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PRCTICAS DE LABORATORIO DE BIOQUMICA CLNICA

NORMAS QUE EL ALUMNO DEBER CUMPLIR EN EL AMBIENTE DEL LABORATORIO


1. Uso de la bata, el descuido por olvido de la misma tendr como consecuencia el retiro de la prctica. 2. La prctica comenzar a la hora fijada segn horario. El retraso por ms de diez (10) minutos impedir su entrada a la misma.
3. El alumno deber traer estudiada la gua correspondiente, debido a que el profesor

realizar un examen corto, calificado acumulativo, el cual tendr una ponderacin del 65% de la nota prctica.
4. El estudiante entregar, en el lapso previsto por el docente, un informe sobre el trabajo

realizado durante la actividad prctica, el cual constar de introduccin, metodologa, resultados, discusin y bibliografa. Este informe tendr una ponderacin del 25% de la nota prctica.
5. El estudiante mantendr un comportamiento corts para con sus compaeros,

responsabilidad para con la muestra a analizar y mstica de trabajo durante su actividad prctica. Esta conducta, destreza y aptitud ante la actividad tendr una ponderacin del 10% de la nota prctica denominndose nota apreciativa. 6. El estudiante estar en la obligacin de entregar, al finalizar la prctica, los resultados obtenidos. 7. Al terminar de trabajar deber apagar los equipos, lavar y secar el material de vidrio utilizado y dejar el laboratorio en completo orden. 8. No se permitir comer, beber ni fumar en el ambiente del laboratorio. 9. El material que se rompa, durante el ejercicio prctico, el alumno deber reponerlo en un periodo no mayor a 45 das. 10. La inasistencia a tres (3) actividades prcticas conducen a la prdida de la asignatura.
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11. El alumno que pierda una (1) actividad prctica, durante todo el semestre, tendr derecho a recuperarla al finalizar el contenido programtico prctico de la asignatura. El siguiente manual prctico recoge los protocolos de las actividades prcticas desarrolladas, durante el periodo acadmico II-99, en la asignatura Bioqumica Clnica.Estas prcticas se han venido desarrollando desde que se abri el sptimo semestre de la carrera Licenciatura en Bioanlisis. Sin embargo, a partir del II semestre de 1998 surgi la necesidad de actualizar los protocolos de trabajo, adaptar las actividades prcticas a la realidad de los centros asistenciales y ampliar el contenido programtico prctico con el objetivo de mejorar el proceso enseanza-aprendizaje de los estudiantes del curso. Fue en el II semestre de 1999 en el cual este trabajo fue culminado. Los nuevos mtodos y tcnicas que actualmente estn en el mercado son los descritos en este manual, lo cual les brinda a nuestros estudiantes, facilidad para la manipulacin de las mismas y por ende dar un diagnstico rpido y preciso sobre la patologa que pueda estar presentando el paciente en estudio.

PRCTICA N 1. CURVA DE CALIBRACIN.


1. Objetivo Terminal: al finalizar la prctica el estudiante estar en capacidad de construir

de una curva de calibracin para la obtencin del factor de calibracin y con ello la concentracin de la muestra problema.
2. Objetivos Especficos:

2.1.-Conocer la definicin y las diferencias entre solucin blanco, patrn o estndar y control. 2.2.- Conocer como se prepara una solucin madre y a partir de ella las soluciones patrones usando regla de tres o ecuaciones matemticas. 2.3.- Definir curva de calibracin. 2.4.- Conocer los pasos a seguir para la construccin de una curva de calibracin. 2.5.- Armar la curva da calibracin y a partir de ella calcular el factor de calibracin 2.6.- Explicar la importancia del factor de calibracin.

INTRODUCCIN
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La calibracin consiste en someter las diluciones de concentraciones conocidas al mismo procedimiento al cual fue sometida la muestra problema. Es la relacin entre la concentracin y la tramitancia o absorbancia, para un procedimiento analtico determinado.La calibracin se puede realizar a travs de la preparacin de patrones obteniendo las respectivas lecturas, mediante la realizacin de una curva de calibracin, o bien, hallando el factor de calibracin. Para ello se requieren de patrones y blanco. El patrn o solucin patrn de trabajo: es una solucin qumica de concentracin conocida. Puede ser elaborado en el laboratorio o adquirirse en casas comerciales especializadas, en las cuales se conocen como calibrador. Actualmente las casas comerciales ofrecen en el mercado los multicalibradores, los cuales son patrones que reportan concentraciones conocidas de un gran nmero de analitos diferentes. El blanco, es una muestra de concentracin cero, a la cual se le aplica el mismo tratamiento dado a la muestra patrn. Est formada por el solvente y los reactivos usados en la determinacin analtica. Esta muestra se utiliza con la finalidad de ajustar a cero la densidad ptica, es decir se sustrae toda absorbancia producida por el solvente, compuestos secundarios y los reactivos. La curva de calibracin, es la relacin representada grficamente entre la absorbancia y la concentracin de la solucin patrn de trabajo colocando las absorbancias en el eje de las ordenadas (Y) y las concentraciones en el eje de las abscisas (X). Si las lecturas se obtienen en tramitancia, la curva se debe construir en papel semilogartmico partiendo del 100% T. Si las lecturas se obtienen en absorbancia, la curva se construye en papel milimetrado partiendo de cero (0). En ambos casos el resultado ser una lnea recta indicando la conformidad con la ley de Beer, en otras palabras respeta la proporcionalidad.
Absorban Concentra

Las curvas de calibracin se construyen con el fin de poder calcular la concentracin de la muestra problema. Dicho clculo puede ser realizado de dos (2) maneras:
-

Una vez aplicada la tcnica se realiza la lectura de la muestra problema en el


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aparato, previo ajuste con el blanco en la longitud de onda requerida. Obtenida la lectura se

busca este valor en la curva y se traza una lnea hasta cortar la recta y, de aqu se prolonga hasta el eje de las abscisas donde se ubican las concentraciones. El punto de corte ser el correspondiente a la concentracin de la muestra problema. Esta tcnica se conoce como extrapolacin de la lectura CLCULO DE LA CONCENTRACIN DESCONOCIDA POR EXTRAPOLACIN DE LA LECTURA
Absorbanci as Punto de Lectura de la muestra corte

Concentra cin de la

Concentracio nes

El otro tipo de clculo se realiza por:


-

Factor de Calibracin, el cual se define como la relacin entre la

concentracin de la solucin patrn y su lectura respectiva. Posteriormente la multiplicacin de dicho factor por la absorbancia de la muestra problema nos da la concentracin de sta. A continuacin se presenta un caso a manera de ejemplo: Se tienen cuatro (4) patrones, cuyas concentraciones y lecturas son las siguientes: PATRN CONCENTRACIN LECTURA

1 2 3 4

1 mg/dl 2 mg/dl 4 mg/dl 6 mg/dl

0,023 0,046 0,093 0,140


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Fuente: Arevalo, E; Becerra, G y Araujo, J.F. Anlisis Instrumental. 1994. Lectura de la muestra problema....... 0,120. Fc1 = 1/ 0,023 = 43,478 Fc2 = 2/0,046 = 43,478 Fc3 = 4/0,093 = 43,011 Fc4 = 6/0,140 = 42,85 Factor promedio = 43,478 + 43,478 + 43,011 + 42,85 = 43,20 4 Concentracin problema = 43,20 x 0,120 = 5,18 CONSTRUCCIN DE UNA CURVA DE CALIBRACIN PARA LA GLUCOSA. (METODO GLUCOSA OXIDASA) Antes de preparar la solucin patrn de trabajo, es necesario conocer los valores de referencia del analito y la tcnica a utilizar. -

Se preparan patrones cuyas concentraciones varen por debajo, entre y por Conociendo que la glucosa vara entre 70 110 mg/dl, se prepararan patrones

encima del valor normal partiendo de cero. de 200, 150, 100, 75, 50 y 0 mg/dl tomando la concentracin de 200 mg/dl como solucin madre (2g en 1l de agua destilada); a partir de ella se prepararn los dems patrones.
TUBO SOLUCIN MADRE (ml) AGUA DESTILADA (ml) CONCENTRACIN (mg/dl) 200 150 100 75 50 0 0 0,5 1,0 1,25 1,5 2 1 2,0 2 1,5 1,0 3 0,75 4 0,5 5 0 6

NOTA: Es recomendable iniciar con el tubo de menor


-

Una vez preparado los patrones, se aplicar la tcnica de la Glucosa Oxidasa,

la cual se Fundamenta en: La B-D-Glucosa es oxidada especficamente por la Glucosa Oxidasa con produccin de perxido de hidrgeno (H2O2), el cual oxida al cromgeno (4-

AAp/fenol), para producir un compuesto coloreado, mediante una reaccin catalizada por la peroxidasa. 1. 2.

Tcnica: Tome 20 l de cada patrn preparado Aada 2,0 ml del reactivo de trabajo Incube por 30 minutos a temperatura ambiente Lea en un espectronic 20 a una longitud de onda de 510 nm Anote los resultados y grafquelos en un papel milimetrado.

3. 4. 5.

CONSTRUCCIN DE UNA CURVA DE CALIBRACIN PARA LA CREATININA (MTODO: Jaff) Antes de preparar la solucin patrn de trabajo, es necesario conocer los valores de referencia del analito y la tcnica a utilizar. -

Se preparan patrones cuyas concentraciones varen por debajo, entre y por Conociendo que la creatinina vara entre 0,5 1,5 mg/dl, se prepararn

encima del valor normal partiendo de cero. patrones de 2,0, 1,5, 1,0, 0,5, 0,25 y 0 mg/dl tomando la concentracin de 2,0 mg/dl como solucin madre (2mg en 100 ml de agua destilada); a partir de ella se prepararn los dems patrones.
TUBO SOLUCIN MADRE (ml)

1 2,0 0 2,0 1,5 0,5 1,5

2 1,0 1,0 1,0

3 0,5 1,5 0,5

5 0,25 1,75 0,25

6 0 2 0

AGUA DESTILADA (ml)

CONCENTRACIN (mg/dl)

NOTA: Es recomendable iniciar con el tubo de menor


Una vez preparado los patrones, se aplicar la tcnica de Jaff, la cual se fundamenta en: La creatinina existente en un filtrado libre de protenas reacciona con el picrato alcalino (formado por reaccin entre el cido pcrico y el hidrxido de sodio), formndose un tautmero de color rojo, siendo proporcional la intensidad del color a la concentracin de la muestra.
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1. sodio). 2.

Tcnica: Preparar el Picrato Alcalino (partes iguales de cido pcrico e hidrxido de Preparar siete (7) tubos de ensayos rotulados como: 0 0,25 mg/dl 0,5 mg/dl 1,0 mg/dl 1,5 mg/dl 2,0 mg/dl Blanco mg/dl 100 100 2 2

Agua destilada ( l ) Patrn ( l ) Picrato Alcalino (ml)

100 2

100 2

100 2

100 2

100 2

Esperar 15 minutos a 37C y leer a 520 nm. Realizar los clculos en este espacio

PRCTICA N. 2. CONTROL DE CALIDAD 1.-Objetivo terminal: al finalizar la prctica el estudiante estar en capacidad de armar e interpretar una curva de control de calidad para establecer los lmites de precisin y exactitud.. 2.- Objetivos especficos: 2.1.-Definir control de calidad 2.2.-Definir pool de suero y explicar cmo se colecta y se procesa. 2.3.-Conocer los pasos a seguir para la construccin de una curva de control de calidad. 2.4.- Calcular, armar y aplicar la curva de control de calidad para analizar la precisin y exactitud del trabajo.

INTRODUCCIN El control de calidad se podra definir como un mtodo estadstico que permite determinar la precisin y exactitud del anlisis realizado. La precisin se refiere al hecho de que los repetidos anlisis con la misma muestra debern dar resultados similares, es decir los resultados deben ser reproducibles. La exactitud nos indica la proximidad de una concentracin al verdadero valor de la concentracin de la muestra. La exactitud es difcil de determinar y se valora mejor por comparacin con los resultados obtenidos con materiales de concentracin conocida previamente analizados con mtodos de referencia. La precisin se determina calculando la desviacin estndar luego de un nmero de anlisis repetidos. El propsito del control de calidad consiste en evaluar de forma real la capacidad funcional habitual de un laboratorio con respecto a otros laboratorios, con el fin de identificar problemas significativos a medida que surgen y de documentar su resolucin. Se han empleado numerosas tcnicas de control estadstico en laboratorios clnicos en su mayor parte de carcter manual. Sin embargo, los datos no revelan de forma eficaz los
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sutiles cambios que puedan producirse en un mtodo analtico. En consecuencia, se han aceptado los grficos de control como mtodo eficaz para regular la mayora de las tcnicas de control. Tales grficas generalmente representan la observacin de control (o una estadstica calculada) en funcin del tiempo (das). La grfica de Levey-jennings (1950) ha sido la tcnica ms ampliamente utilizada. Para realizar dicha grfica es necesario preparar un pool de suero, el cual consiste en recoger en un envase estril mantenido a 20C, todos los sueros normales sobrantes del laboratorio. Tales sueros no deben estar hemolizados, lipmicos o ictricos. Al obtenerse un volumen de suero relativamente elevado (litros) se descongela y con una varilla de vidrio se desfibrina. Este producto es centrifugado a 3.000 rpm por 10 minutos y el sobrenadante es guardado a 20C en alcuotas de 5 a 10 ml contenidas en viales bien tapados y rotulados. Durante 30 das se realizarn lecturas de dicho pool una vez aplicada la tcnica respectiva. Con los datos recogidos se calcular la media aritmtica y la desviacin estndar. Estos datos estadsticos servirn para construir la Curva de Control de Calidad, la cual ser posteriormente utilizada para controlar la precisin del trabajo realizado en el laboratorio. CURVA DE CONTROL DE CALIDAD PARA LA GLUCOSA Fundamento de la Tcnica: la B-D-Glucosa es oxidada especficamente por la glucosa oxidasa con produccin de perxido de hidrgeno (H2O2), el cual oxida a un cromgeno, para producir un compuesto coloreado, mediante una reaccin catalizada por la peroxidasa. Procedimiento: Prepare doce (12) tubos de ensayo rotulados como blanco (B), estndar (S) y los diez restantes, Muestra (M1, M2, ....M10) B Agua destilada ( l ) Estndar ( l ) Pool de suero ( l ) Reactivo de Color (ml)

S
1

M
2

M
3

M
4

M
5

M
6

M
7

M
8

M
9

M
10

20 2 0 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0

Dejar incubar por 30 minutos a temperatura ambiente y leer en un espectronic


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20 a una longitud de onda de 510 nm. Una vez obtenida las lecturas calcular la concentracin

de glucosa, en cada tubo, por factor de calibracin estndar y Lp la lectura de dicho estndar.

Cp Lp

, donde Cp es la concentracin del

Hallar la concentracin promedio del Pool de suero =

concentraciones
ndevalores

Restar a cada concentracin (X) la concentracin promedio ( )= ( ) Elevar al cuadrado la resta anterior ( ) 2 Calcular la desviacin estndar Ds =

ndevalores 1

( )

Construir un eje de coordenadas ubicando en las abcisas (x) los das (10), y en

las ordenadas (y) la concentracin promedio ( ) , la cual se proyectar en el centro de dicho eje. Por encima y por debajo de la media se calcular una (1), dos (2) y tres (3) veces la desviacin estndar. (Ver grfica anexa) CURVA DE CONTROL DE CALIDAD PARA CREATININA Fundamento de la Tcnica: La creatinina existente en un filtrado libre de protenas reacciona con el picrato alcalino (formado por reaccin entre el cido pcrico y el hidrxido de sodio), formndose un tautmero de color rojo, siendo proporcional la intensidad del color a la concentracin de la muestra. 1. sodio).
2.

Tcnica: Preparar el Picrato Alcalino (partes iguales de cido pcrico e hidrxido de Preparar doce (12) tubos de ensayos rotulados blanco (B), estndar (S) y los B S
1

diez restantes como muestra (M1, M2, M3,.M10) M


2

M
3

M
4

M
5

M
6

M
7

M
8

M
9

M
10

Agua destilada 100 ( l ) Estndar ( l ) Picrato 100 2 2 100 2 100 2 100 2 100 2 100 100 100 100 100 100 2 2 2 2 2 2

Alcalino (ml) Esperar 15 minutos a 37C y leer a 520 nm.


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Una vez obtenida las lecturas calcular la concentracin de creatinina, en cada Cp Lp

tubo, por factor de calibracin de dicho estndar.


, donde Cp es la concentracin del estndar y Lp la lectura

Hallar la concentracin promedio del Pool de suero =

concentraciones
ndevalores

Restar a cada concentracin (X) la concentracin promedio ( ), es decir, ( Elevar al cuadrado la resta anterior ( ) 2 Calcular la desviacin estndar Ds =

ndevalores 1

( )

Construir un eje de coordenadas ubicando en las abcisas (x) los das (10), y en

las ordenadas (y) la concentracin promedio ( ) , la cual se proyectar en el centro de dicho eje. Por encima y por debajo de la media se calcular una (1), dos (2) y tres (3) veces la desviacin estndar. (Ver grfica anexa)

Grfica de Control de Levey-Jennings

+ + +

Da 13

Realizar los clculos en este espacio:


Muestra Lectura Concentracin (

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PRCTICA N.3. ANLISIS DE ORINA 1. Objetivo general: Al finalizar la prctica el estudiante estar en capacidad de realizar un uroanlisis como prueba de rutina para evaluar la funcin renal. 2. Objetivos especficos: 2.1.- Conocer el mtodo para la toma de muestra urinaria parcial 2.2.- Conocer la metodologa para la realizacin del examen de orina: -Examen fsico -Examen qumico -Examen microscpico 2.3.- Conocer el uso y los fundamentos de la cinta reactiva y de los mtodos confirmatorios. 2.4.- Establecer las diferencias entre los elementos organizados y no organizados de la orina con fines diagnsticos (leococitos, hemates, cristales, cilindros, bacterias, levaduras, clulas epiteliales planas y redondas) 2.5.- Diferenciar y reconocer, segn los resultados, las diferentes patologas renales (glomrulo nefritis, sndrome nefrtico, pielonefritis, infeccin bacteriana, infeccin mictica) 2.6.- Realizar el reporte de los resultados.

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INTRODUCCION El anlisis de orina constituye uno de los mtodos ms fieles para evaluar la funcin renal y para el diagnstico y pronstico de muchas patologas que afectan al rin. RECOLECCIN DE LA MUESTRA: 1) 2) 3) 4) 5) 6) 7) 8) Tcnica recomendada: chorro medio. Lavar los genitales con agua y jabn. Si es mujer separar los labios mayores o si es hombre retirar el prepucio. Despus de haber comenzado la miccin y haber descartado un poco de orina Debe ser la primera orina de la maana. Utilizar un recipiente estril. Llevarla lo antes posible al laboratorio. Una vez en el laboratorio: Procesarla de inmediato, de no ser as refrigerarla o

tomar una muestra representativa.

si se va a guardar por perodos ms prolongados usar conservadores. ANALISIS: Examen fsico: Color: de amarillo plido a mbar. Aspecto: Clara Ligeramente turbia. Turbia DENSIDAD: se refiere al nmero de solutos y al peso de estas sustancias en la orina. La densidad se mide con un refractmetro o urinmetro. VR: 1005 1030 g/ml. OLOR: la orina es inodora. Olor amoniacal: probable infeccin con bacterias. Olor a frutas: presencia de cetonas. Olor dulce: pus o posible infeccin. EXAMEN QUMICO: TIRAS REACTIVAS: el anlisis qumico se realiza a travs de las tiras reactivas, el procedimiento para el uso de las tiras reactivas es el siguiente: 1) Sumergir la tira reactiva en la muestra de orina.
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2) Remover el exceso de orina mediante golpes contra el borde del recipiente. 3) Comparar el color obtenido con la correspondiente carta de colores del envase. Los parmetros evaluados por las tiras reactivas son los siguientes: pH URINARIO: VR: 4,7 - 7,8. Viraje al naranja: cido. Viraje al verde o azul: alcalino. PROTENAS: Indicador : azul de tetrabromofenol. Presencia de protenas: Azul Verdoso. Ausencia de protenas: amarillo. Prueba confirmatoria: Acido sulfosaliclico. AZCARES: Principio: Glucosa + O2 H2O2 + O-toluidina Acido glucnico + H2O2 O toluidina oxidasa (azul)

Prueba confirmatoria: reaccin de Benedict. CETONAS: los cuerpos cetnicos se forman durante el catabolismo de los cidos grasos. Principio: Acido acetoactico + Nitroprusiato de Na+ Confirmatoria: prueba del cloruro frrico. BILIRRUBINA: producto final de la degradacin de los eritrocitos. Principio: Bilirrubina glucurnido + Sal de diazonio Prueba confirmatoria: Reactivo de fouchet. UROBILINGENO: se forma a partir de la reduccin de la bilirrubina. Principio: Urobilingeno + p dimetilaminobenzaldehido pH cido Prueba confirmatoria: Prueba de Erlich.
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prpura

azobilirrubina (azul)

Rojo.

NITRITO: se encuentra presente en las infecciones bacterianas. Principio: Acido p-arsanlico + Nitritos Diazonio + N-1-Naftilendiamina Diazonio Color rosado

SANGRE: la hematuria es la presencia de sangre en la orina, esta puede ser visible macroscpicamente o microscpicamente y puede ser debida a diversas causas a nivel renal: infecciones, glomerulonefritis, tumores, hipertensin, infarto renal, LES. Principio: Hemoglobina. H2O2 + 0 toluidina Prueba confirmatoria: microscpicamente. ESTUDIO DEL SEDIMENTO URINARIO: Tcnica: 1) 1.500 r.p.m. 2) 3) Descarte el sobrenadante y coloque el sedimento en una lmina portaobjeto Observar al microscopio con el objetivo seco. limpia, cubra la lmina con un cubreobjeto. Colocar 10 ml de orina en un tubo de ensayo, centrifugar por 10 minutos a O-toluidina oxidasa + H2O

SEDIMENTO URINARIO: Organizado: Clulas epiteliales. Hemates. Leucocitos. Cilindros. No organizado: Cristales

Clulas:

Eritrocitos, leucocitos. Clulas espiteliales, clulas del tbulo renal.


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Cristales:

orina cida

Acido rico, oxalato de calcio, uratos amorfos, cido hiprico, uratos de sodio, Sulfato de calcio, cristales de cistina, Colesterol, tirosina, leucina, sulfamidas.

Cristales:

orina Alcalina

Fosfato triple. Fosfato amorfo Carbonato de calcio Biurato. Biurato de amonio.

Estructuras Diversas

Bacterias Hongos Parsitos. Gotas de grasa y de aire. Cabellos y Fibras.

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PRCTICA N 4. DEPURACIN DE CREATININA 1. Objetivo terminal: Al finalizar la prctica el alumno estar en capacidad de determinar la depuracin de creatinina como prueba diagnstica para la insuficiencia renal. 2.- Objetivos especificos: 2.1.- Definir depuracin de creatinina. 2.2.- Conocer y fundamentar la tcnica para la determinacin de creatinina en suero y en orina de 24 horas (mtodo de Jaff). 2.3.- Conocer los interferentes de la prueba. 2.4.- Conocer y aplicar los pasos para el clculo de la depuracin de creatinina. 2.5.- Reportar e interpretar los resultados obtenidos para el diagnstico, junto a la clnica e historia del paciente, de insuficiencia renal.

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INTRODUCCIN Es el rin el rgano encargado de mantener el volumen y composicin de los lquidos corporales dentro de los lmites fisiolgicos normales. Esta funcin del rin es llevada a cabo por el acoplamiento de millones de nefronas que llevan a cabo la filtracin, secrecin y reabsorcin de lquidos y solutos en el plasma. La filtracin en el glomrulo ocurre por la elevada presin hidrosttica de sus capilares, esta presin hace que el lquido filtrado en el glomrulo tenga la misma composicin a la del plasma, excepto que no contiene protenas de elevado peso molecular. La creatinina es un producto final de la creatina del hgado. El reservorio de energa del msculo es la unin fosfato de alta energa. Las enzimas creatina quinasa y miokinasa separan el grupo fosfato de la creatina para formar ATP. CK Creatina-fosfato + ADP ATP + Creatinina.

La creatinina deriva de su interconversin no enzimtica en el msculo esqueltico y es liberada al plasma con una velocidad constante. La concentracin de creatinina plasmtica y urinaria depende de la masa magra muscular, por lo tanto se encuentra ms elevada en los hombres que en las mujeres y sus concentraciones son independientes de la dieta o cualquier factor del medio ambiente. La determinacin de la creatinina constituye uno de los principales parmetros para evaluar la funcin renal, ms especficamente la filtracin glomerular, ya que la creatinina es filtrada en el glomrulo y no se reabsorbe a nivel de los tbulos. Si el ndice de filtracin glomerular (IFG) disminuye ella aumenta en el plasma y disminuye en la orina o por si el contrario el IFG aumenta ella disminuye en el plasma y aumenta en la orina. Significado clnico: (Depuracin de creatinina) Se encuentra aumentada en: todos los estados que conllevan a un volumen minuto cardaco elevado: embarazo, estados hipercatablicos (hipertiroidismo) Se encuentra disminuida: cuando existe un flujo sanguneo renal disminuido: Shock, deshidratacin, hemorragias, insuficiencia cardaca congestiva, sndrome nefrtico, glomerulonefritis, pielonefritis, mieloma mltiple, insuficiencia heptica, paludismo, insuficiencia renal.
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Procedimiento de laboratorio: Muestra: debe ser tomada en ayunas, no debe estar hemolizada o lipmica. Interferentes de la prueba: algunos medicamentos como: furosemidas, metil prednisona, carbinoxolona (aumentan los valores reales de la creatinina). Las tiacidas, diazxido y drogas nefrotxicas disminuyen la creatinina). Se debe evitar tomar t, caf, evitar el ejercicio intenso, estar bien hidratado para obtener un flujo de orina superior a 2ml/minuto. Suspender el tratamiento con cortisona, tiroxina. La depuracin de creatinina se define como el volumen plasmtico en el que cierta cantidad de creatinina es eliminada en la orina por unidad de tiempo. Tcnica a emplear: Mtodo de jaff. La creatinina existente en un filtrado libre de protenas reacciona con el picrato alcalino (formado por reaccin entre el cido pcrico y el hidrxido de sodio), formndose un tautmero de color rojo, siendo proporcional la intensidad del color a la concentracin de la muestra. Procedimiento: 1) 2)
3)

Tomar la muestra de suero del paciente Medir el volumen de la orina de 24 horas con un cilindro graduado. Preparacin de la muestra de orina: dilucin 1/10. Determinacin de Creatinina en orina de 24 horas y en suero Preparar el Picrato alcalino (partes iguales de cido pcrico e hidrxido de

4) 5) sodio)

Determinacin de Creatinina en Suero y en orina. Blanco Standard Muestra de suero Muestra de orina (1/10)

100 Agua destilada ( l ) 100 Standard ( l ) Suero ( l ) Orina 1/10 ( l ) Picrato alcalino (ml) 2 2 Esperar 15 minutos a 37C y leer a 520 nm.

100 2 100 2

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Clculos: Concentracin / de / creainina / en / orina =


Concentracin / de / creainina / en / suero =

Concentracin / patrn Absorbancia / de / la / muestra Absorbancia / patrn

Concentracin / patrn Absorbanci a / de / la / muestra Absorbanci a / patrn

Convertir el volumen total de la orina (24 horas) en minutos: Volumen / orina (24horas ) , donde 1440 son los 1440

Volumen de orina en minutos = minutos en 24 horas. Depuracin de creatinina =

UxVm , donde U es la concentracin de ceatinina en P

orina, Vm volumen urinario minutado y P concentracin de creatinina en suero. Intervalo de referencia: 90 140 ml/min. Realizar los clculos en este espacio:

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PRCTICA N 5. DETERMINACIN DE BILIRRUBINA


1.

Objetivo terminal: Al finalizar la prctica el estudiante estar en capacidad de

determinar la concentracin, total, directa e indirecta, de bilirrubina srica para el diagnstico de ictericias.
2.

Objetivos especficos:

2.1.- Definir ictericia 2.2.- Clasificar la ictericia en : pre heptica, heptica y post heptica. 2.3.- Relacionar los niveles de bilirrubina total, directa e indirecta para el diagnstico del tipo de ictericia. 2.4.- Conocer y fundamentar las pruebas bioqumicas para la determinacin de bilirrubina srica. 2.5.- Aplicar, sobre la muestra biolgica, la tcnica adecuada para determinar los niveles de bilirrubina. 2.6.- Reportar e interpretar los valores obtenidos con el fin de diagnosticar la ictericia presente.

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INTRODUCCIN La bilirrubina proviene del grupo hem de la hemoglobina contenido en los eritrocitos. El 90% de estas clulas envejecidas son destruidas por los fagocitos del bazo, hgado y mdula sea, liberando hierro, globina y el grupo hem. En el interior del histiocito se produce la separacin del hem, hierro y globina a nivel del puente -metano por las enzimas hemoxigenasas microsmicas. El hierro y la globina son almacenados para ser reutilizados. El hierro se almacena como ferrtina o hemosiderina dentro del histiocito, pero la mayor parte es captado por la protena de transporte transferrina. El hierro de la transferrina es liberado en la mdula sea para ser utilizado en los normoblastos en formacin. La globina se degrada y pasa al fondo comn de los aminocidos. La porcin restante del anillo de porfirina (biliverdina) es reducida por la enzima biliverdina reductasa a bilirrubina, sta pasa a la sangre donde se combina con la albmina para ser transportada al hgado. En el hgado por accin de la enzima UDPglucoroniltransferasa es conjugada a bilirrubina conjugada, la cual es polar e insoluble en lpidos. El glucurnido de bilirrubina se excreta en la bilis, una vez en el intestino por accin de las enzimas bacterianas es convertido a urobilingeno, ste se excreta en las heces donde se oxida a urobilina o estercobilina. Parte del urobilingeno reabsorbido se filtra por el rin y aparece en la orina (urobilina urinaria). La determinacin de la bilirrubina tiene gran importancia clnica ya que sirve para evaluar la funcin heptica, anemias autoinmunes y la eritroblastosis fetal entre otras. El aumento de la bilirrubina en el plasma conlleva a un estado patolgico conocido como ictericia. La cual consiste en la coloracin de la piel y membranas mucosas por el aumento de los pigmentos biliares en la sangre. La ictericia se divide en: ictericia preheptica, heptica y post-heptica. Ictericia pre-heptica: produce un aumento de la bilirrubina no conjugada debido a un aumento de la liberacin y metabolismo de la hemoglobina despus de la hemlisis. Ejemplo: Anemias autoinmunes, eritroblastosis fetal. Ictericia heptica: aumento de la bilirrubina conjugada y no conjugada por problemas intrnsecos del hgado, ya sea por defectos en el transporte o metabolismo de la bilirrubina.

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Entre las patologas incluidas en esta clasificacin encontramos: el sndrome de Dubin-Johnson, la enfermedad de Crigler Najjar, hepatitis, cirrosis, ictericia fisiolgica neonatal. Ictericia post-heptica: enfermedad biliar obstructiva, espasmos o constricciones del tracto biliar, oclusin de conductos por clculos o de una compresin por la presencia de un tumor. En este caso aumenta la bilirrubina conjugada. Procedimiento de laboratorio: Muestra: suero o plasma. orina (proteger la muestra de la luz) Condiciones de la muestra: La muestra no debe estar hemolizada pues en este caso aparecen valores falsamente elevados. 1) Debe protegerse de la luz debido a que la luz degrada a la bilirrubina produciendo valores falsamente disminuidos. Fundamento de la prueba: La bilirrubina reacciona con el diazo reactivo de Erlich o P-benceno diazonio sulfonato, formando azobilirrubina compuesto de color rosado cuya intensidad se lee fotocolorimtricamente a 540 nm. Muestra: suero (dilucin 1:10) 1 ml de suero + 9 ml de solucin salina fisiolgica. Blanco de Directa Blanco de Total Directa Total SSF (ml) 2,5 2,5 -----------Metanol (ml) ---------2,5 2,5 Diazo blanco (ml) 0,5 ----0,5 ---Diazo reactivo (ml) ----0,5 -----0,5 Suero 1:10 (ml) 2 2 2 2 Guardar los tubos en la oscuridad y leer a los 30 minutos con filtro verde de 540 nm. Clculos: Bilirrubina directa (mg/dl): Absorbancia (M) x Factor 33. Bilirrubina total (mg/dl): Absorbancia (M) x Factor 33 Bilirrubina indirecta (mg/dl): Bilirrubina total Bilirrubina directa. Nota: el reactivo diazoico se prepara en el momento de su uso, de la siguiente forma:
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Solucin A: 20 ml 5 ml. Solucin B: 0,6 ml 0,15 ml. Mezclar. Intervalo de referencia: Bilirrubina total: 0,3 1,0 mg/dl. Bilirrubina directa: 0,1 0,15 mg/dl. Bilirrubina indirecta: 0,2 0,8 mg/dl. Resumen Causas de hiperbilirrubinemia: 1) a) b) c) d) e) f) 2) a) b) c) d) e) No conjugada: Hemlisis aumentada: anemias autoinmunes, eritroblastosis fetal. Ictericia neonatal. Eritropoyesis ineficaz. Drogas que compiten por el glucurnido. Enfermedad de Gilbert. Enfermedad de Crigler Najjar. Conjugada: Obstruccin del rbol biliar. Colestasis. Lesiones hepatocelulares: cirrosis, hepatitis. Neoplasias hepticas Clculos o quistes.

f) Sndrome de Dubin-Johnson y sndrome de Rotor.

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PRCTICA N 6. PROTENAS TOTALES Y FRACCIONADAS


1.

Objetivo terminal: al finalizar la prctica el alumno estar en capacidad de

determinar la concentracin de protenas totales, albminas y globulinas presentes en el suero del paciente. As mismo, interpretar los resultados con el fin de llegar a un diagnstico clnico.
2.

Objetivos especficos:

2.1.- Definir, clasificar y diferenciar las funciones de las protenas plasmticas. 2.2.- Conocer las patologas y estados fisiolgicos en los cuales las protenas se pueden presentar alteradas. 2.3.- Conocer los fundamentos y metodologas de las pruebas para la determinacin de protenas totales y albmina. 2.4.- Conocer los interferentes de las pruebas y las condiciones de la muestra. 2.5.- Reportar e interpretar los resultados obtenidos con fines diagnsticos.

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INTRODUCCIN Las protenas son sustancias de primordial importancia para la vida, ya que constituyen los elementos de las clulas en los que se realizan las funciones propiamente vitales. Al igual que los lpidos e hidratos de carbono, las protenas pueden ser utilizadas por el organismo con fines energticos. Pero adems son elementos estructurales, que forman la armazn arquitectnica de las clulas. El plasma sanguneo contiene en solucin coloidal una gran cantidad de protenas (alrededor de 7g/dl). Las protenas plasmticas constituyen complejos de sustancias de diferente composicin y de diferente estado de hidratacin, lo cual permite separarlas por distintos procedimientos, entre ellos electroforesis. Mediante la electroforesis se obtienen cuatro fracciones principales: la albmina y las globulinas , y , cada una con funciones especficas. Sin embargo, las protenas

plasmticas cumplen funciones generales, entre las cuales se encuentran: Intervienen en el metabolismo acuoso, principalmente manteniendo la presin Intervienen en el equilibrio electroltico Participan en el transporte de sustancias liposolubles, entre ellas los lpidos. Actan como hormonas, enzimas, antgenos y anticuerpos. coloidosmtica.

Interpretacin Clnica de las protenas Totales: Se utilizan para evaluar el estado nutricional y en el estudio del edema. Causas de protenas totales elevadas (> 9,0g/dl): deshidratacin. Causas de protenas totales disminuidas (<6,0 g/dl): gastroenteropatas, sndrome nefrtico. Descensos debidos a la disminucin de la sntesis de protenas como en: enfermedad heptica crnica, sndrome de malabsorcin, malnutricin agammaglobulinemia. Causas de Albmina elevada (>6,0 g/dl): procesos de deshidratacin (Pseudohiperalbuminemia). hiperinmunoglobulinemia, gammapatas mono o policlonales. Se encuentra pseudohiperproteinemia en caso de

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Causas de Albmina disminuida (<3,0 g/dl): malabsorcin, obstruccin intestinal, enfermedad heptica (cirrosis, hepatitis crnica activa), fiebre reumtica, sndrome nefrtico. PROTENAS TOTALES Mtodo: Biuret Principio: Las protenas por sus uniones peptdicas reaccionan con los iones cpricos del reactivo de Biuret en medio alcalino formando un complejo de color violeta. Muestra: Suero. Cuando se extraiga la muestra, y tras centrifugar, debe separase el suero de las clulas. Refrigerar, almacenar a 4C menos de 72 horas. A 20C es estable durante 6 meses. Interferencias: Procedimiento BLANCO ESTNDAR MUESTRA 50 Agua destilada ( l ) 50 Estndar ( l ) 50 Muestra ( l ) Reactivo de Biuret (ml) 3 3 3 Mezclar bien, dejar en reposo durante 10 minutos a temperatura ambiente y leer a 540 nm. Valores Normales: 6,3 8,5 g/dl. ALBMINA Mtodo: Verde de Bromocresol Principio: la albmina se une al indicador Verde de Bomocresol a un pH adecuado para formar un complejo coloreado, cuya intensidad es proporcional a la concentracin de albmina en la muestra. Muestra: Suero, orina parcial, orina de 24 horas, lquido cefalorraqudeo. Interferencias: aumentados.
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esteroides

anablicos,

andrgenos,

corticoides,

insulina

progesterona producen valores elevados de protenas totales.

ampicilina, hemoglobina, heparina y lipemia dan valores

Procedimiento: Blanco Estndar Muestra 20 Agua destilada ( l ) 20 Estndar ( l ) 20 Muestra ( l ) Reactivo (ml) 5 5 5 Mezclar bien, dejar en reposo durante 10 minutos a temperatura ambiente y leer a 630 nm. Valores refenciales: 3,5 5,1 g/dl. Realizar los clculos en este espacio.

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PRCTICA N 7. DETERMINACIN DE LOS NIVELES SRICOS DE CIDO RICO 1. Objetivoterminal: Al finalizar la prctica el estudiante estar en capacidad de determinar los niveles sricos de cido rico como prueba diagnstica del metebolismo de las purinas. 2. Objetivos especficos: 2.1.- Conocer el origen del cido rico y su importancia clnica. 2.2.- Conocer las patologas y estados fisiolgicos en los cuales el cido rico puede alterarse. 2.3.- Conocer los fundamentos y metodologas de las pruebas para la determinacin de cido rico. 2.4.- Conocer los interferentes de las pruebas y las condiciones de la muestra. 2.5.- Reportar e interpretar los resultados obtenidos con fines diagnsticos.

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INTRODUCCIN El cido rico es el producto final ms importante del metabolismo de las purinas, que son el producto de degradacin de las nucleoprotenas contenidas en las clulas de los tejidos. La principal fuente de cido rico la constituyen las nucleoprotenas contenidas en las carnes, aunque tambin las purinas son sintetizadas en la mdula sea a partir de los precursores qumicos sencillos como los componentes del cido nucleico, en combinacin con nucletidos y protenas. El cido rico en filtrado en el glomrulo renal pero casi en su totalidad (90%) es reabsorbido en los tbulos renales. El cido rico es ligeramente soluble en agua, pero forma sales solubles con alclisis por eso precipita fcilmente en orinas cidas si se les deja en reposo y tiene tendencia a formar clculos renales en pacientes con gota. La gota es un tipo de artritis inflamatoria articular secundaria a la cristalizacin de urato monosdico en la articulacin. En caso de una insuficiencia renal crnica avanzada existe un aumento progresivo del nivel plasmtico de cido rico. Interpretacin clnica: La cantidad total de cido rico circulante depende de la sntesis y catabolismo endgeno de las purinas, de la ingesta de purinas exgenas y del aclaramiento renal de los uratos. Hiperuricemia primaria: 1) Gota. Hiperuricemia secundaria: 1) Enfermedades mieloproliferativas, neoplasias, enfermedades renales, hipertiroidismo. Hipouricemia: enfermedades congnitas del metabolismo como la xantinuria. Carencia o defectos purino-nuclesido-fosforilasa. DETERMINACIN DE ACIDO RICO: Fundamento de la prueba: La determinacin enzimtica del cido rico se realiza mediante las reacciones siguientes: Acido rico + 2H2O + O2 Alantoina + CO2 + H2O2
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H2O2 + 4-AF + DCFS


4-AF:

Quinona rosada + 4H2O


4-aminofenazona,

DCFS: 2,4 diclorofenolsulfonato

.Muestra

suero o plasma. Orina de 24 horas.

No utilizar muestras hemolizadas. El cido rico es estable en nevera por 3 das (2 C 8 C), es estables en El cido rico es estable en orina a temperatura ambiente por varios das.

congelacin por seis meses. Interferentes de la prueba: 1) La bilirrubina y el cido ascrbico pueden ocasionar valores falsamente bajos. 2) Muestras lipmicas producen valores falsamente elevados. Procedimiento de laboratorio: Blanco 60 60 3,0 3,0 60 3,0 Patrn Paciente

Agua destilada ( ( l ) Patrn ( l ) Suero ( l ) Reactivo (ml)

Mezclar bien e incubar por 5 minutos a 37 C 10 minutos a temperatura ambiente y leer a una longitud de onda de 520nm. Clculos: concentracin = Valores de referencia: Suero o plasma = 2,5 7,7 mg/dl. Realizar los clculos en este espacio Concentracin / del / patn Lectura / de / la / muestra Lectura / del / patrn

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PRCTICA N 8. CURVA DE TOLERANCIA A LA GLUCOSA. DIABETES MELLITUS 1. Objetivo terminal: Al finalizar la prctica el alumno estar en capacidad de construir una curva de tolerancia a la glucosa como prueba diagnstica de la Diabetes Mellitus. 2. Objetivos especficos: 2.1.- Conocer el tratamiento del paciente para realizarle una curva de tolerancia a la glucosa. 2.2.- Conocer los pasos para realizar una curva de tolerancia a la glucosa. 2.3.- Conocer el mtodo adecuado y su fundamento para la determinacin de glucosa srica. 2.4.- Aplicar el mtodo adecuado sobre la muestra correspondiente para la determinacin de glucosa srica. 2.5.- Armar la curva de tolerancia a la glucosa. 2.6.- Reportar e interpretar los resultados obtenidos para obtener un diagnstico definitivo.

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INTRODUCCION La glucosa es el azcar principal de la sangre que sirve a los tejidos como principal combustible metablico. La concentracin de glucosa sangunea est controlada por la insulina. Esta hormona facilita la entrada de la glucosa a los tejidos extrahepticos que son impermeables a ella, en tanto que las clulas hepticas parecen ser libremente permeables a la glucosa. La glucosa estimula al pncreas para la sntesis y secrecin de insulina. Existen diversas patologas asociadas a niveles inadecuados de glucosa sangunea entre la ms comn est la DIABETES. La diabetes es una enfermedad metablica, crnica y generalizada que se manifiesta en hiperglicemia, cetosis, glucosuria, catabolismo proteico y acidosis. Esta enfermedad est asociada a trastornos del pncreas el cual es incapaz de producir insulina, produce insulina no funcional o niveles de ella insuficiente para los niveles de glucosa sangunea. La etiologa de la diabetes no est clara an, algunos autores afirman que se deben a factores genticos o ambientales, otros a que la diabetes se debe a mecanismos de autoinmunidad. Significado clnico: Hiperglicemia 1) menstrual. 2) 3) 4) 5) 6) Hiperglicemia febril: observada en las infecciones agudas: neumona, Hiperglicemia encefaloptica: observada en los traumatismos cerebrales. En el infarto al miocardio: transitoria, dos das despus del ataque cardaco. En la pancreatitis aguda. En el hipertiroidismo, sndrome de Cushing, acromegalia. tuberculosis y sepsis. Hiperglicemia fisiolgica: aumento de la glucosa sangunea sin glucosuria se observa en las excitaciones psquicas, esfuerzos musculares y a veces en el perodo

Hipoglicemia: 1) 2) 3) 4) En el hiperinsulinismo por insulinoma. Tratamiento excesivo con insulina. En la insuficiencia suprarrenal. Hipotiroidismo.
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5) 6)

Enfermedad heptica. En afecciones hipofisiarias.

Determinacin de la Tolerancia a la Glucosa: Esta prueba constituye un valioso auxiliar diagnstico. La tolerancia a la glucosa (capacidad para utilizar los carbohidratos) se encuentra disminuida en la diabetes y aumentada en el hipopituitiarismo, hiperinsulinismo y en la hipofuncin corticosuprarrenal. Descripcin de la prueba: Despus de un ayuno de 12 horas, se le administra al paciente segn condicin fisiolgica una solucin glucosada preparada de la siguiente manera (adulto 75g de glucosa disueltas en 350 ml de agua, nios < de 12 aos 1,75g/kg de peso en 350 ml de agua y embarazadas 100g de glucosa en 350 ml de agua). Antes de administrar la glucosa se toma una muestra de sangre, a la cual se le determinar los niveles de glucosa y constituir la glicemia basal. Posteriormente se administra la solucin glucosada y se esperan 2 horas para la toma de la segunda muestra. A esta ltima se le determina los valores de glicemia para el diagnstico. Durante la realizacin de la prueba el individuo debe permanecer en reposo y se abstendr de beber caf o fumar. En los individuos normales la glicemia en ayunas est comprendida entre 70 110 mg/dl, despus de la administracin del concentrado, la glicemia debe elevarse y retornar, antes de las 2 horas, a los niveles basales. En los diabticos el retorno al nivel basal es ms lento, es decir la curva de la tolerancia a la glucosa en estos pacientes es ms prolongada y ms elevada que la de los individuos normales. Procedimiento de laboratorio: Indicaciones: el da antes de la prueba se le explica al paciente que debe realizar un ayuno de 12 horas. Cenar temprano y ligero. Muestra: Suero Fundamento: La glucosa es oxidada especficamente por la glucosa oxidasa con produccin de perxido de hidrgeno el cual oxida al cromgeno (4 AAP/fenol), para producir un compuesto coloreado, mediante una reaccin catalizada por la peroxidasa. Glucosa oxidasa Glucosa + H20 + O2 H2O2 + 4 aminoantipirina + Fenol Acido glucnico + H2O2 Peroxidasa Compuesto coloreado
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Procedimiento: 1) Haga la determinacin de glucosa srica basal (en ayunas). 2) Adminstrele el concentrado de glucosa al paciente. Este debe tomarlo en un lapso no mayor de 5 minutos y el tiempo cero lo marca el comienzo de la ingesta. 3) Realice las determinaciones a las 2 horas siguiendo el esquema de trabajo que a continuacin se presenta: Agua destilada ( l ) 20 Standard ( l ) 20 Suero basal ( l ) 20 Suero 2 horas ( l ) Reactivo (ml) 2,5 2,5 2,5 2,5 Incube por 30 minutos a temperatura ambiente y lea en un espectronic a 510nm. Clculos: GLUCOSA (mg/dl) = Valores normales: En ayunas (suero o plasma) = 70 100 mg/dl. A las 2 horas = Normal < 126 mg/dl, Tolerante >126 < 199 mg/dl, Diabtico > 200 mg/dl Concentracin / del / patrn xLectura / de / la / muestra Lectura / del / patrn Blanco 20 Estndar Muestra (hora 0) Muestra (2 h)

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PRCTICA N 9. PERFIL LIPDICO 1.- Objetivo terminal: Al finalizar la prctica el alumno estar en capacidad de determinar el perfil lipdico con el fin de diagnosticar dislipoproteinemias y/o riesgo coronario. 2.- Objetivos especficos: 2.1.- Definir lpidos, colesterol, triglicridos, HDL colesterol, LDL colesterol y VLDL. 2.2.- Conocer la importancia clnica del perfil lipdico para la clasificacin de las dislipoproteinemias y diagnstico de riesgo coronario. 2.3.- Conocer los mtodos de rutina para la determinacin del perfil lipdico y los fundamentos de cada uno. 2.4.- Aplicar sobre la muestra en estudio, las tcnicas adecuadas para determinar los valores de lpidos en la misma e interpretar los resultados con fines diagnsticos de patologas en el metabolismo lipdico.

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PRCTICA N 9. PERFIL LIPDICO Los lpidos son sustancias orgnicas insolubles en agua, pero solubles en solventes orgnicos. Los principales lpidos del plasma humano son: el colesterol esterificado, el colesterol libre y los triglicridos. El Colesterol es un alcohol esteroideo insaturado que se sintetiza en casi todas las clulas del cuerpo, representa el 75% del total y constituye en componente estructural importante de las membranas celulares, un precursor en la biosntesis de los cidos biliares y las hormonas esteroideas. El colesterol libre, el cual representa el 25% del total, participa en los procesos patolgicos como principal factor en la gnesis de la ateroesclerosis de arterias vitales, causando enfermedad cerebrovascular, coronaria y vascular perifrica. El colesterol puede tener variaciones fisiolgicas relacionadas con el sexo, la edad, la dieta y el embarazo. Las variaciones patolgicas coinciden a menudo con las de la lipemia, aunque pueden presentarse variaciones discordantes. Entre las condiciones patolgicas que cursan con hipercolesterolemia estn: ictericia obstructiva, cirrosis biliar, ateroesclerosis, sndrome nefrtico, Dibetes Mellitus, entre otras. Entre las condiciones patolgicas que cursan con hipocolesterolemia estn: insuficiencia heptica, hipertiroidismo, entre otras. Los triglicridos son steres de glicerol, generalmente formados por tres cidos grasos diferentes. Provienen de dos fuentes: una externa del intestino delgado llamado triglicrido exgeno y una interna del hgado llamado triglicrido endgeno. Los triglicridos son almacenados en el tejido adiposo y constituyen una fuente potencial de energa. El nivel de triglicridos en el plasma es bastante variable, dependiendo del estado de alimentacin, cantidad de ejercicios y del estado metablico general. Se observan valores elevados de triglicridos en hiperlipoproteinemias fundamentalmente las de tipo I,III, IV y V, las cuales se caracterizan por: Tipo I: aumento de quilomicrones Tipo III: aumento de Pre Beta e intermedia Tipo IV: Aumento de Pre Beta lipoprotena Tipo V: Aumento de quilomicrones y Pre Beta lipoprotena. Los lpidos son transportados desde el intestino hasta los rganos donde se utilizan por partculas especializadas llamadas lipoprotenas, las cuales representan complejos

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macromoleculares que permiten la permanencia y movilizacin de los lpidos en un medio que le es adverso, como lo es el medio acuoso del plasma sanguneo. Estas lipoprotenas se han clasificado en cuatro clases principales basndose en el tamao de la partcula, su composicin qumica, caractersticas fisicoqumicas y de flotacin y movilidad electrofortica. De acuerdo a su densidad se han clasificado como quilomicrones, lipoprotenas de muy baja densidad (VLDL o LMBD), de baja densidad (LDL o LBD) y de alta densidad (HDL o LAD). La dosificacin de cada lipoprotena, complementada con la determinacin del colesterol y los triglicridos, proporciona lo que se conoce como Perfil Lipdico. Determinacin del perfil lipdico 1.- Triglicridos Mtodo de la glicerol fosfato oxidasa (GPO) Fundamento: Los triglicridos son hidrolizados por accin de la lipasa microbial en glicerol y cidos grasos libres (FFA). El glicerol es fosforilado por adenosina-5-trifosfato (ATP) en glicerol-3-fosfato (G3P) en una reaccin catalizada por glicerol kinasa (GK). El G3P se oxida a fosfato dihidroxiacetona (DAP) con formacin de perxido de hidrgeno (H2O2) en una reaccin catalizada por la enzima glicerol fosfato oxidasa (GPO). El H2O2 oxida al cromgeno (4-AAP) por accin de la enzima peroxidasa para formar una coloracin roja de quinoneimina, la cual es proporcional a la concentracin de triglicridos en la muestra. Procedimiento: Prepare cuatro (4) tubos de ensayos rotulados como blanco (B), estndar (S), Control (C) y muestra (M) Reactivo Agua destilada ( l ) Estndar ( l ) Muestra ( l ) Reactivo de color (ml) Incubar por 15 a 20 minutos B 30 S 30 30 3 3 3 a temperatura ambiente y leer a 540 nm. M

Para calcular la concentracin de triglicridos en la muestra se aplica la siguiente ecuacin:

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C x = Fc Lx , donde Cx es la concentracin del analito en la muestra, Fc el factor de calibracin y Lx la lectura de la muestra. Recuerde que el factor de calibracin se calcula dividiendo la concentracin del patrn (Cp) entre su lectura (Lp), es decir Fc = Valores Normales: 36 165 mg/dl. 2.- Colesterol Mtodo de la Colesterol Esterasa: Fundamento: El colesterol esterificado es hidrolizado por accin de la enzima colesterol esterasa para producir colesterol libre y cidos grasos. El colesterol libre es oxidado por la colesterol oxidasa para formar colest-4eno-3-ona y perxido de hidrgeno. En presencia de la peroxidasa, el perxido de hidrgeno formado oxida al cromgeno (DEAHCL/AAP), el cual producir un color proporcional a la cantidad de colesterol en la muestra. Procedimiento: Prepare cuatro (4) tubos de ensayo rotulados como blanco (B), estndar (S), control (C) y muestra (M). Reactivo Agua destilada ( l ) B 30 S M Cp Lp .

30 Estndar( l ) Muestra( l ) Reactivo de color (ml) 3 3 Incubar por 15 a 20 minutos a temperatura ambiente y leer a 500 nm. ecuacin:

30 3

Para calcular la concentracin de colesterol en la muestra se aplica la siguiente C x = Fc Lx , donde Cx es la concentracin del analito en la muestra, Fc el factor de calibracin y Lx la lectura de la muestra. Recuerde que el factor de calibracin se calcula dividiendo la concentracin del patrn (Cp) entre su lectura (Lp), es decir Fc = Valores Normales: Deseable: < 200 mg/dl Lmite: 200-239 mg/dl Alto: > 240 mg/dl
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Cp Lp

3.- HDL Colesterol Mtodo de Precipitacin Fundamento: Las lipoprotenas de baja densidad (LDL) y las lipoprotenas de muy baja (VLDL) son precipitadas selectivamente del suero sanguneo a un pH de 5,7 por la adicin del reactivo fosfotungstato amortiguado, dejando las lipoprotenas de alta densidad (HDL) en el sobrenadante. La centrifugacin del suero pretratado resulta en un sobrenadante aclarado que contiene HDL, el cual es analizado por el mtodo enzimtico de colesterol (Colesterol Esterasa). Procedimiento: 1. 2. 3. 4. En tubos de centrfuga pipetee sucesivamente 0,5 ml de suero y 1 ml de Agite enrgicamente durante 10 segundos y djelo en reposo durante 10 Centrifugue a 3.500 r.p.m durante 15 minutos Tome 0,2 ml del sobrenadante claro para la determinacin enzimtica de solucin precipitante. minutos a una temperatura menor de 25C.

colesterol. (Ver procedimiento para la determinacin del colesterol) Valores Normales Sexo Hombres (mg/dl) Mujeres (mg/dl) Pronstico favorable > 55 > 65 Riesgo normal 35 - 55 45 - 65 Indicador de riesgo < 35 < 45

4.- LDL Colesterol Mtodo indirecto; segn Friedewald: Fundamento: Esta frmula da resultados fiables siempre y cuando los quilomicrones no estn presentes, el contenido de triglicridos es inferior a 400 mg/dl y el paciente no padece de hiperlipoproteinemia del tipo III. LDLColesterol = Colesterol / total Valores normales: Sospechoso: a partir de 150 mg/dl Elevado: a partir de 190 mg/dl
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triglicridos HDLColesterol 5

5.- VLDL Mtodo indirecto; segn Rifking Fundamento: La relacin entre los triglicridos y la VLDL es constante (1:5), lo cual ha permitido desarrollar una ecuacin que de manera indirecta cuantifica a la VLDL. VLDL= triglicri dos 5

Valores normales: 10 36 mg/dl 6.- Marcadores de riesgo coronario Indice LDLColesterol HDLColesterol HDLColesterol Colesterol / total

Valor deseable: < 3 Indice

Valor deseable: > 0,23 Realizar los clculo en este espacio

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PRCTICA N 10. DETERMINACIN SRICA DE CALCIO Y FSFORO 1. Objetivo general: Al finalizar la prctica el estudiante estar en capacidad de determinar los niveles de calcio y fsforo sricos con fines diagnsticos de patologas seas. 2. Objetivos especficos: 2.1.- Conocer las fuentes principales de calcio y fsforo. 2.2.- Conocer la relacin existente entre calcio y fsforo srico. 2.3.- Conocer los fundamentos y tcnicas de las pruebas de rutina para la determinacin de calcio y fsforo sricos. 2.4.- Conocer los interferentes de las pruebas como tambin el tipo de muestra. 2.5.- Conocer las diversas patologas y estados fisiolgicos que se presentan con niveles aumentados o disminuidos de calcio y fsforo. 2.6.- Aplicar sobre la muestra adecuada las tcnicas correspondientes para establecer un diagnstico definitivo a partir de la clnica del paciente y los niveles de calcio y fsforo encontrados en dicha muestra.

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INTRODUCCIN El fsforo existe en todas las clulas del organismo, pero la mayor parte (el 80%) se encuentra combinado con el calcio en los huesos y en los dientes. Un 10% se halla en combinacin con protenas, con lpidos y carbohidratos, y en otros compuestos de la sangre y del msculo. El fsforo se encuentra en casi todos los alimentos de la dieta, por lo tanto no se conoce que ocurra una deficiencia diettica en el hombre. El consumo de fsforo debe ser de 1,5 g/da en los adultos y un poco mayor en los nios, en los lactantes el consumo de fsforo es an mayor. El metabolismo del fsforo se encuentra, en gran parte, relacionado con la del calcio, la relacin de estos dos elementos es 1:1 cuando el aporte de vitamina D es adecuado. Interpretacin Clnica de los Valores de Fsforo Srico: Hipofosfatemia: en general asintomtica, pero si es marcada puede dar una serie de manifestaciones clnicas como: insuficiencia respiratoria, acidosis metablica, fallo cardaco y alteraciones hematolgicas. Si es moderada ocasiona debilidad muscular. 1) 2) 3) Raquitismo: pueden llegar a ser tan bajos como 1 a 2 mg/100 ml. En el hiperparatiroidismo, en la enfermedad celaca. Pacientes con defecto tubular renal (heredado o adquirido), en la reabsorcin

de los fosfatos: raquitismo familiar, el sndrome de Toni-Fanconi. En todos estos casos ocurre un aumento de la excrecin del fosfato en la orina y este hallazgo permite diferenciar a estos pacientes de aquellos en los que la causa del fsforo sanguneo disminuido es una deficiencia de vitamina D. 4) Por disminucin de aporte: malabsorcin intestinal, diarreas, fijacin de fosfatos en el tubo digestivo por tratamiento con anticidos, alimentacin parenteral exclusiva con lquidos pobres en fosfatos, alcoholismo crnico, carencia de vitamina D. 5) Vmitos, diarreas. Hiperfosfatemia: determina hipocalcemia y tetania si es importante y aguda. Si es crnica conlleva a calcificaciones vasculares y tisulares especialmente a nivel del rin. Se observa en: 1) 2) 3) Por aumento de ingresos: intoxicacin por vitamina D, exceso consumo de En la IRC o en la IRA: por disminucin del filtrado glomerular. En el hipoparatiroidismo y en la acromegalia.
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productos lcteos, por administracin continua de laxantes ricos en fosfatos.

4) 5)

Pacientes con quemaduras extensas. Tumores, leucemias, linfomas.

Procedimiento de Laboratorio: Muestra: Suero u Orina de 24 horas. Medir el volumen total de orina y realizar una dilucin 1:50. Fundamento: La reaccin de fsforo inorgnico con molibdato de amonio en presencia de cido sulfrico produce un complejo de fosfomolibdato no reducido que se lee a 340 nm. Procedimiento de Laboratorio: Blanco Estndar Reactivo enzimtico (ml) 3 3 Suero (ul) -------Estndar (ul) --------60 Agua destilada (ul) 60 ---------Mezclar y leer la absorbancia a los 5 minutos a 340 nm. Clculos: Concentracin / de / fsforo = Intervalo de Referencia: Adultos: 4,0 7,0 mg/dl. Nios: 0 1 ao: 4,9 7.9 mg/dl. 1 a 15 aos: 3,4 6,2 mg/dl. concentracin / del / patrn xLectura / de / la / muestra Lectura / del / patrn Muestra 3 60 -----------------

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INTRODUCCIN El calcio es un mineral presente en el ser humano, ste existe en concentraciones mayores que cualquier otro mineral. El cuerpo de un hombre adulto de 70 Kg de peso contiene aproximadamente 1,200 g de calcio. El 90% de calcio en el organismo se encuentra en el esqueleto, donde es mantenido como depsitos de fosfato de calcio. Tambin se encuentra en los lquidos corporales en forma no ionizada. Esta pequea cantidad es importante para el proceso de la coagulacin, el mantenimiento de la excitabilidad normal del corazn, de los msculos y nervios, y para los aspectos diferenciales de la permeabilidad de las membranas. El calcio se encuentra presente principalmente en la leche y sus derivados, mantequilla, quesos, natas. Se encuentra en menores cantidades en la yema de huevo, frijoles, lentejas, nueces, higos, coliflor. Los requerimientos diarios de calcio son los siguientes: Hombres y mujeres despus de los 18 aos de edad: 800 mg/da. 2do y 3er. Trimestre del embarazo: 1,2 mg/da. Lactantes y menores de 1 ao: 360 540 mg/da. Nios de 1-18 aos: 0,8 1,2 mg/da. El calcio proveniente de la dieta es absorbido por un proceso de transporte activo en la parte superior del intestino delgado. El proceso es regulado por el 1,25dihidroxicolecalciferol un metabolito de la vitamina D. La absorcin de calcio es facilitada por la vitamina D, las protenas y la lactosa. Mientras que la absorcin se encuentra inhibida por el fitato (granos de cereales), el oxalato (las espinacas) y los fosfatos. Estados patolgicos: A) Relacin con las paratiroides: Hiperparatiroidismo: elevacin del calcio srico con disminucin del fosfato. Hipoparatiroidismo: disminucin del calcio srico con aumento del fosfato. B) C) Osteoporosis: es la prdida progresiva del tejido seo y est relacionada con Raquitismo: consiste en una calcificacin defectuosa de los huesos debido a un aporte inadecuado de calcio. un bajo contenido en el organismo de vitamina D, a una deficiencia de calcio y fsforo en la dieta o a una combinacin de ambos factores.
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D) E)

Enfermedades renales: IRC, nefritis, nefrosis ocasionan disminucin del calco Se encuentra aumentado en el mieloma mltiple y en enfermedades

srico por aumento de filtracin del catin a nivel glomerular. neoplsicas de los huesos. Procedimiento de laboratorio: Muestra: 1) 2) 3) 4) entre 2-8 C. Interferencias: 1) 2) Sustancias que forman complejos con el calcio, dan resultados incorrectos. Hemlisis severa o lipemia puede causar resultados elevados. Suero fresco no hemolizado o plasma heparinizado. Remover el cogulo del suero tan rpido como sea posible, ya que los Muestras viejas de suero que contengan partculas visibles precipitadas no Calcio en suero es estable por 24 horas a temperatura ambiente, una semana

glbulos rojos pueden absorber calcio. deben utilizarse.

Fundamento: El mtodo utiliza O-Cresolftaleina complexona como cromgeno, el calcio reacciona con el cromgeno en un medio alcalino produciendo un color violeta. La intensidad del color es proporcional a la concentracin del calcio en la muestra. Medio alcalino CALCIO + (CPC) (color violeta) complejo CPC - calcio

Blanco Estndar Muestra 60 Agua destilada ( l ) 60 Estndar ( l ) 60 Suero ( l ) Reactivo de color (ml) 3,0 3,0 3,0 Incubar 1 minuto a temperatura ambiente. Leer en el espectrofotmetro a 570 nm.

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Clculos: Concentracin / de / calcio = Concentracin / del / patrn xLectura / de / la / muestra Lectura / del / patrn

Valores esperados = 8,5 10,4 mg/dl. Realizar los clculos en este espacio

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PRCTICA N 13. DETERMINACIN DE LOS NIVELES SRICOS DE AMILASA 1. Objetivo general: Al finalizar la prctica el estudiante estar en capacidad de determinar los niveles sricos de amilasa con fines diagnsticos de pancretitis aguda. 2.- Objetivos especficos: 2.1.- Definir y conocer la procedencia de la amilasa y su funcin en el organismo. 2.2.- Relacionar los valores de la amilasa con diversas patologas que cursan con amilasemia. 2.3.- Distinguir entre una pancreatitis aguda y crnica. 2.4.- Conocer los interferentes y tipo de muestras utilizadas en la determinacin de la amilasa srica. 2.5.- Conocer y fundamentar las pruebas bioqumicas de rutina para la determinacin de amilasa. 2.6.- Aplicar sobre la muestra adecuada la tcnica correspondiente para el diagnstico de pancreatitis aguda. 2.7.- Reportar e interpretar los resultados con fines diagnstico de afeccin pancretica.

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INTRODUCCIN La amilasa es una enzima que degrada molculas hidrocarbonadas complejas en componentes ms pequeos. Es producida por el pncreas exocrino y las glndulas salivales para ayudar a digerir el almidn. Se encuentra tambin en el hgado y en el revestimiento de las trompas de Falopio. La amilasa humana se denomina amilasa por su capacidad para romper los enlaces polisacridos 1-4 al azar. El producto final de la accin de la Amilasa sobre el polisacrido es la formacin de maltosa y algunas molculas de glucosa. La actividad de dicha enzima aumenta en el suero y en la orina de pacientes afectados de pancreatitis. Para la deteccin de esta condicin se utiliza la determinacin de la amilasa. La pancreatitis se presenta a menudo como una emergencia mdica, por lo que la determinacin de dicha enzima debe ser prueba "stat" o inmediata. Existen otras condiciones capaces de provocar aumento de la amilasa srica, incluyendo paperas, parotiditis, abcesos tubricos, derrame pleural, obstruccin intestinal, traumatismo abdominal, ciruga intrabdominal, trombosis mesentrica, peritonitis, lceras gstricas, aneurisma de aorta, traumatismo cerebral y hemorragia esplnica. Interpretacin Clnica:

Alrededor del 80% de los pacientes con pancreatitis aguda manifiestan La amilasa pancretica diferencia entre pancreatitis aguda y crnica. La mayor actividad de la amilasa se encuentra en las glndulas partidas y el

valores elevados de amilasa pancretica en las primeras 24 horas.

pncreas, si bien hay actividad en ovarios e intestinos, los valores aumentados en ausencia de pancreatitis aguda se observan en parotiditis (isoenzima salival), en obstruccin o infarto intestinal, embarazo ectpico, enfermedad del tracto biliar de cualquier origen, en cetoacidosis diabtica, quiste y pseudoquiste pancretico, peritonitis. La macroamilasemia consiste en la presencia en suero de amilasa unida a imunoglobilina no filtrable por el glomrulo, lo cual provoca un aumento importante en suero, mientras que no existe eliminacin urinaria de amilasa. Se describen niveles elevados de amilasa en individuos alcohlicos y en algunos tumores de pulmn y ovario. Muestra:
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Suero. Orina de 24 horas. Orina de 2 horas. Lquido peritoneal. Lquido pleural.

Interferentes de la Prueba: Se observan incrementos de la amilasa srica en tratamientos con drogas que Se observan disminuciones en las muestras tratadas con oxalato o citrato. Las producen constriccin del esfnter de ODDI y por la contaminacin de la muestra con saliva. hipertrigliceridemias pueden inducir falsas disminuciones de amilasa. Procedimiento de laboratorio: En dos (2) tubos de ensayo rotulados como blanco y muestra aadir: agua destilada. (ml) suero ( l ) reactivo de color (ml) 3,0 Incubar por 1 minuto y leer a 405 nm. Clculos amilasa = lectura x 3.178 Valor Normal = 25 - 125 u/l. Blanco 75 Muestra 75 3,0

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PRCTICA N 14. DETERMINACIN DE LOS NIVELES SRICOS DE CREATINA QUINASA.


1.

Objetivo terminal: al finalizar la prctica el estudiante estar en capacidad de

determinar los niveles sricos de creatina quinasa como prueba de ayuda diagnstica de afecciones cerebrales, musculares y cardacas. 2. Objetivos especficos: 2.1.- Definir y conocer la distribucin de la creatina quinasa y su funcin. 2.2.- Conocer las diferentes isoenzimas de la Creatina quinasa e interpretar los niveles sricos de cada una. 2.3.- Conocer y fundamentar las pruebas bioqumicas para la determinacin de la creatina quinasa. 2.4.- Aplicar sobre la muestra biolgica respectiva la tcnica adecuada para la obtencin de resultados y reportar e interpretar los resultados obtenidos

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INTRODUCCIN La creatina quinasa (CK) es una enzima celular, ampliamente distribuida en los tejidos del organismo, principalmente en el msculo esqueltico, tejido cardaco y cerebro. Su funcin est asociada con la generacin de trifosfoadenosina (ATP) para sistemas contrctiles o de transporte. La CK cataliza la fosforilacin reversible de la creatina; reaccin en la cual el ATP acta como dador del grupo fosfato. Creatina + ATP fosfocreatina + ADP. Existen tres isoenzimas la CK MM (msculo), la CK-MB (hbrida en el corazn y la CK-BB en el cerebro, msculo liso, tiroides, pulmones y prstata. Interpretacin Clnica: los incrementos de CK-BB aparecen en determinados tipos de cncer (prstata, vejiga, pulmn e intestino), ciruga cardaca, traumatismos cardacos y en enfermedades del tejido conectivo. Los aumentos de la CK-MM se producen predominantemente en la distrofia muscular, rabdomilisis (destruccin o degeneracin del tejido muscular debido a una o varias causas, en especial traumatismos), polimiositis (inflamacin que produce debilidad de los msculos de los hombros, caderas y cuello, habitualmente asociada con dolor muscular y lasitud), infarto al miocardio, isquemia miocrdica, lesin cerebral, insuficiencia renal crnica, shock avanzado y atresia biliar. Los aumentos de CK-MB se presentan en enfermedades miopticas y enfermedades inflamatorias del corazn. Tras un infarto al miocardio las CK-MM y CK-MB ingresan al sistema circulatorio como resultado de la lesin de la clula muscular cardaca. El aumento de la concentracin de estas isoenzimas se puede detectar a las 4 y seis horas despus del infarto; las concentraciones mximas aparecen habitualmente a las 18 y 24 horas, y los valores normales se recuperan a las 36 y 72 horas. Tambin se observan elevaciones de la CK-MB tras la ciruga cardaca y en las extensiones de los infartos, la isquemia miocrdica, pericarditis, hipotiroidismo y en los corredores de maratn. Tipo de ensayo: cintico; Medir el cambio de absorbancia por 3 minutos. Longitud de onda = 340 nm. Fundamento: su procedimiento emplea un anticuerpo policlonal del monmero CKM para inhibir completamente la actividad del CK-MM y una mitad del CK-MB. Entonces la
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actividad del monmero CK-B no es inhibida y puede ser medida. La actividad de la CK-B es medida usando la siguiente serie de reacciones: CK-B ADP + creatinafosfato HK ATP + glucosa G6PDH G-6-P + NAD Procedimiento de laboratorio: En dos (2) tubos de ensayo rotulados como blanco y muestra aadir: Agua destilada (ml) 150 Muestra ( l ) Reactivo (ml) 3,0 Mezclar y leer al minuto, a los dos minutos y a los tres minutos Clculos: CK total = Abs/min (corregida) x VT x 1000 6,22 x LP x Vm VT = volumen total. VM = volumen de la muestra. 6,22 = coeficiente de extincin milimolar de NADH. 1000 = conversin de unidades de ml a l. LP = paso de la luz en cm (s una celda de 1 cm es usada). Nota: El resultado debe ser multiplicarlo por 2. Valor de referencia: 0 - 22 U/l Blanco 3,0 Muestra 6-fosfogluconato + NADH + H+ ADP + glucosa - 6 P Creatina + ATP

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PRCTIVA N 12. DETERMINACIN DE LOS NIVELES SRICOS DE FOSFATASA ALCALINA 1.- Objetivo terminal: Al finalizar la prctica el alumno estar en capacidad de determinar los niveles sricos de fosfatasa alcalina con el fin de diagnosticar procesos de obstructivos y seos. 2.- Objetivos especficos: 2.1.- Definir y conocer la ubicacin celular de la fosfatasa alcalina. 2.2.- Reconocer la interpretacin clnica de la fosfatasa alcalina para la evaluacin de procesos obstructivos. 2.3.- Conocer los interferentes de las pruebas. 2.4.- Conocer y fundamentar las pruebas bioqumicas para la determinacin srica de la fosfatasa alcalina. 2.5.- Aplicar sobre la muestra en estudio la tcnica respectiva, para la determinacin srica de la fosfatasa alcalina y reportar e interpretar los resultados obtenidos con fines diagnsticos de procesos obstructivos y seos.

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INTRODUCCIN La fosfatasa alcalina es una hidrolasa con muy poca especificidad de sustrato. Se encuentra presente en casi todos los tejidos del cuerpo especialmente en el epitelio intestinal, tbulos renales, hueso, hgado y placenta. Su localizacin celular es la membrana. En el suero de individuos normales el origen, de la fosfatasa alcalina en el 50%, es heptico y seo (aunque la contribucin relativa de esas dos fracciones al total de actividad enzimtica es marcadamente edad dependiente). Los individuos de los grupos sanguneos B y O secretores tienen en sus sueros fosfatasa alcalina de origen intestinal. Existen 5 isoenzimas principales de esta enzima<. Heptica, sea, intestinal, renal y placentaria. Se diferencian entre ellas por su estructura molecular y por sus propiedades fsico-qumicas, antignicas y catalticas. Aparte de esas formas moleculares, la fosfatasa alcalina puede presentar algunas formas atpicas: fraccin biliar (tambin asociada como fraccin heptica rpida o heptica); formas de origen neoplsicos (isoformas Regan, Nagao y Kasahara) y formas de migracin lenta (complejos moleculares de gran tamao constituidos por la enzima y una molcula de IgG). La fraccin biliar parece ser que es un complejo de la enzima con restos moleculares procedentes de la ruptura de las membranas de los hepatocitos o de las clulas del tracto biliar. Las fracciones de origen canceroso tienen algunas propiedades fsicoqumicas muy semejantes a las de la funcin placentaria. Interpretacin clnica: Como otras enzimas, la fosfatasa alcalina tiene muy poca especificidad y puede encontrarse elevada en mltiples situaciones. Sin embargo, tiene dos aplicaciones clnicas muy tiles: osteoblstica. En la enfermedad obstructiva heptica se produce una elevacin srica importante sobre todo, si la obstruccin es extraheptica. En la enfermedad parenquimatosa heptica la elevacin es en general muy discreta. En la enfermedad obstructiva heptica. En la enfermedad metablica sea, asociada al incremento de la actividad

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En las enfermedades metablicas seas, constituye prcticamente la nica enzima que tiene utilidad diagnstica. Se encuentra principalmente elevada en la enfermedad de Paget, en el raquitismo, osteomalacia (elevacin muy discreta) y en el hiperparatiroidismo con implicacin sea. En las metstasis seas slo se produce elevacin de la fosfatasa alcalina en aquellas metstasis que dan lugar a lesiones osteoesclerticas con formacin sea de novo y gran actividad osteoblstica. En las metstasis osteolticas la fosfatasa alcalina permanece sin cambio. Procedimiento de laboratorio: Mtodo: p-nitrofenilfosfato. Muestra: suero libre de hemlisis. Longitud de onda: 405 nm. Temperatura: 25 C, 30 C y 37 C. Blanco 3 Muestra 3 75

Agua destilada (ml) Reactivo (ml) Suero ( l )

Mezclar bien e incubar por 1 minuto, leer a 405 nm. Llevar a cero el instrumento con agua destilada y anotar las absorbancias a intervalos de 1 minuto durante los prximos 3 minutos Clculos: Fosfatasa alcalina en la muestra: A/min x 2187. 30 C 27-95 U/l 37C 35-123 U/l Valores esperados: 25 C 22-79 U/l

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PRCTICA N 11. DETERMINACIN DE LOS NIVELES SRICOS DE TRANSAMINASAS (Alanina y Aspartato amino transferasa) 1.- Objetivo terminal: Al finalizar la prctica el alumno estar en capacidad de determinar los niveles sricos de las transaminasas con el fin de diagnosticar y evaluar pronsticos en alteraciones ubicadas en el hgado o en el corazn. 2.- Objetivos especficos: 2.1.- Definir y conocer la ubicacin celular de las transaminasas. 2.2.- Reconocer la interpretacin clnica de las transaminasas para la evaluacin de afeccin heptica y cardaca. 2.3.- Conocer los interferentes de las pruebas. 2.4.- Conocer y fundamentar las pruebas bioqumicas para la determinacin srica de las transamimasas. 2.5.- Aplicar sobre la muestra en estudio la tcnica respectiva, para la determinacin srica de transaminasas. 2.6.- Reportar e interpretar los resultados obtenidos con fines diagnsticos de infartos al miocardio y afecciones hepticas

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INTRODUCCIN. Las transaminasas catalizan la transferencia de un grupo amino desde un aminocido hacia un cetocido. Estas enzimas son la alanina aminotransferasa (ALT) y la aspartato aminotransferasa (AST). Alanina Aminotransferasa (ALT) o Transaminasa Glutmico Pirvica (TGP). Esta enzima cataliza la transferencia del grupo amino de la alanina al cido cetoglutmico. ALT Alanina + cido cetoglutarato cido pirvico + cido glutmico La alanina aminotransferasa se encuentra presente en los tejidos y su aparicin en el suero es un ndice de lesin tisular similar a la aparicin de la aspartato aminotransferasa. Sin embargo, los valores sricos de ALT son ms pronunciados en las lesiones hepticas que en las lesiones miocrdicas siendo sta enzima un indicador especfico de dao heptico. Interpretacin clnica: La mxima actividad de la ALT se manifiesta en el hgado, msculo esqueltico, rin y corazn. Elevacin importante de la ALT se observa en necrosis del hepatocito, en traumatismo extenso del msculo esqueltico, golpe de calor, miocarditis, cirrosis, ictericia obstructiva, infarto agudo del miocardio y en enfermedades hemolticas. Otros casos: se han descrito niveles elevados de ALT en obesos, en nios con leucemias linfocticas agudas y en el sndrome de Reye. Interferencias: La hemlisis interfiere aumentando los niveles de ALT. Se han descrito incrementos debido a drogas hepatotxicas, as como a inyecciones musculares. Aspartato Aminotransferasa (AST) o Transaminasa Glutmico Oxalactica (TGO). Esta enzima cataliza la transferencia del grupo amino del aspartato al cido cetoglutmico. Aspartato + cido cetoglutarato cido oxalactico + cido glutmico. Todos los tejidos contienen aspartato aminotransferasa, particularmente el corazn, el hgado y el msculo esqueltico. Existen dos (2) isoenzimas una mitocondrial (mAST) y una citoslica (cAST). Estas dos isoenzimas difieren notablemente en cuanto a su estructura y a
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sus propiedades qumicas y fsicas. Sin embargo, ambas catalizan la misma reaccin y solamente existen pequeas diferencias en los pasos catalticos. Interpretacin clnica: Incremento de la AST se observan en hepatitis fulminantes, hepatitis virales, necrosis o dao del hepatocito por cualquier causa, ictericia colestsica, hepatitis crnica, txica o alcohlica. En esta ltima predomina la AST sobre la ALT. Mientras que en la hepatitis vrica la ALT predomina sobre la AST. En el sndrome de Reye aumenta la AST fundamentalmente. Otros casos: Niveles elevados se observan tambin en enfermedades de origen muscular, cardaco, predominando en infarto agudo al miocardio la elevacin de la AST sobre la ALT. En la cirrosis heptica puede estar normal o discretamente aumentada. Se han descrito valores disminuidos de la AST en pacientes urmicos y en tratamiento con metromidazol, as como en el dficit de vitamina B6 (piridoxal). Interferencias: La hemlisis interfiere aumentando la concentracin de AST. Igualmente la isoniazida, fenotiazinas, eritromicina, esteroides anablicos, opiceos y salicilatos provocan aumentos de AST en suero. Fundamento de la AST (TGO): La aspartato aminotrnasferasa cataliza la transferencia del grupo amino del L-aspartato a - ketoglutarato dando oxalacetato y Lglutamato. El oxalacetato se reduce a malato en una reaccin catalizada por malato deshidrogenasa (MDH). En esta misma reaccin un equivalente de NADH se oxida a NAD. La disminucin en absorbancia a 340 nm es directamente proporcional a la actividad de la AST. La lactato deshidrogenasa (LDH) se adiciona para reducir rpidamente cualquier piruvato presente en el suero de modo que no interfiera con el ensayo. AST L-aspartato + -Ketoglutarato MDH Oxalacetato + NADH + H Procedimiento: Agua destilada (ml) Blanco 3 Muestra
+

Oxalacetato + L-glutamato. L- Malato + NAD+ + H2O

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Reactivo (ml) 3 300 Suero ( l ) Leer la disminucin de la absorbancia cada minuto por 3 minutos, determinar el Abs/min y multiplicar por el factor 1768 para obtener los resultados UI/l. Clculos: AST en la muestra = Abs/min x VT x 1000 6,22 x Vm x Pl donde, VT es el volumen total del ensayo (3,3 ml), 6,22 es la constante, 1000 la conversin de unidades de ml a l, VM el volumen de la muestra en ml (0,3) y Pl el paso de la luz en cm (1). Valores de referencia: 25 C. hasta 22 UI/l Fundamento de la GPT 30 C hasta 28 UI/l 37 C hasta 40 UI/l.

(ALT): La ALT cataliza la transferencia de los

aminogrupos de L- alanina a ketoglutarato resultando en la formacin de piruvato y Lglutamato. La lactato deshidrogenasa cataliza la reduccin de piruvato y la oxidacin simultnea de NADH a NAD. La disminucin de absorbancia a 340 nm es directamente proporcional a la actividad de la ALT. ALT L-alanina + ketoglutarato Piruvato + NADH + H+ Procedimiento: Agua destilada (ml) Reactivo (ml) Blanco 3 Muestra 3
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piruvato + L- glutamato. LDH L- Lactato + NAD+ + H20

300 Suero ( l ) Leer la disminucin de la absorbancia cada minuto por 3 minutos y determinar el Abs/min. Clculos: ALT (GPT) = Abs/min x VT x 1000 6,22 x Vm x Pl donde VT es el volumen total del ensayo (3,3 ml), 6,22 una constante, 1000 el factor de conversin de unidades de ml a l, VM el volumen de la muestra en ml (0,3) y Pl el paso de la luz en cm (1). Valores de referencia: 25 C hasta 20 UI/l 30 C hasta 26 UI/l 37 C 38 UI/l

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