Вы находитесь на странице: 1из 15

ACARA VIII UJI CEMARAN MIKROBA : ANGKA LEMPENG TOTAL (ALT) DAN ANGKA KAPANG KHAMIR (AKK)

A. TUJUAN 1. Menghitung jumlah mikroba aerob mesofil yang terdapat dalam produk makanan. 2. Menguji bahwa produk makanan yang diuji tidak boleh mengandung mikroba melebihi batas yang ditetapkan karena berbahaya (toksik) bagi kesehatan.

B. DASAR TEORI Pertumbuhan kuman merupakan peningkatan umlah sel kuman yang terjadi akibat peningkatan biomassa kuman yang teratur, pertumbuhan kuman memerlukan lingkungan nutrisi yang cocok sehingga dapat mendukung proses perkembangbiakan kuman. Konsentrasi sel kuman dapat diukur dengan perhitungan jumlah sel hidup dengan cara pengenceran yang diikuti dengan penentuan unit pembentukan koloni pada permukaan media agar (Arthur, 1993). Kapang adalah kelompok mikroba yang tergolong dalam fungi. Kapang adalah fungi yang mempunyai filamen (miselium). Sedangkan khamir adalah juga termasuk fungi, tapi yang dibedakan dari kapang karena bentuknya yang terutama uniseluler. Reproduksi vegetatif khamir dengan pertunasan dan dapat tumbuh lebih cepat daripada kapang. Khamir lebih efektif memecah komponen kimia dibandingkang kapang karena mempunyai perbandingan luas permukaan dengan volume yang lebih besar.

Khamir tidak dapat melakukan proses fotosintesis. Sel khamir mempunyai ukuran sel yang bervariasi yaitu dengan panjang 1-5mikrometer dan lebar 110 mikrometer. Bentuk sel khamir yaitu bulat, oval, silinder, bulat panjang dengan salah satu ujung runcing, segitiga melengkung berbentuk botol, bentuk apikulat dan lemon dan sebagainya (Srikandi, 1992). Uji angka lempeng total bertujuan untuk menunjukkan jumlah mikroorganisme dalam suatu sediaan dengan metode hitungan cawan. Jika sel masih dapat ditumbuhkan pada medium agar, maka sel mikrobia tersebut akan berkembang biak dan membentuk koloni yang dapat langsung dilihat dengan mata tanpa menggunakan mikroskop. Cara perhitungan koloni yaitu dengan memilih cawan yang ditumbuhi koloni dengan jumlahnya berkisar antara 25 koloni 250 koloni. Bila tiap cawan memiliki tingkat pengenceran yang berbeda, tetapi memiliki jumlah koloni seperti kisaran di atas, maka pilih cawan koloni dengan koloni yang banyak. Kemudia gunakan tally counter untuk menghitung jumlah koloni. Beri tanda pada koloni yang telah dihitung untuk menghindari perhitungan ulang. Bila ada koloni yang menyebar dihitung sebaga isatu koloni. Akan tetapi bila lebih dari 25% koloni yang tumbuh pada cawan adalah koloni yang menyebar, maka cawan tidak perlu dihitung. Perhitungannya (jumlah koloni per ml sampel) adalah dengan mengalikan jumlah rata-rata koloni dari pengenceran yang dipilih dengan kebalikan dari faktor pengenceran. Secara sistematis dapat dirumuskan sebagai berikut : Faktor pengenceran = (pengenceran) x (jumlah yang ditumbuhkan) Jumlah koloni = (jumlah koloni) x (1/faktor pengenceran) (Anonim, 2001). Jumlah mikrobia pada suatu bahan dapat ditentukan dengan bermacammacam cara, tergantung pada bahan dan jenis mikrobia yang ditentukan. Jenis populasi mikrobia dlama tanah, air, bahan makanan, dll. Berbeda-beda tergantung pada susunan bahan tersebut. Ada 2 cara perhitungan jumlah

mikrobia, yaitu perhitungan secara langsung (direct method) dan secara tidak langsung (indirect method) (Jutono, 1980).

1. Perhitungan Jumlah Mikrobia secara Langsung Cara ini dipakai untuk menentukan jumlah mikrobia keseluruhan baik yang mati maupun yang hidup. Ada beberapa cara perhitungan antara lain :
a.

Menggunakan counting chamber Perhitungan ini dapat memakan haemacytometer, PetroffHausser Bacteria Counter atau alat-alat lain yang sejenis. Dasar perhitungannya ialah dengan menempatkan 1 tetes suspensi bahan atau biakan mikrobia pada alat terebut, ditutup dengan gelas penutup kemudia diamat idengan mikroskop yang perbesarannya tergantung pada besar kecilnya mikrobia. Dengan menentukan jumlah sel ratarata tiap petak (ruangan) yang telah diketahui volumenya dari alat tersebut dapat ditentukan jumlah sel mikrobia tiap cc (Jutono, 1980).

b. Menggunakan cara pengecatan dan pengamatan mikroskopik Pada cara ini mula-mula dibuat preparat mikroskopik pada gelas benda : suspensi bahan atau biakan mikrobia yang telah diketahui volumenya diratakan di atas gelas benda pada suatu luas tertentu. Setelah itu preparat dicat dan dihitung jumlah rata-rata sel mikrobia tiap bidang pemandangan mikroskop. Luas bidang pemandangan mikroskop dihitung dengan mengukur garis tengahnya. Jadi jumlah mikrobia yang terdapat pada gelas benda seluruhnya dapat dihitung. Dengan perhitungan dapat diperoleh

jumlah mikrobia tiap cc bahan/cairan yang diperiksa. Cara yang hampir sama yang biasanya dipakai untuk menghitung jumlah bakteri ialah dengan mencampurkan 1 cc biakan bakteri dengan 1 cc dara manusia; setelah tercampur homogen dibuat preparat mikroskopik. Dari perbandingan jumlah rata-rata sel bakteri dan jumlah sel darah merah dalam tiap bidang pemandangan, jumlah bakteri tiap cc dapat dihitung, sebab darah manusia yang normal rata-rata mengandung 5 juta sel darah merah tiap cc (Jutono, 1980).
c. Menggunakan filter membran (milliporefilter)

Mula-mula disaring sejumlah volume tertentu suatu suspensi bahan atau biakan mikroba kemudian disaring dengan filter membran yang telah disterilkan. Dengan menghitung jumlah sel rata-rata tiap kesatuan luas pada filter membran dapat dihitung jumlah sel dari volume suspensi yang disaring. Kalau perhitungan secara biasa sukar, perlu dilakukan pengecatan pada filter membran, kemudia filter membran dijenuhi dengan minyak imersi supaya dapat menjadi trasparan (Jutono, 1980).

2.

Perhitungan Jumlah Mikrobia secara Tidak Langsung

a. Menggunakan sentrifuge

Caranya ialah 10 cc biakan cair mikrobia disentrifuge dengan memakai sentrifuge yang biasa dipakai untuk menentukan jumlah butir-butir darah. Supaya hasilnya dapat dipertanggungjawabkan, maka kecepatan dan waktu sentrifugasi harus diperhatikan. Setelah diketahui volume mikrobia keseluruhan makan dapat dipakai untuk menentukan jumlah sel-sel mikrobia tiap cc, yaitu dengan membagi volume mikrobia keseluruhan dengan volume rata-rata tiap sel mikrobia (Jutono, 1980).

b. Berdasarkan kekeruhan Dasar penentuan cara ini ialah jika seberkas sinar dilewatkan pada suatu suspensi mikrobia makan makin pekat (keruh) suspensi tersebut makin besar intensitas sinar yang diabsorpsi sehingga intensitas sinar yang diteruskan makin kecil. Untuk keperluan ini dipakai alat-alat seperti photoelectric turbidimeter : electrophotometer; spectrophotometer; nephelometer dan alat lain yang sejenis. Alat tersebut memakai sinar monokromatik dengan panjang gelombang tertentu. Dengan membaca persentase sinar yang diabsorpsi atau sinar yang diteruskan dan dibandingkan dengan suspensi standar mikrobia sama yang telah diketahui jumlahnya tiap cc. Alat yang paling sederhana untuk penentuan tersebut ialah komparator blok, tapi penggunaan alat ini kesalahannya sangat besar sebab cara pengamatannya hanya memakai mata biasa (Jutono, 1980).
c. Menggunakan penghitung elektronik (electronic counter)

Alat ini dapat menentukan beribu-ribu sel tiap detik secara tepat. Prinsip kerjanya ialah adanya gangguan-gangguan pada aliran ion-ion (listrik) yang bergerak di antara kedua elektrode. Penyumbatan sementara oleh sel mikrobia pada pori sekat yang terdapat di antara kedua elektrode itu menyebabkan terputusnya aliran listrik. Jumlah pemutusan aliran tiap satuan waktu dihubungkan dengan kecepatan aliran cairan yang mengandung mikrobia merupakan ukuran jumlah mikrobia dalam cairan tersebut (Jutono, 1980). d. Berdasarkan analisa kimia Cara ini didasarkan atas hasil analisa kimia sel-sel mikrobia. Makin banyak sel-sel mikrobia, makin besar hasil analisa kimianya secara kuantitatif. Yang dipakai sebagai dasar penentuan umummnya

ialah kandungan protein : asam-asam nukleat (DNA dan RNA) atau fosfor dari asam-asam nukleat, dan sebagainya (Jutono, 1980). e. Berdasarkan berat kering Cara ini terutama digunakan untuk penentuan jumlah jamur benang misalnya dalam industri mikrobiologi. Kenaikan berat kering suatu mikrobia berarti juga kenaikan sintesa dan volume sel-sel yang dapat dipakai untuk menentukan jumlah mikrobia (Jutono, 1980). f. Menggunakan cara pengenceran Cara pengenceran ini dipakai untuk menentukan jumlah mikrobia yang hidup saja. Dasar perhitungannya ialah mengencerkan sejumlah volume tertentu suatu suspensi bahan atau biakan mikroba secara bertingkat. Seletah diinokulasikan ke dalam medium dan diinkubasikan dilihat adanya pertumbuhan mikrobia. Misalnya suatu seri pengenceran dengan kelipatan 10 pada pengenceran 1 : 1000 ada pertumbuhan tetapi pada pengenceran 1 : 10000 tidak ada pertumbuhan, berarti secara teoretis jumlah mikrobia pada suspensi bahan atau biakan mikrobia antara 1000 dan 10000 tiap cc (Jutono, 1980).
g. Menggunakan cara Most Probable Number (MPN)

Cara di atas kurang tepat mengingat tidak semua mikrobia dapat tumbuh dalam suatu medium pada keadaan tertentu. Untuk mengatasinya makan tiap pengenceran dibuat beberapa ulangan, hasilnya secara matematik dapat untuk menentukan kemungkinana besar jumlah mikrobia yang terdapat dalam suspensi bahan tersebut. Cara ini dikenal sebagai Most Probable Number (jumlah mikrobia yang paling mungkin). Untuk penentuan jumlah mikrobia yang paling mungkin digunakan daftar Most Probable Number misalnya daftar HOSKINS atau daftar MC.CRADY (Jutono, 1980).

h. Berdasarkan jumlah koloni (plate count)

Cara ini yang paling umum dipakai untuk perhitungan jumlah mikrobia. Dasarnya ialah membuat suatu seri pengenceran bahan dengan keliapatan 10; dari masing-masing pengenceran diambil 1 cc dan dibuat taburan dalam petridish (pour plate) dengan medium agar yang macam dan caranya tergantung pada jenis mikrobia. Setelah diinkubasikan, dihitung jumlah koloni tiap petridish dari masingmasing pengenceran. Dari jumlah koloni dengan kebalikan pengencerannya, misalnya untuk pengenceran 1 : 10000 terdapat 45 koloni bakteri maka tiap cc atau gram bahan mengandung 450000 bakteri. Untuk membantu menghitung jumlah koloni dalam petridish dapat digunakan colony counter yang biasanya dilengkapi dengan electronic register. Pada perhitungan dengan cara ini ada beberapa syarat yang harus dipenuhi, antara lain :
Jumlah koloni tiap petridish antara 30-300 koloni, jika

memang tidak ada yang memenuhi syarat dipilih yang jumlahnya mendekati 300.

Tidak ada koloni yang menutup lebih besar dari setengah luas petridish, koloni tersebut dikenal sebagai spreader.

Perbandingan jumlah bakteri dari hasil pengenceran yang berturut-turut antara pengenceran yang lebih besar dengan pengenceran sebelumnya, jika sama atau lebih kecil dari dua hasilnya maka di rata-rata; tapi jika lebih besar dari dua yang dipakai jumlah mikrobia dari hasil pengenceran sebelumnya.

Jika dengan ulangan setelah memenuhi syarat hasilnya di ratarata (Jutono, 1980).

C. PROSEDUR KERJA 1. UJI ANGKA LEMPENG TOTAL (ALT) Alat dan Bahan a. Media Plate Count Agar (PCA) b. Buffered Pepton Water (BPW) c. Sampel uji makanan (jajan pasar dan makanan dalam kemasan pabrik) d. Pipet volume
e. Colony Counter (alat hitung koloni)

f. Cawan mortir steril g. Gelas arloji steril h. Sendok steril

Cara Kerja a. Persiapan dan Homogenisasi Makanan Membersihkan wadah/kemasan sediaan makanan dengan alkohol 70%

Melewatkan bagian yang dibuka dengan api bunsen agar tercipta suasana aseptis Sampel di-homogenisasi-kan sesuai dengan bentuk makanan ujinya (cairan, serbuk, kental, padat, beku, dikalengkan), dapat dilihat di lampiran pada buku panduan

b. Pembuatan media PCA sesuai dengan yang tertera pada

kemasan

c. Pengujian sampel Sampel uji berupa makanan dalam kemasan maupun yang tidak dalam kemasan yang bisa dihancurkan dengan menggunakan mortir steril. Timbang @ 5 gram menggunakan gelas arloji steril secara aseptis Penanganan wadah/kemasan : Wadah/kemasan makanan dibersihkan, dicuci/dilap dengan alkohol 70 %, bagian tutup/bagian yang dibuka dilewatkan di atas api dan kemudian dibuka secara aseptis

d. Homogenisasi dan Pengenceran Sampel Dengan cara aseptik timbang 5 gram atau 10 gram masingmasing sampel makanan yang telah dihaluskan dengan mortir, larutkan ke dalam 45 ml BPW atau 90 ml BPW,

kocok dengan baik dan homogen. Didapat suspensi dengan pengenceran 10-1. (Berat sampel/bahan bisa disesuaikan dengan kebutuhan). Siapkan 3 tabung reaksi masing-masing diisi dengan 9 ml BPW. Pipet 1 ml bahan yang telah dihomogenkan dalam tabung I, kocok sampai homogen. Pipet 1 ml cairan dalam tabung I ke dalam tabung II, kocok sampai homogen Pipet 1 ml cairan dari tabung II dan masukkan ke dalam tabung III, kocok sampai homogen. Dengan demikian pengenceran yang diperoleh adalah 10 -2, 10 -3, 10 -4.

e. Uji ALT Dari masing-masing hasil pengenceran bahan tersebut, pipet 1 ml dan tuangkan ke dalam 15 ml PCA yang telah dicairkan (suhu 45-55 oC). Tuangkan ke dalam cawan petri steril, goyang sampai homogen dengan cara memutar petri sedemikian rupa hingga suspensi tersebar merata (metode pour plate). Percobaan dibuat duplo.

Untuk mengetahui sterilitas media dan pengencer dibuat uji kontrol. Uji sterilitas media dilakukan dengan pembuatan kontrol kontaminasi media. Caranya : ke dalam satu cawan petri dituangkan media dan biarkan memadat. Uji kontrol pengencer dilakukan menginokulasikan larutan BPW ke dalam media PCA, biarkan memadat. Biarkan sampai memadat dan inkubasikan pada suhu kamar selama 24 jam. Amati hasil dan hitung jumlah koloni kuman yang tumbuh. dipilih cawan petri dari satu pengenceran yang menunjukkan jumlah koloni antara 25-250 koloni. Jumlah koloni rata-rata dari kedua cawan dihitung lalu dikalikan dengan faktor pengencerannya. Hasil dinyatakan sebagai Angka Lempeng Total (ALT) dalam tiap gram contoh bahan (jumlah bakteri per ml sampel : CFU/ml sampel). Cara menghitung dan menyatakan hasil ALT terlampir dalam lampiran 2. Bandingkan hasil angka ALT yang diperoleh dengan literatur tentang persyaratan ALT pada makanan yang ditetapkan berdasarkan SNI.

2. UJI ANGKA KAPANG KHAMIR (AKK)

Alat dan Bahan a. Media Malt Extract Agar (MEA) b. Buffered Pepton Water (BPW) c. Sampel uji makanan (jajan pasar dan makanan dalam kemasan pabrik) d. Kloramfenikol 100 mg/liter media Pembuatan larutan kloramfenikol : 1 gram kloramfenikol dalam 100 ml air suling steril e. Pipet volume
f. Colony Counter (alat hitung koloni)

g. Cawan mortir steril h. Gelas arloji steril i. Sendok steril

Cara Kerja a. Persiapan dan Homogenisasi Makanan Membersihkan wadah/kemasan sediaan makanan dengan alkohol 70% Melewatkan bagian yang dibuka dengan api bunsen agar tercipta suasana aseptis

Sampel di-homogenisasi-kan sesuai dengan bentuk makanan ujinya (cairan, serbuk, kental, padat, beku, dikalengkan), dapat dilihat di lampiran pada buku panduan

b. Pembuatan media MEA (Malt Extract Agar) sesuai

dengan yang tertera pada kemasan

c. Homogenisasi dan Pengenceran Sampel Perhitungan Angka Kapang Khamir (AKK) bertujuan untuk menghitung jumlah koloni kapang dan khamir yang terdapat dalam bahan. Pada prinsipnya pengujian ini menggunakan metode yang sama dengan penentuan Angka Lempeng Total (ALT). Media pertumbuhan yang digunakan adalah MEA (Malt Extract Agar)

d. Uji AKK Sebelum dicampur dengan sampel makanan, MEA ditambah dengan antibiotik kloramfenikol (MEA 100 ml ditambah 0,5 ml larutan antibiotik kloramfenikol (1 gram antibiotik dalam 100 ml air suling steril).

Metode pour plate : ambil 15 ml MEA suhu 45-50 oC dalam tabung reaksi (yang telah diinokulasi kloramfenikol) dan tambahkan 1 ml dari masing-masing hasil pengenceran sampel makanan. Tuangkan ke dalam cawan petri steril, goyang sampai homogen dengan cara memutar petri sedemikian rupa hingga suspensi tersebar merata (metode pour plate). Percobaan dibuat duplo. Seluruh cawan petri diinkubasi pada suhu 20-25oC dan diinkubasi 24-48 jam. Saat pengamatan, catat jumlah koloni jamur yang tumbuh. Koloni khamir dibedakan dari kapang karena bentuknya bulat kecil-kecil putih hampir menyerupai bakteri. Koloni kapang biasanya buram dan berbulu, koloni khamir berwarna putih dan licin (berbau asam). Lempeng agar yang diamati adalah lempeng di mana terdapat 10-150 koloni kapang/khamir. Jumlah total koloni dari kedua cawan dihitung lalu dikalikan dengan faktor pengencerannya. Hasil dinyatakan sebagai Angka Kapang Khamir (AKK) dalam tiap gram atau ml contoh bahan

Cara menghitung dan menyatakan hasil AKK terlampir dalam lampiran 2.

Bandingkan hasil angka AKK yang diperoleh dengan literatur tentang persyaratan AKK pada makanan yang ditetapkan berdasarkan SNI.