Dosage des Phnols et des Flavonodes Totaux

I. Dosage des phnols Totaux

1-Principe : Le dosage des phnols totaux se fait laide du Ractif de Folin-Ciocalteu (RFC), qui en prsence de polyphnols et en milieu alcalin se rduit en oxyde de tungstne et de molybdne donnant une couleur bleue. Les composs phnoliques ragissent en en milieu basique (pH ~ 10) avec le RFC. En effet, dans ces conditions, la dissociation d'un proton phnolique mne un anion phnolate, qui est capable de rduire le RFC par des ractions rversibles impliquant le transfert dun ou de deux lectrons. Cette raction conduit la formation despces chimiques de couleur bleue, probablement le complexe (PMoW11O40)4-. Le RFC pouvant tre rduit par beaucoup de composs non phnoliques (par exemple la vitamine C, le Cu (I), etc.)], ce ractif nest donc pas spcifique aux composs phnoliques(1). Le compos phnolique standard utilis dans cette mthode est l'acide gallique. Les teneurs des phnols totaux sont calculs laide de lquation de la courbe dtalonnage de lacide gallique. 2-Ractifs et Matriels : Une solution de lchantillon de concentration 1 mg/ml prpare dans un mlange mthanol/eau Mthanol leau ultra pure Le ractif Folin-Ciocalteu (dilu 1/10 dans de leau ultra pure) Le carbonate de sodium Na2CO3 (1M) Lacide gallique Micropipettes Tubes Bchers Portoirs

3- Mthode exprimentale : le ractif Folin-Ciocalteu (dilu 1/10 dans de leau ultra pure)

FC
Jaune

FC + Poly
Bleue

Exple : Vt =100ml et FC=1/10 Donc on met 10 ml de ractif de Folin dans un fiole de 100 ml puis on complte jusquau trait de jauge.

la solution de carbonate de sodium Na2CO3 (1M) 4ml par tube, comment On a M = 105,99g/mol et m = C*V*M ; avec M : masse molaire Exemple: on a VT=50ml, m = 1M*5010-3ml*105,99g/mol m = 5,30g dans 50ml deau ultra pure

calcule la masse(m) ?

Req : une masse de lextrait de 1 mg est dissoute dans un mlange

mthanol/eau (50:50) pour donner une concentration massique de 1 mg/ml: on doit la dissoudre tout dabord dans le mthanol ensuite dans leau. Daprs la mthode dcrite par Pourmorad et al. (2), une prise dessai de 0,5 ml dune solution mre de concentration 1 mg/ml prpare dans un mlange mthanol/eau (50:50) est mlange avec 5 ml de ractif Folin-Ciocalteu (dilu 1/10 dans de leau ultra pure) et 4 ml de carbonate de sodium Na2CO3 (1M). Le mlange est agit puis laiss pendant 15 minutes lobscurit et temprature ambiante. A la fin de la raction, la solution obtenue prsente une coloration bleue fonce dont on mesure labsorbance la longueur donde 765 nm. La teneur en phnols totaux est exprime par rapport un compos rfrence qui est lacide gallique, dont la structure est reprsente sur la figure suivante.
OH O OH HO OH

Figure1. Structure chimique de lacide Gallique

Pour cela, une gamme talon de cet acide a t ralise avec 6 niveaux de concentrations (0 ; 50 ; 100 ; 150 ; 200 ; 250 et 300 g/ml), puis la courbe dtalonnage donnant la variation de labsorbance 765 nm en fonction de la concentration a t trace. La lecture de labsorbance a t ralise laide dun spectrophotomtre UV/vis de marque JASCO srie V350. Les teneurs en phnols totaux des diffrents extraits ont t dtermines directement partir de la courbe dtalonnage (Figure 2) qui prsente un coefficient de rgression proche de 1 (r = 0.9957). [AG]g/ml Vi l VMeoh l FC Na2CO3 Exemple de calcul: On a : Ci*Vi=Cf*Vf Vi= Cf*Vf/Ci Ci = 1000 g/ml Cf = 50 g/ml Vf = 500 l Donc Vi= 25l Mme dmarche pour lextrait MeOH avec les concentrations [0, 20, 40, 60, 80, 100, 150, 200, 250 et 300 g/ml]. Les valeurs sont exprimes en mg dquivalent acide gallique par gramme de matire vgtale sche (mg EAG/g MS) ou en mg dquivalent acide gallique par gramme dextrait (mg EAG/g extrait) (3). Exemple : Lextrait mthanolique de la marjolaine prsente une teneur des phnols totaux estime 215,92 mgGAE/g ou 57,86 mgGAE/gMS. 0 0 500 50 25 475 100 * * 150 * * 5ml 4ml 200 * * 250 * * 300 * **

absorbance 765 nm 1,4 1,2 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 0,0 0 50 100 150 200 250 300 y = 0,0052x + 0,0258 R2 = 0,9957

concentration Ac.gallique(g/ml)

Figure 2. Courbe dtalonnage de lacide gallique

II. Dosage des flavonodes totaux

1-Principe : Le dosage des flavonodes totaux est bas sur un test colorimtrique utilisant le trichlorure daluminium AlCl3. En effet, il a t dmontr que ce ractif forme des complexes acides stables soit avec le carbonyle (C=O) en position C-4, soit avec le groupe hydroxyle en C3 ou C-5 des flavones et des flavonols. Par ailleurs, AlCl3 peut galement former des complexes acides labiles avec les groupements orthodihydroxyles ventuellement prsents sur le noyau A et/ou B des flavonodes. Chang et al (4) ont montr que les complexes forms par lAlCl3 avec 15 composs flavonoliques rfrences prsentent une absorption maximale des longueurs donde variant entre 415 et 440 nm. La teneur des flavonodes totaux peut tre calcule partir de lquation de la courbe dtalonnage dun flavonode pris comme rfrence. Nous avons choisi de raliser le dosage laide dun compos standard, savoir la querctine. Ce dernier appartient la classe des flavonols, son structure chimique est prsente dans la Figure 3.

Figure3. Structure chimique de la Querctine

2-Ractifs et Matriels :

 Une solution de lchantillon de concentration 1 mg/ml (prpare dans le mthanol) Mthanol leau ultra pure le trichlorure daluminium (AlCl3, 6H2O) Lactate de sodium (1M) Querctine Micropipettes Tubes Bchers 3-Mthode exprimentale : (AlCl3, 6H2O) (10%) 1mg dans 10ml deau ultra pure

lactate de sodium (1M) comment calculer la masse(m) ? = 82,03 g/mol *20 10-3 ml* 1M = 1.64g dans 20ml Les flavonodes totaux ont t dtermins suivant la mthode dcrite par Pourmorad et al

Exple : pour V= 20ml on a m = M*V*C

(2) avec quelques modifications. Ainsi 0,5 ml dune solution de concentration 1 mg/ml de lextrait on ajoute 1,5 ml de mthanol, 0,1 ml d (AlCl3, 6H2O) 10%, 0,1 ml dactate de sodium (1M) et 2,8 ml deau ultra pure. Le mlange est agit vigoureusement puis laiss pendant 30 minutes lobscurit. La lecture de labsorbance a t ralise 430 nm. La courbe dtalonnage de la querctine a t ralise dans les mmes conditions avec 6 niveaux de concentration (0, 20, 40, 60, 80,100 et 120g/ml). La courbe dtalonnage (figure 4) prsente un coefficient de rgression proche de 1 (r = 0.9967). Ce tableau prsente les tapes de prparation de la gamme talon de la querctine. (Querctine g/ml) Vi de la sol mre (l) VMeOH (l) mthanol AlCl3 Actate de sodium 0 0 500 20 10 490 40 20 480 80 40 460 1 .5 ml 0.1ml 0.1ml 100 50 450 120 60 440

Eau ultra pure

2.8ml

Les teneurs en flavonodes totaux sont exprimes en mg dquivalent querctine par gramme de matire vgtale sche (mg EQ/g MS) ou en mg dquivalent querctine par gramme dextrait (mg EQ/g extrait) Exemple : La teneur des flavonodes totaux est exprime en quivalent querctine, et a t estime 23,70 mg EQ /g ou 6,35 mg EQ/g MS dans la Marjolaine.
absorbance 430nm 1,2 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 0,0 0 20 40 60 80 100 120 concentration de la querctine (g/ml) y = 0,010x R = 0,996

Figure4. Courbe dtalonnage de la Querctine

Mesure de lactivit antioxydante

I-Activit antiradicalaire contre le DPPH 1-Principe Lactivit antiradicalaire est mesure par la dgradation du DPPH, ou le 2,2diphnyle-1-picrylhydrazyl, qui est un radical synthtique qui peut tre solubilis et stabilis dans le mthanol, donnant une coloration violette en solution et absorbant ainsi dans le domaine visible la longueur donde 515 nm (5).

Figure5. Structure chimique de la DPPH

En contact dantioxydants, la couche lectronique de ce radical est sature, (il sagit dune rduction, qui se traduit par un transfert dun atome dhydrogne sur latome dazote du radical DPPH) ce qui a pour rsultat sa dcoloration (la solution qui vire vers le jaune). Cette proprit permet de suivre la capacit de lextrait de la plante piger ce radical. Exprimentalement, la raction consiste mettre la solution de DPPH en prsence de diffrentes concentrations dun extrait susceptible davoir un effet antiradicalaire et de mesurer la capacit de ce dernier rduire le radical DPPH en DPPH-H selon la raction suivante : DPPH + AH Avec (AH) un compos antioxydant (5). DPPH-H +A

Limportance de la dcoloration, qui provoque la diminution de labsorbance 515 nm, est proportionnelle au pouvoir antiradicalaire de lextrait test. 2-Ractifs et Matriels : DPPH (0,1 mM) Extrait mthanolique du Marjolaine TROLOX BHT Mthanol Tubes Micropipettes Portoirs 3-Mthode exprimentale : Comment calculer la masse de DPPH ? Le DPPH est une poudre C= 10-4M M= 394.32g/mol La masse de DPPH : m = nombre de mole*masse molaire= n*M= C*V*M V : volume total de DPPH qui sera utilis Req : la solution de DPPH est prpare fraichement dans le MeOH dans le mme jour de la ralisation du test. Comment calculer la concentration de TROLOX (800 mol/l)? Masse de trolox= nombre de mole* masse molaire 800 mol est quivalent 800.106 mol m trolox= 800.106 * 250.29=0.200 g dans un litre pour avoir concentration molaire 800 mol/l Exemple : pour une concentration [Trolox]= 800mol/l on prend 1mg dans 5ml MeOH. Lactivit antiradicalaire de DPPH a t dtermine en se basant sur les essais dcrits par W. Binsan et al. (2008) (6), avec quelques modifications. Ainsi 1 ml de lextrait tester, on ajoute 2 ml de la solution mthanolique de DPPH de concentration 0,1 mM. Aprs agitation vigoureuse, le mlange est incub pendant 1 heure lobscurit et temprature ambiante, puis labsorbance est mesur 515 nm par un spectrophotomtre UV vis (JASCO-V530). Une

solution contenant 1 ml de mthanol et 2 ml de DPPH considre comme blanc analytique est prpare en parallle. Lestimation de lactivit antiradicalaire est exprime par la valeur du pourcentage dinhibition (%I) calcul laide de la formule suivante (7): %I = [(Abs0 Abs1)/Abs0)] x100 Avec Abs0 : absorbance du blanc analytique. Abs1 : absorbance de la solution en prsence dextrait. La courbe donnant la variation du (%I) en fonction des diffrentes concentrations de lextrait (0, 10, 20, 40, 60,80 et 100 g/ml), permet de dterminer lactivit antiradicalaire ou EC50 (Efficient Concentration 50%), dfini comme tant la quantit dextrait ncessaire pour diminuer de moiti la concentration initiale de DPPH (7). Les rsultats peuvent galement tre exprims par rapport aux molcules rfrences, le Trolox et la BHT, avec les gammes de concentrations respectives de (0, 2.5, 5, 10, 15, 20 et 25 g/ml) et (0, 15, 25, 40, 60, 80 et 100 g/ml). Ce tableau prsente les diffrentes dilutions pour lextrait MeOH et on adopte la mme dmarche pour le Trolox et le BHT. (Ext MeOH)g/ml Vi (l) VMeoh (l) VDPPH (ml) 0 0 1000 10 10 990 20 20 980 40 60 80 80 920 100 100 900

40 60 960 940 2(pour chaque tube)

absorbance (515nm) 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0,0 0 5 10 15 20 25 Concentration(ug/ml) 30 y = -0,029x + 0,749 R = 0,988

Figure6. Variation de la densit optique de DPPH en fonction des concentrations

massiques de Trolox

0,8 0,7

absorbance(51 5nm)

0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0,0 0 20 40 60 80 100 120 Concentration(Umol/l)

y = -0,007x + 0,749 R = 0,988

Figure7. Variation de la densit optique de DPPH en fonction des concentrations molaires de Trolox

% d'inihibition de DPPH 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 0 20 40 60 80 100 120 concentrations des extraits (g/ml) marjolai ne BHT

Figure 8. Pourcentage dinhibition (%) de DPPH en fonction des diffrentes

concentrations de lextrait brut de la marjolaine compare avec le BHT