaccin de tipo enzimtica. Al adicionar la solucin stop ya que este es un cido (H 2SO4) para la reaccin al desnaturalizar a la

De esta forma se observaron como resultados finales a los controles positivos de coloracin amarilla intensa (debido a la reaccin del cromgeno con el cido) y a los controles negativos y a todas las muestras incoloras, lo que para las muestras indico negatividad para T. cruzi. CONCLUSIONES El Test ELISA para Chagas es un ensayo inmunoenzimtico en fase slida para la deteccin cualitativa de anticuerpos contra T. cruzi. Se realiza en placas cuyos pocillos han sido activados con extractos totales de l cepas de T. cruzi incluyendo antgenos de membrana altamente inmunognicos. El recubrimiento de los pocillos se realiza mediante tecnologa consistente en la utilizacin de un adhesivo biolgico (poliestireno) que facilita la inmovilizacin de los antgenos y aumenta la estabilidad de la placa activada. Si las muestras analizadas contienen anticuerpos especficos para T. cruzi, stos formarn un complejo estable con los antgenos que recubren los pocillos. El material unido en forma inespecfica ser eliminado por medio del lavado. Durante la incubacin con el conjugado, los anticuerpos anti-IgG humana marcados con peroxidasa se unirn al complejo formado. Finalmente, en la etapa de incubacin con el sustrato cromognico, la peroxidasa unida al complejo producir una coloracin que permitir detectar las muestras reactivas para T. cruzi. La reaccin enzimtica se detendr por la adicin de cido sulfrico, midindose luego la intensidad del color en un lector colorimtrico para placas de ELISA o como se realiz en nuestro caso cualitativamente por medio del cambio de coloracin. REFERENCIAS

1 2

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