FUNDAMENTOS.

ELECTROFORESIS/
Versin 0.2/ MODULO 3/ CTEDRA DE FSICA/ FFYB/ UBA/

FUNDAMENTOS-ELECTROFORESIS 0.2 / M3 / FISICA

La electroforesis es una tcnica separativa que se basa en el fenmeno de migracin diferencial que experimentan partculas cargadas elctricamente al estar bajo la influencia de un campo elctrico.

En este mdulo se estudian los fundamentos de la electroforesis y se analizan las variables, desde el punto de vista elctrico, que afectan la distancia que migra una sustancia en una corrida electrofortica. Hay distintas variantes dentro de las tcnicas electroforticas. A lo largo de la carrera, en diferentes materias, se ven y utilizan estas diversas tcnicas aplicadas a diferentes situaciones y/ o con distinto objetivo.

FUNDAMENTO

Descripcin dinmica del movimiento

Una carga elctrica inmersa en un campo elctrico experimenta una fuerza de atraccin o repulsin la Ley de Coulomb.

, como describe

Ec. 1) La carga se desplazar en el medio hacia el polo que posee carga opuesta como consecuencia de la fuerza de atraccin elctrica: las molculas cargadas positivamente se desplazarn hacia el ctodo (polo negativo) y las cargadas negativamente se desplazarn hacia el nodo (polo positivo). En un medio donde el campo elctrico es homogneo, el mdulo de la fuerza elctrica que acta sobre la carga depende tanto de la intensidad del campo elctrico generado como del valor de la carga en estudio.

Ec. 2) (Ver Tericos de Electricidad y Campos)

Ctedra de Fsica-FFYB-UBA [2]

FUNDAMENTOS-ELECTROFORESIS 0.2 / M3 / FISICA

Figura 1: Cargas en un campo elctrico homogneo. Las cargas experimentan una fuerza elctrica con sentido hacia el polo de carga opuesta. : vector campo elctrico; : vector fuerza elctrica; + : polo positivo, nodo; - : polo negativo, ctodo.

En un primer instante, esa fuerza elctrica imprime a la molcula una aceleracin inicial y como resultado la misma comienza a moverse. Como describe la segunda ley de Newton la relacin entre la fuerza y la aceleracin es:

Ec. 3) Sin embargo, cuando la partcula se encuentra en un fluido (en el caso de la electroforesis, este medio corresponde al buffer de corrida) su movimiento est tambin determinado por la fuerza de rozamiento, ya que el fluido en el que se mueve la partcula se opone a su movimiento. Aparece entonces sobre ella dicha fuerza de rozamiento, que es proporcional a su velocidad y que tiene igual direccin pero sentido opuesto a la fuerza elctrica.

(Ec. 4) Siendo k, el coeficiente de proporcionalidad o coeficiente de friccin, en el cual estn incluidas variables como la viscosidad del medio, el tamao y la forma de la partcula. La fuerza de rozamiento depender entonces de estas tres variables , adems de la velocidad que presente la misma.

Si consideramos una partcula esfrica, y en condiciones que se cumpla la Ley de Stokes (Ver mdulo II: Viscosidad), la expresin para la fuerza de rozamiento puede escribirse como:

(Ec. 5) Siendo : la viscosidad del medio a la temperatura de trabajo; r y respectivamente.

Ctedra de Fsica-FFYB-UBA [3]

el radio y la velocidad de la partcula

FUNDAMENTOS-ELECTROFORESIS 0.2 / M3 / FISICA

Apenas la molcula comienza a moverse en el solvente a causa de la fuerza elctrica, aparece la fuerza de rozamiento que se opone al movimiento y por lo tanto su aceleracin inicial disminuye, ya que la fuerza neta que acta sobre la partcula ser entonces la resultante de ambas fuerzas, igual a la diferencia entre y . Esta resultante ser la que

determinar su migracin en el medio de corrida. Sin embargo, la fuerza de rozamiento no es constante, ya que se incrementa a medida que aumenta la velocidad de la partcula (Ec. 4).

Figura 2: Fuerzas involucradas en el movimiento de una partcula cuando est inmersa en un medio donde existe un campo elctrico. : vector campo elctrico; : vector fuerza elctrica; : vector fuerza de rozamiento. Las flechas representan la direccin y sentido de los vectores y en cada caso las longitudes de los vectores fuerza son proporcionales a sus respectivos mdulos.

Llega un momento en que la fuerza de rozamiento adquiere la misma intensidad que la fuerza elctrica. Como ambas fuerzas tienen igual direccin pero sentidos contrarios, su sumatoria sobre la partcula ser igual a cero.

Figura 3: Situacin de equilibrio en una partcula cargada inmersa en un medio donde hay un campo elctrico uniforme. El mdulo de la fuerza elctrica resulta igual al de la fuerza de rozamiento, , por lo que la sumatoria de fuerzas en el equilibrio es igual a cero. e es la fuerza elctrica, es la fuerza de rozamiento y , vector campo elctrico.

En consecuencia, a partir de este momento, la partcula no estar afectada por aceleracin alguna y se mover a velocidad constante siendo esta velocidad la mxima que alcanza en el seno del fluido. Dado que esta situacin se alcanza a los pocos segundos, se puede asumir que la velocidad es constante durante todo el desplazamiento. Por lo tanto, a fines prcticos y de simplificar nuestro razonamiento matemtico, este ser el anlisis de fuerzas que consideraremos para determinar la velocidad.
Ctedra de Fsica-FFYB-UBA [4]

FUNDAMENTOS-ELECTROFORESIS 0.2 / M3 / FISICA

(Ver mdulo II: Viscosidad - Mtodo de Stokes)

Variables que determinan la velocidad de movimiento

La migracin de una partcula en un medio sometido a un campo elctrico depende de la velocidad que adquiere en l. Pensemos, entonces, qu variables inherentes al sistema afectan a dicha velocidad.

Por lo dicho en el apartado anterior, puede considerarse que en todo el desplazamiento se cumple que la sumatoria de fuerzas sobre la partcula es igual a cero por lo que est en equilibrio,

(Ec. 6) Dado que el campo elctrico es homogneo se cumple la Ec. 2), y como rozamiento es proporcional a la velocidad, por lo tanto: , indica que la fuerza de

(Ec. 7)

En una primera aproximacin, se deduce fcilmente de la (Ec. 7) que la velocidad que adquiere una partcula cargada elctricamente cuando est en un campo elctrico depende de la partcula - su carga, tamao y forma- la viscosidad del medio y la intensidad del campo elctrico aplicado. Sin embargo, debemos considerar algunos aspectos ms que inciden en el movimiento de las partculas: fuerza inica, el pH, la temperatura y la difusin natural. La fuerza inica y el pH afectan la velocidad en que se desplaza una partcula porque modifican la carga neta sobre la misma. La fuerza inica es una medida de las cargas en una solucin, estima la actividad de los electrolitos en solucin segn su carga y concentracin. Una mayor fuerza inica, da cuenta de una mayor concentracin de iones en la solucin. (Para

Ctedra de Fsica-FFYB-UBA [5]

FUNDAMENTOS-ELECTROFORESIS 0.2 / M3 / FISICA

ms informacin sobre fuerza inica consultar: Chang, Qumica General, McGrawHill Skoog-West, Fundamentos de qumica analtica, Espaa, McGrawHill, 1995). Una partcula con carga cuando se halla en solucin est rodeada por electrolitos de carga opuesta como consecuencia de la accin de la fuerza de atraccin electroesttica. Es as que, una carga positiva en solucin estar rodeada de cargas negativas y una negativa por carga positivas. Esta esfera de cargas en el entorno depender a su vez del nmero y tipo de cagas disueltas en la solucin (fuerza inica). En el caso de la electroforesis la presencia de electrolitos en el entorno tiende a contrarrestar la migracin de la partcula en estudio, puesto que tienden a moverse en sentido opuesto. Por ello, la velocidad que alcanza la partcula en un medio con muchos electrolitos ser inferior a la que alcanzara en un entorno con menor nmero de cargas. Se puede pensar como un apantallamiento de la carga neta de la partcula como consecuencia de los contraiones que la rodean.

Figura 4: Efecto de la fuerza inica sobre la migracin de una partcula cargada en solucin. Una mayor fuerza inica determina una menor velocidad de migracin, ya que la partcula debe contrarrestar la tendencia a moverse en sentido opuesto de sus contra-iones. En cambio cuando la concentracin de cargas es menor, la partcula presenta mayor libertad para desplazarse en el medio. , vector velocidad, en cada caso la longitud de es proporcional al mdulo. , vector campo elctrico, la flecha mayor indica la direccin y sentido del mismo.

El pH influye sobre la carga que adquieren los grupos cidos y bsicos presentes en las molculas. Las molculas biolgicas suelen presentar grupos con caractersticas de cido o de base dbil. Por lo tanto, se ionizan parcialmente en solucin coexistiendo en equilibrio distintas especies. Se ejemplifica a continuacin su equilibrio de ionizacin:

Ctedra de Fsica-FFYB-UBA [6]

FUNDAMENTOS-ELECTROFORESIS 0.2 / M3 / FISICA

Figura 5: Equilibrio de ionizacin en agua de cidos y bases dbiles.

El grado de ionizacin de los distintos grupos funcionales est en relacin con el pH del medio en que se encuentran, puesto que las especies H3O+ y OH- forman parte de la situacin de equilibrio. Por lo tanto, de acuerdo con las condiciones de pH en la situacin de equilibrio, el grupo presente en la molcula se encontrar ionizado en menor o mayor proporcin. Existen situaciones extremas donde el equilibrio se haya totalmente desplazado en un sentido, por ejemplo: bajo condiciones de pH muy altas (baja concentracin de H3O+) los cidos dbiles se consideran totalmente ionizados, por lo que el grupo funcional siempre presentar carga elctrica. Lo mismo ocurre con las bases a valores de pH muy bajos. En otras situaciones de equilibrio coexistirn en la solucin especies de la misma molcula con distinta carga, consecuencia del valor de pH del medio en el que se encuentra. (Ver ANEXO: Equilibrio Inico Aminocidos) La temperatura afecta la velocidad con la que se desplaza la partcula por incidir en tres instancias especficas. En primer lugar la viscosidad del buffer es una constante fsica que depende de la temperatura, por ende el coeficiente de friccin variar segn cul sea el valor de la viscosidad del medio a la temperatura de trabajo. En segundo lugar, la energa cintica intrnseca de las molculas, que determina el fenmeno de la difusin, est en directa relacin con la temperatura. Por ltimo, puede ocurrir evaporacin del buffer alterando su fuerza inica. (Ver en esta gua Efecto Joule) Entonces, bajo iguales condiciones de corrida (igual buffer de corrida -fuerza inica, pH y viscosidad-, igual campo elctrico, igual temperatura), partculas que difieran en carga, tamao y/o forma migrarn a distinta velocidad, y por ende recorrern distinta distancia durante un mismo perodo de tiempo. Este es el fenmeno fsico en que se fundamenta la tcnica separativa denominada electroforesis.

A fines comparativos trabajaremos entonces manteniendo constantes pH, fuerza inica y viscosidad del buffer y la temperatura. Ahora bien, la velocidad de la partcula tambin depende del campo aplicado, por lo que debemos
Ctedra de Fsica-FFYB-UBA [7]

FUNDAMENTOS-ELECTROFORESIS 0.2 / M3 / FISICA

independizarnos del mismo. Para ello utilizaremos el concepto de movilidad electrofortica en lugar de la velocidad de la partcula.

Movilidad electrofortica ()

La movilidad electrofortica, , se define para una molcula cargada como el cociente entre la velocidad de la misma y el campo elctrico aplicado. Es la velocidad que adquiere la partcula por unidad de campo elctrico aplicado.

(Ec. 8) En el equilibrio, donde se cumple la (Ec. 7) , la movilidad puede escribirse como:

(Ec. 9) De esta ecuacin puede deducirse que es posible identificar sustancias de acuerdo a su movilidad electrofortica. En la (Ec. 9) queda de manifiesto que la movilidad electrofortica depende de la carga de la partcula y del coeficiente de friccin. Como ya vimos, ste depende de la forma y el tamao de la partcula, y de la viscosidad del medio. En cuanto a la carga, es una caracterstica inherente a la molcula pero que se encuentra afectada por la fuerza inica y el pH de buffer en que se realiza la corrida (Ver ANEXO: Equilibrio de Ionizacin - Aminocidos). Como se explic en el apartado Descripcin dinmica del movimiento, la velocidad adquirida tambin depende de la intensidad del campo elctrico aplicado. En las ecuaciones anteriores -(Ec. 9)-, velocidad y campo elctrico son variables interrelacionadas, siendo constante la movilidad () de la sustancia en el sistema en estudio. Es decir, la movilidad NO depende del campo elctrico aplicado.

Ctedra de Fsica-FFYB-UBA [8]

FUNDAMENTOS-ELECTROFORESIS 0.2 / M3 / FISICA

Por lo tanto, la movilidad electrofortica es una constante fsica propia de una sustancia pero que est en ntima relacin con las condiciones de trabajo seleccionadas. Es as que no slo depende de la partcula -carga, tamao y formasino tambin de las condiciones del entorno viscosidad, pH, fuerza inica, temperatura-.

Resumiendo, podemos decir que la movilidad es una constante fsica para una sustancia si se mantienen constantes el medio (pH, fuerza inica, viscosidad) y la temperatura.

EL EQUIPO DE ELECTROFORESIS

El equipo de electroforesis consta de una cuba electrofortica y una fuente de poder (ver Figura 6).

La cuba electrofortica tiene dos reservorios, uno a cada lado, donde se alberga el buffer. Cada uno de estos compartimentos contiene un electrodo sumergido en el buffer y conectado por el otro lado a travs de un cable a la fuente de poder. Los tabiques de los reservorios, o algn otro dispositivo segn su diseo, permiten montar un soporte donde se siembran las muestras. Este soporte est embebido en buffer y pesca a cada lado en el buffer de los reservorios, cerrando el circuito elctrico. Esto es posible gracias a que el buffer es una solucin inica, por lo que conduce la corriente cuando se enciende la fuente de poder. El soporte se ubica en la cuba antes de sembrar la muestra, y se deja estabilizar el sistema tapando la cuba con la fuente encendida, para saturar la atmsfera en que se realizar la corrida y minimizar los efectos por difusin del buffer.

Ctedra de Fsica-FFYB-UBA [9]

FUNDAMENTOS-ELECTROFORESIS 0.2 / M3 / FISICA

(Ver Gua de Trabajos Prcticos y la siguiente figura)

Figura 6: Equipo para electroforesis, abajo se muestra un esquema simplificado. La fuente de poder en encuentra conectada con los electrodos. Al ser encendida se establece una diferencia de potencial entre los mismos, comenzando la circulacin de corriente a travs del sistema. En la tira de papel se siembra la muestra cuyas partculas cargadas se movern de acuerdo a los principios ya explicados hacia el polo de carga opuesta.

El soporte tiene por funcin contener a las muestras, constituyendo un medio de sostn para las mismas pero es importante tener en cuenta que los componentes de las muestras no se encuentran adheridos al soporte, sino que estn inmersos en el buffer de corrida y cuando migran lo hacen en el buffer contenido en los poros del soporte. Adems,

Ctedra de Fsica-FFYB-UBA [10]

FUNDAMENTOS-ELECTROFORESIS 0.2 / M3 / FISICA

segn los casos, el soporte puede generar algn impedimento al movimiento libre de los componentes de la muestra, tal que se minimice la difusin al azar. Existen distintos tipos de soportes (papel, acetato de celulosa, geles poliacrilamida, agar y sus productos de purificacin: agarosas con distinto grado de pureza) que se usarn en distintas aplicaciones. En el caso de nuestro trabajo prctico se usan tiras de papel como soporte El soporte acta como una resistencia, por lo tanto, desde el punto de vista elctrico, el equipo de electroforesis es un circuito simple como se muestra en la siguiente figura:

FEM ()

Figura 7: Circuito electrofortico. La fuente de poder, FEM, est conectada a dos electrodos, a y b, en contacto a travs del buffer con el soporte que acta como una resistencia. La flecha indica el sentido convencional de circulacin de la corriente elctrica en el sistema. I: intensidad de corriente elctrica; R: resistencia (soporte); FEM: fuerza electromotriz (fuente de poder).

Los puntos, a y b ver Figura -, indicados son los electrodos entre los que se establece una diferencia de potencial, entre ellos se encuentra la resistencia que en el sistema electrofortico incluye al soporte embebido en buffer Vea y compare Figura y la Figura . Dado que el buffer es una solucin de alta conductividad elctrica, puede considerarse que el soporte aporta la mayor parte de la resistencia del sistema, en muestro trabajo prctico la tira de papel. Obsrvese que la conductividad de una solucin (el buffer en el caso de la electroforesis) est en relacin directa con la concentracin de electrolitos en la misma y estos determinan a su vez la fuerza inica.

Es notable la importancia que reviste colocar correctamente la tira en la cuba, tal que sus extremos se hallen inmersos en el buffer, de otra forma el circuito estara abierto. Para pensar

Despus de realizar una corrida de rutina con una muestra conocida se observa que la muestra no corri. Se sabe que se trabaj en condiciones de corrida controladas, y se conoce el comportamiento de la muestra. cmo se podra explicar lo sucedido?
Ctedra de Fsica-FFYB-UBA [11]

FUNDAMENTOS-ELECTROFORESIS 0.2 / M3 / FISICA

Si ocurriera una prdida de buffer por debajo de los tabiques de la cuba y el buffer de los compartimientos entrara en contacto, qu ocurrir con el sistema electrofortico? Cmo resultara una corrida en estas condiciones? Por tratarse de un circuito elctrico est regido por las mismas leyes que los circuitos tratados en Electricidad. El enunciado de la Ley de Ohm postula que la corriente que fluye a travs de un conductor es proporcional a la fuerza electromotriz aplicada entre sus extremos, donde la resistencia es la constante de proporcionalidad involucrada. Entonces, siempre y cuando la temperatura y dems condiciones se mantengan constantes, se cumplir:

(Ec. 10) V: diferencia de potencial, fuerza electromotriz o voltaje; i intensidad de corriente elctrica; R: resistencia.

Repasando conceptos de electricidad te proponemos pienses las siguientes situaciones

Es posible realizar la corrida de tres tiras en simultneo? En caso de que fuera as, cmo sera el esquema del circuito elctrico?

Qu ocurre con la intensidad total del circuito y con la intensidad que pasa por cada tira si se las compara con el circuito elctrico de la corrida cuando se utiliza una sola tira?

Existen en el mercado distintos modelos de fuentes de poder: las ms sencillas trabajan a voltaje constante y nico; luego, las ms comunes, tambin mantienen el voltaje constante pero es posible asignar distintos valores de voltaje a cada corrida en particular dentro de un rango establecido; y por ltimo, las ms sofisticadas, permiten trabajar a voltaje constante o a intensidad constante (incluso a potencia constante), dentro de un amplio rango de valores.

A continuacin se muestra como ejemplo el circuito elctrico de un equipo de electroforesis de voltaje variable

Ctedra de Fsica-FFYB-UBA [12]

FUNDAMENTOS-ELECTROFORESIS 0.2 / M3 / FISICA

Figura 8: Esquema que ejemplifica el funcionamiento de una fuente de poder de voltaje variable conectado a una cuba electrofortica. El transformador y el rectificador de la fuente transforman la corriente alterna en continua y el potencimetro permite variar la diferencia de potencial de salida y por ende entre los electrodos de la cuba. Ver Electricidad. A: ampermetro; V: voltmetro; C.A.: corriente alterna; C.C.: corriente continua.

DETERMINACIN DE LA MOVILIDAD ELECTROFORTICA

Expresin de la movilidad en trminos de variables controlables en la corrida

La movilidad electrofortica depende de los parmetros ya mencionados (caractersticas de la partcula y del medio en que est inmersa) pero puede escribirse tambin en relacin a las variables experimentales que se controlan durante la corrida en el equipo electrofortico. Analicemos el esquema de una corrida electrofortica en la que se utiliza la tcnica de electroforesis de zona, es decir la realizada sobre un soporte de papel, acetato de celulosa, geles de diferente composicin, polmeros de acrilamida, etc.

Ctedra de Fsica-FFYB-UBA [13]

FUNDAMENTOS-ELECTROFORESIS 0.2 / M3 / FISICA

Observamos que en l una especie qumica se desplaz una distancia d, durante un tiempo t, en un soporte electrofortico de longitud L, entre cuyos extremos (a y b) se aplic una diferencia de potencial Vab.

Figura 9: Ejemplo de una corrida electrofortica de una sustancia en un medio soporte (electroforesis de zona) .ejemplifica Se muestra una tira de papel, donde se estableci una diferencia de potencial entre los puntos a y b (Vab). L: longitud del soporte. Vector campo elctrico. D: distancia corrida por la muestra. nodo. + ctodo. La flecha de mayor grosor indica el sentido del campo elctrico.

Vimos que la movilidad es la constante de proporcionalidad que relaciona la velocidad de una partcula con el campo elctrico aplicado,

(Ec. 8) Dado que:

(Ec. 11) Y que:

Como en el caso de la electroforesis puede considerarse el campo elctrico homogneo en la longitud del soporte (L):

(Ec. 12) Donde V es el voltaje dado por la fuente de poder. (Ver Tericos de Electricidad y Campos)
Ctedra de Fsica-FFYB-UBA [14]

FUNDAMENTOS-ELECTROFORESIS 0.2 / M3 / FISICA

Podemos escribir entonces, la movilidad electrofortica en (Ec. 12), como:

(Ec. 13) Considerando que la diferencia de potencial est en relacin con la corriente circulante en la tira (Ley de Ohm) tambin puede escribirse:

(Ec. 14)

Esta expresin permite determinar la de una sustancia a partir de la distancia corrida por la misma y determinadas variables asignadas en el momento de la corrida como ser el voltaje aplicado, la longitud del soporte utilizado y el tiempo de corrida.

Sin embargo, la movilidad electrofortica es independiente de todas estas condiciones experimentales. Por qu? Experimentalmente se demuestra (Ud. lo har en el TP) que si se vara una de ellas, variar la distancia corrida por la muestra pero la movilidad permanecer constante, dado que es una caracterstica propia de la sustancia en un determinado medio. Si consideramos una de dichas variables experimentales, por ejemplo, la longitud L del soporte de corrida, y variamos su valor (para este caso, para un mismo Vab y tiempo de corrida), vara la velocidad de la partcula (ya que vara el campo elctrico aplicado) y por lo tanto variar la distancia recorrida por ella en el tiempo estipulado, dado que permanece constante. (Ver Gua de Trabajos Prcticos)

Esta tcnica puede utilizarse con fines analticos o preparativos segn cul sea el objetivo perseguido: la identificacin de sustancias o su separacin cuando forma parte de una mezcla. Asimismo, segn el diseo experimental puede utilizarse para determinar pesos moleculares, cuantificar sustancias, etc. En todos los casos es necesario aplicar las condiciones correctas para obtener una buena resolucin de los componentes a analizar y/o separar. Se llama resolucin a la capacidad de un sistema de distinguir como diferentes la distancia recorrida por dos sustancias distintas en las mismas condiciones de corrida. En las corridas electroforticas, entre otras cosas, la eleccin del voltaje, de soportes adecuados y el tiempo de la corrida son los parmetros experimentales que deben contemplarse para obtener una buena resolucin.
Ctedra de Fsica-FFYB-UBA [15]

FUNDAMENTOS-ELECTROFORESIS 0.2 / M3 / FISICA

(Ver tambin en esta gua Otras consideraciones sobre las condiciones de corrida)

PUNTO ISOELCTRICO (pI) Qu es y cmo se determina?

El punto isoelctrico, pI, es el pH en el cual la carga neta de la molcula es nula, es decir el pH que corresponde a movilidad electrofortica (,) igual a cero.

Cmosedeterminaexperimentalmenteel pI? Se realizan corridas electroforticas de la sustancia en estudio utilizando soluciones buffer de igual fuerza inica pero diferentes valores de pH. En todos los casos se calcula la movilidad electrofortica y se grafica en funcin del pH. Se obtendr un grfico como el que se muestra a continuacin.

Ctedra de Fsica-FFYB-UBA [16]

FUNDAMENTOS-ELECTROFORESIS 0.2 / M3 / FISICA

Figura 10: Grfico de movilidad electrofortica en funcin del pH de la corrida. As como en el apartado anterior, por convencin la distancia hacia al nodo, polo positivo, se considera positiva por lo que la movilidad resulta positiva. En oposicin, son negativas la distancia y la movilidad al ctodo o polo negativo.

En el grfico por interpolacin se determina el pH correspondiente a una movilidad igual a cero (punto en que la curva intercepta el eje de las abscisas). se valor ser el pI.

Dada la relacin que existe entre la distancia corrida y la movilidad electrofortica, puede realizarse el grfico distancia en funcin del pH del buffer de corrida para la determinacin de la movilidad electrofortica, tomando siempre la precaucin de mantener constantes el resto de las condiciones cuando se realizan las corridas a distintos pH, para as mantener la proporcionalidad entre movilidad electrofortica y distancia recorrida.

Ctedra de Fsica-FFYB-UBA [17]

FUNDAMENTOS-ELECTROFORESIS 0.2 / M3 / FISICA

(Ec. 13)

(Ec. 155)

donde :

Se deduce de lo anterior que los grficos de movilidad electrofortica en funcin del pH de corrida y distancia en funcin del pH de corrida son proporcionales entre s. De qu depende la proporcionalidad? Qu condiciones deben cumplirse para que dos grficos de: d (distancia al punto de siembra) = f (pH) del buffer sean comparables?

OTRAS CONSIDERACIONES ACERCA DE LAS VARIABLES DE CORRIDA

Incidencia del soporte en la corrida electrofortica: Efecto electroendosmtico Como se mencion anteriormente el soporte presenta entre sus funciones principales, oponer algn tipo de resistencia a la libre difusin de la muestra, lo cual favorece la separacin de los distintos componentes de la muestra de acuerdo a los principios que rigen esta tcnica.

Qu es el efecto electroendosmtico? En algunos soportes (por ejemplo: el papel), de acuerdo a cules sean las condiciones de corrida, se presenta lo que se denomina electroendsmosis o efecto electroendosmtico. Estos soportes poseen en su composicin grupos qumicos que pueden presentar propiedades cidas o bsicas. Los mismos pueden hallarse ionizados en determinadas condiciones de pH adquiriendo carga. Se produce, entonces, un efecto de polarizacin de las cargas del buffer que est en contacto con el soporte. Por ejemplo, en el caso del papel los grupos carboxilos a pH cercanos o mayores a su pKa estarn ionizados (forma de carboxilatos) por lo que presentan una carga neta negativa. Los contra-iones positivos que neutralizan dichas cargas estarn libres de moverse junto con el buffer por
Ctedra de Fsica-FFYB-UBA [18]

FUNDAMENTOS-ELECTROFORESIS 0.2 / M3 / FISICA

lo que el buffer en contacto directo con el soporte presentar una carga neta positiva debido a la polarizacin de la solucin.

Figura 11: Efecto electroendosmtico. En A) se ejemplifica a la izquierda la polarizacin de la solucin al encontrarse ionizado el soporte. Los iones con carga positiva, cationes, se disponen en el entorno de los aniones que se encuentran sujetos al papel. Al aplicarse una diferencia de potencial, se producir la migracin de los cationes hacia el ctodo, arrastrando consigo su esfera de hidratacin. Los aniones estn fijos al papel por lo que no migrarn.

Cuando se aplica una fuerza electromotriz al sistema, los iones positivos se mueven hacia el ctodo arrastrando consigo su esfera de solvatacin. Por ende existe un flujo neto de la solucin que se transmite a todas las molculas arrastrndolas hacia el ctodo. En consecuencia la migracin de cualquier sustancia presente en el soporte se ver favorecida hacia el ctodo independientemente de cul sea su carga. (Ver en esta gua Flujo electroendosmtico: correccin)

El efecto electroendosmtico depende del pH, debido a que, como se mencion anteriormente, se produce como consecuencia de la ionizacin de sus grupos funcionales. En el papel este efecto es significativo bajo condiciones de pH superiores a 4.

Ctedra de Fsica-FFYB-UBA [19]

FUNDAMENTOS-ELECTROFORESIS 0.2 / M3 / FISICA

Figura12: Grfico que muestra la variacin de flujo electroendosmtico en funcin del pH de corrida utilizando tiras de papel como soporte. Se grafic el porcentaje del efecto electroendosmtico respecto del mximo evaluando la distancia corrida por un testigo neutro, y relativizando la distancia a la mxima que corri.

Correccin del error por flujo electroendosmtico

Dado que el flujo electroendosmtico modifica la verdadera distancia corrida por las molculas, para la determinacin apropiada de la movilidad de la sustancia en estudio es necesario corregir los efectos de este fenmeno. El flujo electroendosmtico se corrige empleando un testigo electroforticamente neutro, es decir que su carga elctrica sea nula a cualquier pH, o al menos, en el pH de la corrida (Ver Punto isoelctrico). Este testigo debe adems cumplir con otras condiciones: tener forma y tamao molecular semejante a la sustancia cuya movilidad se desea determinar, no ser absorbido por el soporte utilizado,

no formar complejos con los iones de la solucin, Por ejemplo: la glucosa y el dextrano pueden utilizarse como testigos neutros para corregir movilidades electroforticas de sustancias de bajo y alto peso molecular respectivamente.

Veamos cmo corregir la distancia recorrida por una sustancia cargada en un soporte que posee flujo electroendosmtico en dos casos puntuales: 1. La muestra y el flujo electroendosmtico se mueven en el mismo sentido. 2. La muestra y el flujo electroendosmtico se mueven en sentidos opuestos

Ctedra de Fsica-FFYB-UBA [20]

FUNDAMENTOS-ELECTROFORESIS 0.2 / M3 / FISICA

En todos los casos el testigo neutro es arrastrado en el mismo sentido en que se mueve el flujo electroendosmtico (hacia el ctodo). El anlisis de los casos lo haremos por comparacin de las distancias corridas por la muestra y el testigo neutro. Tabla A : Referencias Especie qumica electroforticamente activa Testigo electroforticamente neutro deeo dM Distancia corrida por el testigo neutro, con su respectivo signo. Distancia corrida experimentalmente por la especie qumica electroforticamente activa en presencia de efecto electroendosmtico, con su respectivo signo. dMC Distancia corrida por la especie qumica electroforticamente activa corregida, o sea en ausencia de efecto electroendosmtico. El signo resultante indica hacia que polo migra

Caso 1: la muestra se mueve una distancia mayor hacia el ctodo que la que debera porque es ayudada por el flujo electroendosmtico. La distancia recorrida en ausencia de efecto electroendosmtico hubiera sido menor.

Figura 13.a. La muestra y el flujo electroendosmtico se mueven en el mismo sentido. En este caso la distancia de la muestra una vez corregida es menor que la que se mide experimentalmente. Ctodo y nodo se representan con sus correspondientes signos, y + respectivamente. La lnea de puntos indica la lnea de siembra. La flecha correspondiente a d MC presenta el sentido en que se hubiera desplazado la muestra y la longitud de la flecha la distancia que hubiese corrido desde el punto de siembra si no hubiera efecto electroendosmtico.

Caso 2: El flujo al moverse en sentido opuesto a la muestra retrasa su movimiento y por ende la muestra corre una menor distancia. En este caso se pueden dar dos situaciones: (A) que se al finalizar la corrida observe que la sustancia corri hacia el polo opuesto al que corri el testigo neutro, o (B) que al finalizar la corrida se observe que la sustancia corri hacia el mismo lado que el testigo neutro pero menor distancia que l, o sea que fue tan grande el efecto del flujo que la distancia corrida por la muestra fue en sentido opuesto al esperado
Ctedra de Fsica-FFYB-UBA [21]

FUNDAMENTOS-ELECTROFORESIS 0.2 / M3 / FISICA

(A) la distancia que corre la muestra es menor que la que tendra en ausencia de efecto electroendosmtico

Figura 6 La muestra corre en sentido opuesto al testigo neutro. En este caso la muestra hubiera migrado una mayor distancia en ausencia de efesto electroendosmtico, por ello dMC es mayor que dM. Ctodo y nodo se representan con sus correspondientes signos, - y +, respectivamente. La lnea de puntos indica la lnea de siembra. La flecha correspondiente a d MC presenta el sentido en que se hubiera desplazado la muestra y la longitud indica la distancia que hubiese corrido desde el punto de siembra si no hubiera efecto electroendosmtico.

(B) La muestra termina corriendo hacia el ctodo porque la magnitud del efecto electroendosmtico supera la distancia que correra la muestra hacia el nodo si no existiera efecto del flujo.

Figura 13.c. El efecto electroendosmtico es superior a la migracin de la muestra. En este caso d M presenta un sentido opuesto al que presentara la muestra si no existiera efecto electroendosmtico. Por ello, d MC tiene sentido opuesto y sera inferior a deeo, es as que es posible invertir el sentido de la migracin. Ctodo y nodo se representan con sus signos correspondientes, - y + respectivamente. La lnea de puntos indica la lnea de siembra. La flecha correspondiente a d MC presenta el sentido en que se hubiera desplazado la muestra y la longitud indica la distancia que hubiese corrido desde el punto de siembra si no hubiera efecto electroendosmtico.

Utilizando como convencin que las distancias al nodo, polo positivo, se consideran positivas, y las distancias al ctodo, polo negativo, se consideran negativas respecto de la lnea de siembra es posible calcular la distancia corrida por la muestra corregida, mediante la siguiente ecuacin:

(Ec. 16)

Ctedra de Fsica-FFYB-UBA [22]

FUNDAMENTOS-ELECTROFORESIS 0.2 / M3 / FISICA

Ntese que dMC presentar un signo compatible con el polo al que migrar la muestra. En consecuencia la movilidad calculada basado en este criterio siempre presenta el signo del polo al que migra la muestra. Hasta aqu se present una de las formas para corregirlo, existen otras con las que se arriba a los mismos resultados.

Error que se introduce en la determinacin del punto isoelctrico debido al flujo electroendosmtico

Hemos definido el punto isoelctrico de una sustancia como aquel pH en que la movilidad electrofortica es igual a cero. En trminos de lo explicado recientemente, se puede establecer una relacin de proporcionalidad directa entre la movilidad electrofortica y la distancia recorrida por una sustancia, podramos entonces concebir la idea de determinar el pI como el pH en que la sustancia electroforticamente activa corre una distancia nula.

En trminos de lo que se ha explicado del efecto electroendosmtico sabemos que la distancia corrida est alterada como consecuencia del flujo hacia el ctodo. Por ello, para la determinacin del pI debe contemplarse la correccin de la distancia por el efecto electroendosmtico (Ver Flujo electroendosmtico: correccin). En trminos experimentales, el pI corresponder al pH en que la sustancia en estudio migre igual que el testigo neutro ya que este se mueve slo por accin del efecto electroendosmtico. Es posible, tambin, construir la curva de distancia recorrida -corregida punto a punto- en funcin del pH de la corrida y determinar el pI de la misma forma en que se indic anteriormente.

Ctedra de Fsica-FFYB-UBA [23]

FUNDAMENTOS-ELECTROFORESIS 0.2 / M3 / FISICA

Figura14: Efecto del flujo electroendosmtico en la determinacin del pI. Ntese que la curva corregida resulta de la diferencia punto a punto entre las curvas de la muestra y del testigo. Se manifiesta que el efecto electroendosmtico en este soporte incide recin a pH mayor a 4, y es constante despus de pH =10 (Ver Figura 12). Por convencin se considera positiva la distancia al nodo, polo positivo, y negativa la distancia al ctodo, polo negativo, respecto del punto de siembra.

Efecto Joule

En todo circuito elctrico, el movimiento de cargas a travs de la resistencia supone un trabajo que involucra una prdida de energa. Esta prdida de energa por unidad de tiempo, es la potencia disipada en la resistencia y en el caso la electroforesis es el calor disipado en el soporte. (Efecto joule)

(Ec. 177)

(Ec. 188)

Ctedra de Fsica-FFYB-UBA [24]

FUNDAMENTOS-ELECTROFORESIS 0.2 / M3 / FISICA

Se observa que la disipacin de energa es proporcional al cuadrado de la intensidad de corriente elctrica circulante. Cuando se trabaja a voltajes elevados la disipacin de energa es muy alta, elevando la temperatura del sistema. La temperatura es una de las variables que afectan la velocidad con la que se mueve una partcula (Ver Fundamento: Variables que determinan la velocidad de movimiento). Por ello, para controlarla, los equipos que trabajan con altos voltajes poseen algn sistema de refrigeracin del soporte. Como se mencion (Ver El equipo de electroforesis), las corridas electroforticas pueden realizarse a voltaje o a intensidad constante, si se dispone de una fuente de poder que lo permita. Si durante la corrida la resistencia del soporte se mantuviera constante, cualquiera de las dos que fijemos (voltaje o intensidad), la otra tambin se mantendr constante (Ec. 190) y dara lo mismo fijar una u otra. Ahora bien, en la prctica esto no sucede. A medida que transcurre la corrida electrofortica, la resistencia del soporte (papel o acetato de celulosa) va disminuyendo debido a que se impregnan con buffer los poros del mismo y aumenta la conductividad (recordar que conductividad y resistividad estn en relacin inversa). Si graficamos resistencia en funcin del tiempo de corrida se obtiene:

Figura 75: Grfico de resistencia del soporte en funcin del tiempo de corrida.

En este grfico podemos distinguir dos regiones segn el tiempo de corrida sea corto o largo. A tiempos cortos se produce una modificacin rpida de la resistencia del sistema. Trabajar con tiempos de corrida largos no tendra mayores inconvenientes, ya que la resistencia del soporte se mantiene casi constante, pero pasar por la primera etapa es inevitable y adems en muchos casos los tiempos de corrida empleados comnmente caen en la primer zona.

Qu pasa entonces durante la corrida cuando trabajamos a voltaje constante? Y cuando lo hacemos a intensidad constante? Cul es la incidencia de la eleccin de una u otra condicin en el resultado de la corrida electrofortica?

Ctedra de Fsica-FFYB-UBA [25]

FUNDAMENTOS-ELECTROFORESIS 0.2 / M3 / FISICA

Si se trabaja en condiciones de voltaje constante, la disminucin en la resistencia trae como consecuencia un aumento en la intensidad de corriente.

(Ec. 10) A voltaje constante, el aumento de la intensidad de corriente produce un aumento del calor disipado por unidad de tiempo (efecto Joule) y por lo tanto habr mayor evaporacin de solvente; en consecuencia aumentar la fuerza inica y a causa de esto disminuir la movilidad. Lo visualizaremos porque la distancia corrida ser menor. Como se mencion anteriormente, una forma de solucionarlo es utilizar un sistema refrigerante, cosa particularmente til cuando se trabaja a voltajes constantes muy altos.

Si trabajamos en condiciones de intensidad constante, la disminucin de la resistencia, traer como consecuencia una disminucin del voltaje.

(Ec. 10) En estas condiciones, en consecuencia, el calor disipado por efecto Joule (Ec. 177) es menor Ahora bien, en esta situacin el menor voltaje resultante conduce a una menor distancia corrida por la partcula.

(Ec. 13)

Por lo tanto, para obtener una mayor distancia recorrida por la sustancia (probablemente ello sea necesario en ciertas condiciones) deberamos incrementar el tiempo de la corrida. Sin embargo, esto no es beneficioso porque trae aparejado un incremento de la difusin natural de las sustancias y por ende, una prdida de resolucin.

Ctedra de Fsica-FFYB-UBA [26]