PEPTDEOS POLICATINICOS DO VENENO DE Apis mellifera POLYCATIONIC PEPTIDES FROM Apis melfera VENOM

Danilo Mourelle, Patrcia Brigatte, Nicoli Baro Baptista-Saidemberg, Paulo Csar Gomes, Mario Sergio Palma Campus de Rio Claro Instituto de Biocincias Cincias Biolgicas danilomourelle@ig.com.br
PIBIC/CNPq

RESUMO
Palavras-chave: atividades biolgicas; veneno de abelha; dor; inflamao Keywords: biological activity of bee venom, pain, inflammation

1.INTRODUO O veneno bruto de abelha Apis mellifera composto por uma srie de peptdeos, entre eles citamos a melitina, adolapina, procamina A e B, apamina, tertiapina, secapina, peptdeos desgranuladores de mastcitos, entre outros. Estas substncias apresentam diversas caractersticas j estudadas, dentre elas, efeitos antitumorais, atividades hiperalgsicas e/ou analgsicas, inflamatrias e/ou anti-inflamatrias (Son et al., 2007, para reviso). Estudos foram realizados por Gauldie e colaboradores (1976) com peptdeos presentes no veneno de abelha, particularmente, secapina e apamina. O peptdeo secapina foi descrito a cerca de 35 anos, e posteriormente no foi mais relatado na literatura (Gauldie et al., 1976), sendo pouco caracterizado em relao aos demais peptdeos. 2. OBJETIVO Uma vez que a composio desses venenos de insetos diversificada e rica, sua importncia farmacolgica, devido o interesse industrial e comercial, evidenciada. Em trabalho prospectivo de nosso grupo de pesquisas observou a presena de uma variante de secapina. Considerando-se que pouco ou nada foi relatado sobre este peptdeo na literatura, pouco se conhece a respeito de suas aes farmacolgicas, tais como possveis efeitos hiperalgsicos e/ou analgsicos, inflamatrios e/ou anti-inflamatrio e os mecanismos envolvidos nestes efeitos. Portanto, o presente trabalho teve como finalidade o estudo farmacolgico do peptdeo policatinico secapina, em sua forma polimorfica. 3. MATERIAL E MTODOS Como modelo animal foram utilizados camundongos Swiss, machos, pesando entre 27 e 30 gramas. Os animais foram mantidos com gua e rao ad libitum em uma sala apropriada com temperatura ambiente de 20 3C e ciclo claro/escuro (12:12 h), por um perodo mnimo de 3 dias antes dos experimentos. O presente projeto foi aprovado pelo Comit de tica no Uso de Animais do Instituto de Biocincias da Universidade Estadual Paulista campus Rio Claro (CEUA-IB-UNESP-CRC, Protocolo nmero: 1984) e obedeceram s normas propostas pela Associao Internacional para o Estudo da Dor. Para caracterizar os possveis efeitos hiperalgsicos/analgsicos da secapina foi utilizado o teste de avaliao da sensibilidade dolorosa denominado teste do von Frey eletrnico. Para a caracterizao do efeito inflamatrio/anti-inflamatrio da secapina foi utilizado o paqumetro digital para medir o volume da pata dos animais. No teste do von Frey eletrnico, uma medida de presso foi mensurada atravs de um transdutor conectado em um contador digital de fora (em gramas). O contato do transdutor pata foi realizado atravs de uma ponteira de polipropileno. Uma fora perpendicular crescente foi aplicada na rea central da superfcie plantar do membro posterior dos animais, para induo da flexo dorsal da articulao tbio-trsica, seguida da retirada da pata. O aparelho de medida de presso registrou automaticamente a intensidade da fora aplicada quando o membro do animal foi

retirado. O teste foi repetido at que se obtivessem trs medidas subseqentes, de tal forma que a variao entre as medidas no sejam maiores que 1 g. Os animais foram submetidos a este teste antes (tempo zero) e em diversos tempos aps a administrao, por via intraplantar, da secapina. Neste teste foi mensurado, portanto se a secapina apresentou efeito hiperalgsico ou analgsico. Para a avaliao do efeito inflamatrio ou antiinflamatrio da secapina, o volume da pata foi mensurado antes (tempo zero) e em diversos tempos aps a administrao, por via intraplantar da secapina, utilizando um paqumetro digital. Foi utilizado como controle a salina (veculo) e como controle positivo a carragenina que possui conhecido efeito algognico e inflamatrio. Para investigar os possveis mecanismos envolvidos nestes efeitos, foram realizados tratamentos farmacolgicos utilizando indometacina e zileuton (inibidores da sntese da via da ciclooxigenase e lipoxigenase, respectivamente). 4. RESULTADOS E DISCUSSO A secapina foi injetada por via intraplantar (i.pl.) nos camundongos, em diversas doses, tais como, 0,005, 0,35, 1, 2, 10, 30 g / 50 L e avaliados com tempos de 15, 30, 60, 120, 180, 240, 360, 480 e 1440 minutos para a avaliao do efeito hiperalgsico/analgsico (von Frey eletrnico) e efeito inflamatrio/antiinflamatrio (paqumetro). Os animais controles foram injetados com salina (S) e receberam as mesmas condies experimentais. A carragenina (controle positivo, Cg) foi injetada (300 g / 50 L), por via i.pl. Os resultados (Figura 01 A, B e C) mostram que a secapina induz efeito hiperalgsico a partir dos primeiros 15 minutos aps a administrao deste peptdeo. Cabe ressaltar que nos tempos de 15 e 30 minutos, as doses de 0,005, 0,35, 1 e 2 g/50 L, no apresentaram diferena significativa em relao aos animais injetados com carragenina (controle positivo). Este efeito hiperalgsico persiste at 240 minutos nas doses de 0,005 e 0,35 g/ 50L. E 480 minutos nas doses de 1 e 2 g/ 50L. A atividade edematognica foi avaliada usando-se o paqumetro digital (Figura 01 D, E e F). Os resultados mostram que tanto carragenina quanto as doses de secapina (0,35 e 0,005 g / 50 L), causaram um aumento significativo no volume da pata em relao ao grupo controle salina. Este efeito do peptdeo (0,35 e 0,005 g / 50 L) se inicia logo aps os primeiros 15 minutos aps a administrao da secapina e persiste por at 120 minutos, sendo comparado carragenina apenas nos primeiros 15 minutos (0,35 g/50 L). As dose de 1, 2, 10 e 30 g/50 L tambm induziu efeito edematognico que persistiu at 60 minutos aps a injeo deste peptdeo. A salina no apresentou efeito edematognico. Uma vez que a secapina induziu efeito hiperalgsico e edematognico, foi nosso prximo objetivo avaliar a participao de prostanides e de mediadores lipdicos, derivados da via da cicloxigenase e lipoxigenase, respectivamente, nestes efeitos. Para tanto, os camundongos foram injetados com secapina (Sec, 0,35 g/50 L), indometacina (Indo, 100 g /25 L, i.pl., inibidor da via ciclooxigenase) ou zileuton (Zil, 100 mg/kg, por via oral, em 500 L, inibidor da via lipoxigenase) e avaliados no teste do von Frey eletrnico e paqumetro digital (edema).

Os resultados mostraram que o zileuton reverteu totalmente a hiperalgesia e edema induzido pela secapina na primeira hora do perodo experimental quando comparado ao grupo controle administrado com salina e secapina (Figura 02 A e B).

Figura 01: Efeito hiperalgsico e edematognico da secapina. O limiar nociceptivo est

repre senta d o pelo delta () d a fora (em gram as) necessria para a retirada da pata e o efeito edematognico foi avaliado atravs de paqumetro digital. As medidas foram realizadas antes (tempo 0), 15, 30, 60, 120, 180, 240, 360, 480 e 1440 minutos aps a administrao da secapina (A e D - 0,005 e 0,35 g/50 L / B e E 1 e 2 g/50 L / C e F 10 e 30 g/50 L, i.pl.) ou carragenina (Cg, 300 g/50 L, i.pl.). O grupo controle foi composto por animais injetados com soluo salina estril (S). Os resultados foram expressos como mdia SEM de 5 animais por grupo. * p<0,001 em relao ao grupo Salina (S); # p<0,001 em relao ao grupo Carragenina (Cg).

Figur a 02. Efeito d o tratamento com indometacina e zileuton sobre a sensibilidade dolorosa e sobre o efeito edematognico da secapina. O limiar nociceptivo est representado pelo delta () da fora (em gramas) necessria para a retirada da pata (A). O efeito edematognico foi avaliado atravs de paqumetro digital (B). As medidas foram realizadas antes (tempo 0), e 1 hora aps a administrao da secapina (0,35 g/50 L, i.pl.). A indometacina (Indo, 100 g/25 L, i.pl.,) e zileuton (Zil, 100 mg/kg, por via oral, em 500 L) foram administrados 1 hora e 30 minutos e 2 hora antes da administrao da secapina, respectivamente. O grupo controle foi composto por animais injetados

com soluo salina+secapina (Sec + S). Os resultados foram expressos como mdia SEM de 5 animais por grupo. * p<0,001 em relao ao grupo salina+secapina (Sec + S).

No h relatos de estudos sistemticos em relao secapina. O nico trabalho existente em relao a este peptdeo foi o realizado por Gauldi e colaboradores (1976), mostrando que este peptdeo no possui efeito txico. Portanto, tornam-se relevantes estudos sistemticos para se investigar os possveis efeitos deste peptdeo. Diferentemente do encontrado para a secapina, h diversos trabalhos mostrando diferentes atividades para o veneno bruto de abelha da espcie Apis mellifera e/ou de substncias isoladas deste veneno (Brigatte et al., 2011). Lariviere e Melzack (1996) relataram os primeiros dados experimentais utilizando o veneno bruto de abelha e ratos. Estes autores mostraram que a administrao i.pl. do veneno bruto de abelha induz hiperalgesia de maneira dose-dependente. Porm, estes dados no foram sinrgicos aos resultados observados para o efeito edematognico. Chen e colaboradores (1999), utilizando outro modelo de avaliao de sensibilidade dolorosa (filamentos de von Frey) mostraram que o efeito hiperalgsico apresentado pela administrao do veneno bruto mais persistentes dos que os relatados por Lariviere e Melzack (1996). Alm disso, houve sinergismo entre os dados apresentados para a hiperalgesia e efeito edematognico. Cabe ressaltar que diferentes modelos experimentais e linhagens de animais podem explicar a divergncia de dados encontrados. Estudos realizados por pesquisadores de nosso laboratrio demonstraram que a melitina, peptdeo mais abundante e mais importante encontrado no veneno bruto de abelha Apis mellifera, mostrou que esta substncia induz potente efeito hiperalgsico e edematognico, avaliado no Von Frey eletrnico. Ainda, este trabalho mostra que estes efeitos so mediados pela via da lipoxigenase (Brigatte et al., 2011). Estes dados corroboram com os nossos ora encontrados, mostrando que mediadores lipdicos so extremamente relevantes no processo doloroso (hiperalgesia) e inflamatrio (edema) induzido pelo veneno de abelha e/ou por substncias isoladas deste veneno. 5. CONCLUSES O estudo de produtos naturais com atividades teraputicas tem sido alvo importante de muitos pesquisadores. A secapina, um peptdeo presente no veneno bruto da abelha, no havia sido sistematicamente estudada at o presente trabalho. At o presente momento, mostramos que a secapina nas doses de 0,005, 0,35, 1, 2, 10, 30 g/50 L induz efeitos hiperalgsico e edematognico. Ainda, avaliamos o envolvimento de prostanides e de mediadores lipdicos na hiperalgesia e edema induzida pela secapina. A via das lipoxigenases, mas no a da cicloxigenase, est envolvida com os efeitos hiperalgsicos e edematognicos da secapina, mostrando que mediadores lipdicos medeiam estes processos. Estes resultados indicam que o peptdeo secapina contribui com a inflamao e dor induzido por venenos da espcie Apis mellifera. 6. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS BRIGATTE, P.; CURY, Y.; DE SOUZA, B.M.; BAPTISTA-SAIDEMBERG, N.B.; SAIDEMBERG, D.M.; GUTIERREZ, V.P.; PALMA, M.S. Hyperalgesic and edematogenic effects of peptides isolated from the venoms of honeybee (Apis mellifera) and neotropical social wasps (Polybia paulista and Protonectarina sylveirae). Amino Acids, 2011. 101p. CHEN, J.;C LUO, C.; LI, H.L.; CHEN, H.S. Primary hyperalgesia to mechanical and heat stimuli following subcutaneous bee venom injection into the plantar surface of hindpaw in the conscious rat: a comparative study with the formalin test. Pain, 1999. 67p. GAULDIE, J.; HANSON, J. M.; RUMJANEK, F. D.; SHIPOLINI, R. A.; VERNON, C. A. The Peptide Components of Bee Venom. Eur. J. Biochem, 1976. 369 p.

LARIVIERE, W.R.; MELZACK, R. The bee venom test: a new tonic-pain test. Pain, 1996. 271p.