Tese Final Ffa e Omega3

PRODUO ENZIMTICA DE LPIDOS ESTRUTURADOS, RICOS EM CIDOS GORDOS POLINSATURADOS MEGA-3, EM REACTOR DE ALTA PRESSO
Joana Mendes Madeira Rodrigues
Dissertao para obteno do Grau de Mestre em Engenharia Alimentar

Orientador: Doutora Maria Suzana Leito Ferreira Dias Vicente Co-orientador: Doutora Natlia Maria Ferreira Rebelo de Melo Osrio
Jri: Presidente: - Doutora Margarida Gomes Moldo Martins, Professora Auxiliar do Instituto Superior de Agronomia da Universidade Tcnica de Lisboa. Vogais: - Doutora Maria Henriques Loureno Ribeiro, Professora Associada da Faculdade de Farmcia da Universidade de Lisboa; - Doutora Maria Suzana Leito Ferreira Dias Vicente, Professora Auxiliar do Instituto Superior de Agronomia da Universidade Tcnica de Lisboa; - Doutora Natlia Maria Ferreira Rebelo de Melo Osrio, Professora Auxiliar Convidada do Instituto Superior de Agronomia da Universidade Tcnica de Lisboa.
Lisboa, 2011
Produo Enzimtica de Lpidos Estruturados ricos em cidos gordos mega-3, em reactor de alta presso
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AGRADECIMENTOS Um especial agradecimento Professora Suzana Ferreira Dias pelas preciosas orientaes facultadas no decorrer deste trabalho, pelo seu optimismo e permanente disponibilidade.
Professora Natlia Osrio, pelo co-orientao desta tese e pelos conhecimentos transmitidos especialmente durante a fase laboratorial do trabalho. Professora Maria Henriques pelo apoio, durante a realizao dos ensaios de interesterificao a altas presses na FFUL. Agradeo tambm ao Professor Alfaia e ao Doutor Hlder, da FFUL, sempre prontos para me auxiliarem com o vaso das altas presses. A todos os elementos docentes e no docentes do Departamento de Agro-Indstrias do ISA e D. Nomia do laboratrio de Qumica-Fsica da FFUL. FIMA/VG, Produtos Alimentares, Lda, pelo apoio prestado ao fornecerem de forma gratuita os leos e gorduras utilizados neste trabalho e por terem disponibilizado o aparelho de NMR. Novozymes A/S (Dinamarca) pelo fornecimento dos biocatalisadores Lipozyme TL IMTM, Lipozyme RM IMTM e Novozym 435TM e EPAX, AS (Noruega) pelo fornecimento do EPAX 4510TG, sem os quais este trabalho no teria sido possvel. E por ltimo, minha famlia, amigos e colegas, especialmente minha me, que sempre me ajudou e apoiou incondicionalmente em todos os momentos da minha vida.
Produo Enzimtica de Lpidos Estruturados ricos em cidos gordos mega-3, em reactor de alta presso RESUMO
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Com este trabalho pretendeu-se estudar o efeito das altas presses na cintica da interesterificao enzimtica de misturas reaccionais de estearina de palma (PS), leo de palmiste (PK) e um concentrado de triacilgliceris enriquecido em cidos gordos polinsaturados mega-3 (n-3 PUFA) "EPAX 4510 TG", em meio livre de solvente. A interesterificao de gorduras permite melhorar as suas propriedades fsicas e funcionais, atravs da modificao do perfil de triacilgliceris, produzindo assim lpidos estruturados que podem ser incorporados em margarinas e shortenings. As reaces decorreram a 60 C, presso atmosfrica (0,1 MPa) e a 25, 50, 75 e 100 MPa. Os 4 biocatalisadores (Lipozyme RMIMTM", "Lipozyme TLIMTM", "Novozym 435TM" e a lipase/aciltranferase de C. parapsilosis) foram reutilizados em 6 batches consecutivos de 3h, com meio fresco. A actividade de interesterificao foi acompanhada atravs das alteraes no teor de gordura slida a 35 C (SFC35C) da mistura reaccional. A "Lipozyme RMIMTM" e a lipase/aciltransferase diminuram a sua actividade com o aumento da presso. J as lipases "Lipozyme TLIMTM" e "Novozym 435TM" aumentaram a sua actividade. Os melhores resultados em termos de estabilidade operacional foram observadas para a "Lipozyme TLIMTM". Neste trabalho tambm se determinaram os cidos gordos livres (FFA) e os produtos de oxidao.
Palavras-chave: cidos gordos polinsaturados mega-3, altas presses, interesterificao, lipases imobilisadas, lipidos estruturados.
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Produo Enzimtica de Lpidos Estruturados ricos em cidos gordos mega-3, em reactor de alta presso ABSTRACT
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The aim of this work was to study the effect of high pressure in the enzyme-catalyzed interesterification kinetics of ternary blends of palm stearin (PS), palm kernel oil (PK) and triacylglycerols rich in omega-3 polyunsaturated fatty acids (n-3) PUFA (EPAX 4510 TG, EPAX AS, Norway), carried out in solvent free medium, batchwise. The interesterification of natural blends will improve certain physical and nutraceutical properties by modification of their acylglicerol profile, creating structured lipids to be incorporated in margarines and shortenings. Reactions were carried out at 60 C at atmospheric pressure (0,1 MPa) and at 25, 50, 75 and 100 MPa. The 4 biocatalysts (Lipozyme RMIMTM, Lipozyme TLIMTM; Novozym 435TM and the lipase/acyltranferase from C. parapsilosis) were reused in consecutive 3h-batches, in a total of 6 batches, using fresh medium. The interesterification activity was accompanied by changes in the solid fat content at 35 C (SFC35 C). Lipozyme RMIMTM and the lipase/acyltransferase decreased their activity with increasing pressure. Conversely, Lipozyme TLIMTM and Novozym 435TM increased their activity with increasing pressure. The best results in terms of operational stability were observed for Lipozyme TLIMTM. In this work, free fatty acids (FFA) and oxidation products were also assayed.
Keywords: High pressure, immobilized lipase, interesterification, omega-3 polyunsaturated fatty acids, structured lipids.
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Produo Enzimtica de Lpidos Estruturados ricos em cidos gordos mega-3, em reactor de alta presso LONG ABSTRACT
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In the last years, the production of structured lipids (SLs) or tailor made fats, with desired physical and chemical properties and/or nutritional benefits, has greatly increased. The functional properties of fats are determined by their fatty acid composition and by the distribution pattern of fatty acids in triacylglycerols (TAGs). By rearranging the acyl residues on the acylglycerol backbone, it is possible to modify the acylglycerol profile. Particularly, the production of SLs enriched in omega-3 polyunsaturated fatty acids (n-3 PUFA), such as eicosapentaenoic acid (EPA 20:5(n-3)) and docosahexaenoic acid (DHA, 22:6(n-3)), has had a great development due to their known benefits in human health, namely the prevention of heart diseases, therapeutic effect on acute and chronic inflammatory diseases, and vital effects on neurological development (including cognitive function) and mental health. These SLs can be incorporated in margarines, shortenings and other fat products. The improvement of physical properties of fat blends (e.g. melting point, solid fat content (SFC)) is also achieved by modification of the acylglycerol pattern. In the manufacturing of margarine, plastic fats can be produced by hydrogenation, fractionation or
interesterification. The hydrogenation process leads to the conversion of polyunsaturated fatty acids into saturated fatty acids, with consequent loss of essential fatty acids, as well as leading to the formation of trans fatty acids, which cause health problems. Currently, the hydrogenation is being abandoned in favor of chemically or lipase catalyzed
interesterification. It consists in the exchange of acyl groups between molecules of TAGs, with modification of rheological properties of fat without changing their fatty acid composition. In the field of oils and fats, the use of lipases as catalysts for the production of SLs with functional and specific properties has greatly increased during the last decades. Lipases are enzymes which catalyze the hydrolysis of esters in aqueous medium. However, when these enzymes are in organic media with low water activity(aw), they catalyze both esterification and interesterification reactions. In industry, chemical interesterification is carried out in the presence of a metal catalyst, and consists in the interchange of acyl groups at random, leading to the formation of a considerable amount of side products. In the contrary, enzymatic interesterification with n-1,3 specific lipases creates TAGs that are regiospecifically modified or restructured to meet special functions, with higher yields. The use of lipases as biocatalysts for the production of SLs has other important benefits besides regiospecificity: (i) availability of lipases from a wide range of sources, (ii) the efficiency of lipases under mild conditions
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(temperature<70C), (iii) reducing energetic costs, natural process and (iv) reduced environmental pollution (Xu, 2000). Many factors influence the activity and stability of enzymes: temperature, aw, pressure and the presence of inhibitors of enzyme activity (e.g. products of lipid oxidation and free fatty acids (FFA)). High pressure has been ascribed to inactivate lipases. In fact, pressure can activate or inhibit enzymatic activities, depending on the proteins and conditions. It can also modify the rate-limiting step, or modulate the enzyme selectivity.
The aim of this work was to study the effect of high pressure in the enzyme-catalyzed interesterification kinetics of ternary blends of palm stearin (PS), palm kernel oil (PK) and triacylglycerols rich in n-3 PUFA (EPAX 4510 TG, EPAX AS, Norway). The interesterification reaction was carried out in solvent free medium, batchwise, at 60 C, at atmospheric pressure (0,1 MPa) and at 25, 50, 75 and 100 MPa. Three commercial immobilized lipases (Lipozyme RM IMTM, Lipozyme TL IMTM; Novozym 435TM) and the lipase/acyltranferase from Candida parapsilosis immobilized on Accurel MP 1000 were reused in consecutive 3h-batches, in a total of 6 batches, using fresh medium. "Lipozyme RM IM" and "Lipozyme TL IM" incorporate n-3 PUFA in n-1,3 specific positions, keeping the fatty acids in position n-2 (Xu, 2000). Lipase "Novozym 435TM" has a specificity that depends on the substrate where it operates. In some reactions this enzyme acts as a nonspecific lipase, while in other reactions reveals a positional specificity (n-1, 3). As in the food industry, the interesterification activity of the biocatalysts was accompanied by changes in the solid fat content at 35C (SFC35 C). The SFC35 C is particularly important for table margarines since it is related to the extent of melting in the mouth, and must be as low as possible, to prevent a sandy texture. Lipozyme RM IMTM and the lipase/acyltransferase decreased their catalytic activity with increasing pressure. Conversely, Lipozyme TL IMTM and "Novozym 435TM" increased their activity with increasing pressure. The best results in terms of operational stability studies were observed for Lipozyme TL IMTM. In this work, FFA and oxidation products were also assayed. The presence of FFA in the reaction mixture, has been a limiting factor in getting better yields in comparison with the traditional method of chemical interesterification. The levels of FFA in reaction mixtures interesterified at high pressures were very similar to the levels of FFA in reaction mixtures interesterified at atmospheric pressure. As such, we can conclude that the pressure did not influence this parameter
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With respect to first and final oxidation products, the levels were higher in the reaction mixtures interesterified at high pressures than in those interesterified at atmospheric pressure. It can be concluded that pressure promoted changes in the structure of the fat through an unknown mechanism that leads to the formation of compounds, which absorb in the same wavelength of the oxidation products. This preliminary study showed that interesterification catalyzed by immobilized enzymes, can be an alternative to the traditional process of chemical interesterification. It also demonstrated that it is possible to perform enzymatic interesterification under conditions generally regarded as unfavorable for enzymatic activity. This environmentally friendly process improves enzymatic activity; modifies the selectivity of biocatalysts and allows the synthesis of structured lipids different from those obtained at atmospheric pressure.
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Produo Enzimtica de Lpidos Estruturados ricos em cidos gordos mega-3, em reactor de alta presso NDICE GERAL
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AGRADECIMENTOS .................................................. ERRO! MARCADOR NO DEFINIDO. RESUMO .............................................................................................................................. II ABSTRACT ..........................................................................................................................III LONG ABSTRACT .............................................................................................................. IV NDICE DE FIGURAS .......................................................................................................... IX NDICE DE QUADROS ........................................................................................................ XI LISTA DE ABREVIATURAS E SMBOLOS........................................................................ XII 1. ENQUADRAMENTO DO TEMA: OS LPIDOS ESTRUTURADOS ................................ 1 1.1 2 OBJECTIVOS........................................................................................................................ 4
ENQUADRAMENTO TERICO..................................................................................... 5 2.1 PROPRIEDADES FISICO-QUMICAS DAS GORDURAS ............................................ 5 PROPRIEDADES QUMICAS DAS GORDURAS ................................................... 5 PROPRIEDADES FSICAS DAS GORDURAS ....................................................... 8
2.1.1 2.1.2
2.2 TCNICAS DE MODIFICAO DAS PROPRIEDADES FSICO-QUMICAS DAS GORDURAS .................................................................................................................................... 14 2.2.1 2.2.2 2.2.3 HIDROGENAO ...................................................................................................... 14 FRACCIONAMENTO ................................................................................................. 16 INTERESTERIFICAO ........................................................................................... 17
2.3 PARMETROS QUE INFLUENCIAM A ACTIVIDADE E ESTABILIDADE ENZIMTICAS ................................................................................................................................ 24 2.4 MARGARINAS E CREMES DE BARRAR ...................................................................... 30
2.4.1 A TECNOLOGIA DE PRODUO DE MARGARINAS E CREMES DE BARRAR ...................................................................................................................................... 31 3 MATERIAIS E MTODOS ............................................................................................35 3.1 3.2 MATERIAIS ......................................................................................................................... 35 MTODOS ........................................................................................................................... 37
3.2.1 ENSAIOS DE INTERESTERIFICAO ENZIMTICA PRESSO ATMOSFRICA .......................................................................................................................... 37 3.2.2 ENSAIOS DE REUTILIZAO DO BIOCATALISADOR PRESSO ATMOSFRICA .......................................................................................................................... 38 vii
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3.2.3 ENSAIOS DE INTERESTERIFICAO ENZIMTICA EM REACTOR DE ALTA PRESSO.................................................................................................................................... 39 3.2.4 3.2.5 DETERMINAO DO TEOR DE GORDURA SLIDA A 35 C ......................... 41 DETERMINAO DOS CIDOS GORDOS LIVRES........................................... 42
3.2.6 DETERMINAO DOS PRODUTOS DE OXIDAO PRIMRIOS E SECUNDRIOS.......................................................................................................................... 43 4 RESULTADOS E DISCUSSO ....................................................................................45 4.1 EFEITOS DA AGITAO NA CINTICA DA REACO ............................................ 45
4.2 EFEITOS DA PRESSO NA ACTIVIDADE DE INTERESTERIFICAO E NA ESTABILIDADE ENZIMTICA ..................................................................................................... 47 4.3 4.4 5 6 EFEITO DA PRESSO NA REACO DE HIDRLISE ............................................. 52 EFEITO DA PRESSO NA OXIDAO DA MISTURA REACCIONAL .................... 53
CONCLUSES E SUGESTES PARA FUTUROS TRABALHOS...............................56 REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS .............................................................................58
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Produo Enzimtica de Lpidos Estruturados ricos em cidos gordos mega-3, em reactor de alta presso NDICE DE FIGURAS
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Figura 1. Polimorfismo dos triacilgliceris: forma (cristais do sistema hexagonal), forma (cristais do sistema triclnico) e forma (cristais do sistema ortorrmbico) (Fonte: Smith, 2008). .................................................................................................................................... 9 Figura 2. Hidrogenao: o hidrognio gasoso reage com as duplas ligaes dos cidos gordos insaturados [1]. .........................................................................................................15 Figura 3.Tipos de reaces catalisadas por lipases (Fonte: Saxena et al., 1999). ...............20 Figura 4. Reaco de interesterificao: (A) com catalisador qumico ou catalisador enzimtico no especfico; (B) com lipase 1,3 especfica (Fonte: Macrae, 1983). ................21 Figura 5. Esquema geral de fabrico de margarinas (Fonte: Faur, 1996). .............................32 Figura 6. Reactor de vidro de parede dupla. ........................................................................37 Figura 7. Esquema (A) e fotografia (B) do aparelho de alta presso: vaso de altas presses (1) , tubo de ao (2), vlvula (3), manmetro (4), bomba manual (5), bujo (6), clulas de reaco (7) e banho termostatizado (8). ...............................................................................39 Figura 8. Vaso de altas presses (topo) contendo leo hidrulico Enerpac HF95Y (A); tubos de propileno com tampa de rosca e capacidade para 7mL de mistura reaccional (B); colocao dos tubos no reactor (C). .....................................................................................39 Figura 9. Ponto de viragem da titulao dos cidos gordos livres presentes na amostra com uma soluo de NaOH 0,1 N, identificvel pelo aparecimento de um tom rosa plido..........42 Figura 10. Evoluo dos valores de SFC 35 C da mistura reaccional ao longo dos sucessivos batches de interesterificao catalisados pela Novozym 435 TM, com agitao (A) e sem agitao (B), presso atmosfrica e a 60 C......................................................................45 Figura 11. Evoluo da percentagem de reduo dos valores de SFC35 C da mistura reaccional ao longo do tempo (h), durante as sucessivas utilizaes da enzima Novozym 435TM nos ensaios de interesterificao, com agitao (A) e sem agitao (B), presso atmosfrica e a 60 C. ..........................................................................................................46 Figura 12. Evoluo da percentagem de reduo dos valores de SFC 35 C da mistura reaccional no final de cada batch de 3 horas, durante os ensaios de interesterificao,
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catalisados pela enzima Novozyme 435 TM com agitao (A) e sem agitao (B), presso atmosfrica e a 60 C. ..........................................................................................................46 Figura 13.Valores de SFC 35 C das misturas interesterificadas por Lipozyme RM IM (A) e Lipozyme TL IM (C), a diferentes presses, aps cada utilizao de 3h e respectivas percentagens de reduo de SFC35 C (B) e (D). ...................................................................49 Figura 14. Valores de SFC 35 C das misturas interesterificadas por Novozym 435 (A) e pela lipase/aciltransferase de Candida parapsilosis (C) a diferentes presses, aps cada utilizao de 3h e respectivas percentagens de reduo de SFC35 C (B) e (D). ....................50 Figura 15. Actividade relativa de Lipozyme RM IM, Lipozyme TL IM, Novozym 435 e da lipase/aciltransferase de Candida parapsilosis nos ensaios a 60 C presso atmosfrica, sem agitao, e nos ensaios a altas presses (25, 50 e 100 MPa), (A) (B) (C) e (D) respectivamente. ..................................................................................................................51 Figura 16. Evoluo dos teores de cidos gordos livres presentes nas misturas reaccionais, submetidas a reaces de interesterificao a 0,1 MPa e a altas presses (25, 50 e 100 MPa), ao longo dos 6 batches, pelas enzimas Lipozyme RM IMTM (A), Lipozyme TL IMTM (B), Novozym 435TM e pela lipase/aciltransferase de Candida parapsilosis (C). .................52
Produo Enzimtica de Lpidos Estruturados ricos em cidos gordos mega-3, em reactor de alta presso NDICE DE QUADROS
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Quadro 1. Poupana a nvel ambiental, por unidade de produo (1000 kg produto processado), ao optar pela interesterificao por via enzimtica em detrimento da interesterificao qumica (Cowan, 2008). ............................................................................22 Quadro 2. Teores de produtos primrios e secundrios de oxidao formados durante os ensaios de interesterificao presso atmosfrica, catalisados por Novozym 435TM, em reactor, com e sem agitao, e temperatura de 60 C. ......................................................54 Quadro 3. Teores de produtos primrios e secundrios de oxidao, formados durante os ensaios de interesterificao presso atmosfrica, catalisados por Lipozyme TLIM, Lipozyme RM IM, Novozym 435 e pela lipase/aciltransferase de Candida parapsilosis, em reactor de altas presses, temperatura de 60 C. ..............................................................55
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Produo Enzimtica de Lpidos Estruturados ricos em cidos gordos mega-3, em reactor de alta presso LISTA DE ABREVIATURAS E SMBOLOS
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AGL cidos gordos livres aw Actividade da gua DAG Diacylgycerols diacilgliceris DHA - cido docosa-hexenico, C22:6 EPA - cido eicosa-pentenico, C20:5 EPAX 4510 TG - Concentrado de TAG enriquecido em omega-3 PUFA (45% de EPA, e 10% de DHA) FFA - Free Fatty Acids- cidos gordos livres HDL High Density Lipoproteins lipoprotenas de alta densidade LCFA Long chain fatty acids cidos gordos de cadeia longa LDL Low Density Lipoproteins- lipoprotenas de baixa densidade NMR Nuclear Magnetic Ressonance- ressonncia magntica nuclear MAG Monoacylglicerols monoacilgliceris MUFA Monounsaturated fatty acid cidos gordos monoinsaturados MCFA Medium chain fatty acids cidos gordos de cadeia mdia n-3 PUFA - Omega-3 Polyunsaturated Fatty Acids- cidos gordos polinsaturados mega-3 PUFA Polyunsaturated Fatty Acids cidos gordos polinsaturados SCFA Short-Chain Fatty acids cidos gordos de cadeia curta SFC- Solid Fat Content Teor de gordura slida medido por NMR SFC35 C Teor de gordura slida medido por NMR a 35 C SFC30 C Teor de gordura slida medido por NMR a 30 C SFC20 C Teor de gordura slida medido por NMR a 20 C
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Produo Enzimtica de Lpidos Estruturados ricos em cidos gordos mega-3, em reactor de alta presso SFC10 C Teor de gordura slida medido por NMR a 10 C SFI Solid Fat Index - ndice de gordura slida TAG Triacylglycerols - triacilgliceris
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1. ENQUADRAMENTO DO TEMA: OS LPIDOS ESTRUTURADOS Nos pases desenvolvidos, as sociedades humanas tornaram-se menos rurais e mais urbanas, e a actividade econmica passou a ser menos centrada na agricultura e mais industrializada. Essas mudanas trouxeram melhorias em muitos aspectos da qualidade de vida, entre os quais se salienta uma dieta mais variada e segura, associadas a uma longevidade crescente. Tornou-se mais difcil equilibrar a ingesto e o gasto de energia, o que resultou no aumento da obesidade em todo o mundo e na prevalncia de doenas crnicas no transmissveis, por exemplo, hipertenso, doenas cardiovasculares e diabetes tipo 2. sabido que a dieta contribui para a sade. Uma avaliao dos benefcios e dos efeitos adversos dos nutrientes e de outros componentes na dieta levou descoberta de que possvel criar alimentos com caractersticas especficas capazes de influenciar o funcionamento do corpo em nveis que vo alm das necessidades nutricionais bsicas. Esses alimentos passaram a ser conhecidos como funcionais. A primeira explorao sistemtica dos aspectos positivos da funcionalidade dos alimentos foi realizada no Japo. Na 2 metade da dcada de 90, a FUFOSE (Functional Food Science in Europe) criou uma definio de alimento funcional como sendo aquele alimento para o qual foi satisfatoriamente demonstrado ser capaz de afectar beneficamente uma ou mais funes alvo no organismo, alm de seus efeitos nutricionais adequados, de modo que tenha relevncia na melhoria do estado de sade e bem estar e/ ou diminuio do risco de doena. Neste contexto funo alvo uma actividade biolgica em curso no organismo humano e que o alvo para interveno, tendo em vista a manuteno ou melhoria da sade e do bem estar e/ou diminuio do risco de doena. O alimento funcional no uma plula, cpsula ou qualquer forma de suplemento nutricional, mas sim um alimento consumido como parte do padro normal de alimentao (Howlett, 2008). Apesar de a maioria das substncias naturais com efeitos benficos para a sade ser de origem vegetal, tambm existem alguns componentes fisiologicamente activos em produtos de origem animal. Um exemplo disso so os cidos gordos mega-3 (n-3), uma classe essencial de cidos gordos polinsaturados (polyunsaturated fatty acids, PUFA) presentes no leo de peixes gordos (e.g. salmo, atum, cavala, sardinha e arenque). Neste classe de cidos gordos encontram-se o cido eicosapentenico (EPA; 20:5) e o cido docosahexenico (DHA; 22:6) (Hasler, 1998). Estas substncias promovem a melhoria na integridade endotelial e arterial, alm de combaterem a coagulao sangunea e reduzirem a 1
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presso arterial. Tambm diminuem os nveis plasmticos de triacilgliceris (TAGs) e exercem efeitos supressivos no sistema imunitrio (Howlett, 2008). Quando os cidos gordos n-3 substituem os cidos gordos saturados na dieta, a concentrao de colesterol total e de triglicridos baixa (Phillipson et al., 1985). Existe um vasto nmero de artigos que demonstram como o seu consumo tem efeitos benficos, especialmente a nvel cardiovascular, reduzindo significativamente a mortalidade por doenas coronrias, o nmero de enfartes do miocrdio e acidentes vasculares cerebrais (Wang et al, 2006). As populaes com elevado consumo de peixe, como os Esquims e os Japoneses, tm baixas taxas de enfartes do miocrdio (Weber, 1989). Estudos epidemiolgicos mostraram um decrscimo na mortalidade por doena cardaca nas pessoas que consomem quantidades relativamente pequenas de peixe (0,5 g cidos gordos n-3/dia ou 1,5 g de leo de peixe/dia) durante um longo perodo de tempo (Kromhout et al., 1985). Estes estudos sugerem que pequenas doses durante longos perodos de tempo tm efeitos benficos, possivelmente por reduzirem a presso arterial e outros factores de risco. Os n-3 PUFA so tambm agentes anti-inflamatrios potenciais. Como tal, podem ter efeito teraputico em doenas inflamatrias agudas e crnicas. H fortes evidncias clnicas da sua eficcia, por exemplo, na artrite reumatide (Calder, 2006). Pensa-se que os efeitos mais promissores destas substncias no futuro, sero a nvel do desenvolvimento neurolgico (incluindo a funo cognitiva) e da sade mental. Os EPA e DHA so importantes componentes do crebro e dos tecidos nervosos e desempenham uma funo essencial no desenvolvimento destes rgos, em particular durante o ltimo trimestre de gravidez e durante a infncia (Pike e Jackson, 2010). Neste contexto, tm sido realizados estudos para a produo de novos lpidos com propriedades funcionais, i.e., lpidos estruturados (structured lipids, S.L.). Os S.L. so misturas de TAGs, modificados qumica ou enzimaticamente, atravs da incorporao de novos cidos gordos e/ou alterao na sua distribuio posicional nas molculas de glicerol (n-1, 3 ou 2) (Lee e Akoh, 1998). Dito de outra forma, os S.L. so misturas de TAGs com uma estrutura molecular definida (i. e., cidos gordos especficos em posies especficas). A estrutura molecular dos TAGs influencia o seu destino metablico no organismo (i.e. digesto e absoro) tal como as suas caractersticas fsicas (e.g. ponto de fuso, polimorfismo, teor de gordura slida) e caractersticas qumicas (e.g. estabilidade oxidativa). 2
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Criar TAGs com uma estrutura qumica particular permite controlar o comportamento dos mesmos, melhorando as suas propriedades nutricionais e farmacuticas. Os S.L. podem ser produzidos, dependendo do tipo de substrato disponvel, por um dos seguintes mtodos: alcolise, acidlise ou interesterificao (Lee e Akoh, 1998). Na indstria de margarinas, as gorduras plsticas utilizadas podem ser produzidas por hidrogenao, fraccionamento ou interesterificao. O processo de hidrogenao leva converso dos cidos gordos polinsaturados em saturados, com consequente perda de cidos gordos essenciais, para alm de originar a formao de gorduras trans, que causam problemas de sade. Actualmente, a hidrogenao est a ser abandonada em favor da interesterificao, que consiste na troca de grupos acilo entre molculas de TAG, com modificao das propriedades reolgicas das gorduras, sem alterar a sua composio em cidos gordos. O fraccionamento limitado pelas fontes de gordura e a variedade de produtos. A interesterificao compreende a interesterificao qumica e a interesterificao catalisada por lipases (Xu, 2000). Recentemente, os investigadores tm apostado na interesterificao catalisada por lipases devido s vantagens inerentes ao processo: A interesterificao catalisada por lipases mais especfica, especialmente quando so utilizadas lipases 1,3-especficas, Permite produzir tailor made fats, que possuem propriedades fsicas ou nutricionais desejveis, Disponibilidade de diversas fontes de lipases (Xu, 2000), O processo natural e ecolgico, uma vez que ocorre em condies mais suaves de temperatura e presso, reduzindo o custo energtico e melhorando a aceitao por parte dos consumidores (Nascimento et al., 2004), Eliminao de reaces secundrias indesejveis e consequente aumento do rendimento e da pureza do produto.
Produo Enzimtica de Lpidos Estruturados ricos em cidos gordos mega-3, em reactor de alta presso 1.1 OBJECTIVOS
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O presente trabalho surge na sequncia de estudos anteriores sobre o efeito das altas presses: (i) na cintica da produo de lpidos estruturados enriquecidos em n-3 PUFA, em meio livre de solvente, por interesterificao enzimtica, e (ii) nas caractersticas fsicas dos S.L. obtidos (Osrio et. al, 2008; Lopes, 2009). Os quatro biocatalisadores utilizados foram as preparaes comerciais das lipases termoestveis imobilizadas de Rhizomucor miehei (LipozymeTM RMIM), Thermomyces lanuginosa (LipozymeTM TLIM) de Candida antarctica (NovozymeTM 435), e a lipase/aciltransferase de Candida parapsilosis, como alternativa s lipases comerciais. A Lipozyme RMIM e a Lipozyme TLIM apresentam selectividade 1,3, ou seja incorporam os n-3 PUFA nestas posies especficas, mantendo os cidos gordos na posio n-2 (Xu, 2000). A lipase Novozym 435 apresenta uma especificidade que depende dos substratos onde actua. Em algumas reaces esta enzima funciona como uma lipase no especfica, enquanto noutras reaces revela uma especificidade posicional n-1,3 (Novo Nordisk Biochem, 1999). O meio reaccional era constitudo por uma mistura de estearina de palma (palm stearin, PS), leo de palmiste (palm kernel, PK) e um concentrado de triacilgliceris enriquecido em cidos gordos n-3 PUFA (EPAX 4510 TG, EPAX AS, Norway). As reaces decorreram a 60 C, e a presses de 0,1 (presso atmosfrica), 25, 50 e 100 MPa. Avaliou-se tambm a estabilidade operacional dos 4 biocatalisadores testados, em ensaios sucessivos de reutilizao s diferentes presses, e por perodos de 3 horas cada. Em todos os ensaios foram monitorizadas as modificaes nas caractersticas reolgicas da mistura atravs da determinao do teor de gordura slida a 35 C, por espectrofotometria de ressonncia magntica nuclear (nuclear magnetic resonance, NMR). Foram tambm efectuadas determinaes de cidos gordos livres e dos produtos de oxidao primrios e secundrios formados durante a reaco, para avaliar respectivamente a extenso das reaces degradativas de hidrlise e oxidao.
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2 2.1
ENQUADRAMENTO TERICO PROPRIEDADES FISICO-QUMICAS DAS GORDURAS
Os lpidos so nutrientes essenciais na dieta humana: so fontes concentradas de energia (9 kcal/g); os cidos gordos essenciais so precursores das prostaglandinas (hormonas necessrias regulao de vrias funes vitais); so veculos de transporte para as vitaminas lipossolveis (vitaminas A, D, E e K) e so necessrios para o desenvolvimento e crescimento do corpo humano. As gorduras desempenham ainda um importante papel a nvel das propriedades funcionais e sensoriais nos produtos alimentares (McGrady,1993). Melhoram sensorialmente os alimentos que consumimos, a nvel da textura, flavour, palatibilidade e contribuem para a sensao de saciedade. 2.1.1 PROPRIEDADES QUMICAS DAS GORDURAS Mais de 95% dos leos e gorduras so constitudos por TAGs. Os TAGs so steres
formados por uma molcula de glicerol e trs cidos gordos. So insolveis em gua e temperatura ambiente, podem existir no estado lquido (leos) ou no estado slido (gorduras) (Giese, 1996). O tipo e a localizao dos cidos gordos na molcula de glicerol definem as caractersticas fsicas e qumicas das gorduras (McGrady, 1993), o destino metablico e os benefcios para a sade (Osborn e Akoh, 2002). Consequentemente, uma anlise cuidadosa da funo e metabolismo dos cidos gordos de extrema relevncia. 2.1.1.1 CLASSIFICAO DOS CIDOS GORDOS RELATIVAMENTE AO COMPRIMENTO DA CADEIA cidos gordos de cadeia curta Os cidos gordos de cadeia curta (short-chain fatty acids, SCFA) tm uma cadeia com 2 a 6 carbonos e so conhecidos pela sua volatilidade. As fontes principais de SCFA so o leite de vaca e a manteiga. Devido sua solubilidade na gua, pequeno tamanho molecular e curto comprimento da cadeia, so os cidos gordos mais rapidamente absorvidos no 5
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estmago. Os SCFA ligados posio n-3 do TAG vo ser completamente hidrolisados no lmen do estmago e no intestino delgado, devido especificidade posicional e de comprimento de cadeia da lipase pancretica humana (Osborn e Akoh, 2002). Os SCFA tm baixo valor calrico: C2:0, 3,5 kcal/g; C3:0, 5,0 kcal/g; C4:0, 6.0 kcal/g e C6:0, 7,5 kcal/g (Akoh,1998). cidos gordos de cadeia mdia As fontes principais de cidos gordos de cadeia mdia (medium-chain fatty acids, MCFA, C6:0 a C12:0) so o leo de coco e o leo de palmiste. Os MCFA so transportados preferencialmente pela veia porta para o fgado (Bell et al, 1991). Os MCFA so rapidamente metabolizados e tm fraca tendncia a depositarem-se sob a forma de gordura, porque no so rapidamente re-esterificados em TAGs. Embora estes cidos gordos possam ser teis no controlo da obesidade, podem aumentar potencialmente os nveis de colesterol total (Osborn e Akoh, 2002). Os MCFA so frequentemente utilizados em S.L. conjuntamente com PUFA, aliando a sua inerente mobilidade, solubilidade e facilidade de metabolizao, com os efeitos benficos para a sade dos PUFA (Akoh, 1998). cidos Gordos de Cadeia Longa Os cidos gordos de cadeia longa (long-chain fatty acids, LCFA, C14:0 a C24) esto presentes em gorduras animais, vegetais e leos de peixes. Estes cidos gordos so absorvidos e metabolizados mais lentamente que os SCFA e os MCFA. OS LCFA no podem ser absorvidos ou transportados no sangue, devido ao seu comportamento hidrofbico. Primeiro, os LCFA so empacotados em micelas, e depois entram nas clulas intestinais, onde so formados os quilomicrons. Os quilomicrons so secretados para o sistema linftico, e entram na circulao sistmica. necessria carnitina para transportar os LCFA para a mitocndria das clulas. Existem diversos tipos de LCFA e alguns deles tm um papel mais relevante na produo de lpidos estruturados.
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Os cidos gordos essenciais (essential fatty acids, EFA) no podem ser sintetizados pelo organismo humano, mas so absolutamente necessrios para a sade, pelo que devem ser includos na dieta (Guilliams, 2000) . O cido linoleico (18:2 n-6), que se encontra na maioria dos leos vegetais e sementes de plantas, um EFA que pela aco das enzimas elongase e dessaturase, d origem ao cido araquidnico (20:4 n-6), que por sua vez o percursor da formao de eicosanides (Osborn e Akoh, 2002). Outro EFA o cido linolnico (18:3 n-3), que se encontra no leo de soja e linhaa. O EPA e o DHA, presentes em leos de peixe, so PUFA de grande interesse para a produo de S.L.. Como j foi referido anteriormente (c.f. 1.1), os cidos gordos n-3 tm efeitos benficos em doentes com arteriosclerose, doenas cardiovasculares, doenas inflamatrias e um papel fundamental no crescimento e desenvolvimento humano. O DHA um componente vital dos fosfolpidos das membranas celulares, especialmente em rgos como a retina e o crebro, e como tal este cido gordo essencial ao seu bom funcionamento (Connor, 2000). Os cidos gordos n-9, na forma de cido oleico (18:1 n-9) esto presentes em muitos leos vegetais, no so EFAs, mas reduzem moderadamente os nveis de colesterol.
2.1.1.2 CLASSIFICAO DOS CIDOS GORDOS RELATIVAMENTE AO GRAU DE INSATURAO Os cidos gordos so classificados de acordo com o seu grau de saturao. cidos gordos saturados so aqueles que contm ligaes simples carbono-carbono, e so menos reactivos. Encontram-se em grandes quantidades na manteiga, leo de coco e leo de palma (Guilliams, 2000). Os cidos gordos insaturados so aqueles que contm uma ou mais ligaes duplas carbono-carbono. Quando o cido gordo contm uma ligao dupla carbono-carbono designado monoinsaturado (monounsaturated fatty acids, MUFA). O cido gordo monoinsaturado mais comum o cido oleico presente no azeite, leo de canola, leo de amendoim e leo de girassol (Guilliams, 2000). Se um cido gordo contiver mais do que uma ligao dupla, designado polinsaturado (PUFA).
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Devido presena de ligaes duplas, os cidos gordos insaturados so mais reactivos. Esta reactividade aumenta com o nmero de duplas ligaes. Dos PUFA, destacam-se pelo seu maior interesse o linoleico, o linolnico, o araquidnico, o EPA e o DHA, que contm respectivamente 2, 3, 4, 5 e 6 ligaes duplas.
2.1.2 PROPRIEDADES FSICAS DAS GORDURAS
As propriedades fsicas das gorduras tm sido objecto de investigao no mundo acadmico e na indstria. A indstria de leos e gorduras alimentares est envolvida no estudo de misturas complexas de TAGs, com o objectivo de modificar as suas propriedades para servir aplicaes especficas nos produtos alimentares e para controlar a sua estabilidade e prazo de validade (Birker e Padley, 1987). Um requisito essencial para poder controlar de forma eficaz o processo de produo e as caractersticas do produto, a compreenso das propriedades fsicas dos leos e gorduras. Estas propriedades esto dependentes do grau de insaturao, do comprimento da cadeia carbonada, das formas isomricas dos cidos gordos, da configurao molecular e do tipo de processamento industrial. Em geral, as gorduras que so lquidas temperatura ambiente tendem a ser mais insaturadas do que as que se apresentam no estado slido, mas h excepes (Giese, 1996). O ponto de fuso de uma gordura est relacionada com o comprimento da cadeia dos seus cidos gordos constituintes. medida que aumenta o comprimento da cadeia carbonada de um cido gordo saturado, o seu ponto de fuso tambm aumenta. Esta a razo pela qual o leo de coco (90% cidos gordos saturados) com uma alta proporo de SCFA, se apresenta no estado lquido, ao passo que a banha (37% cidos gordos saturados) com uma alta proporo de LCFA semi-slida a 25C. Os cidos gordos insaturados podem existir na forma cis ou na forma trans, dependendo da configurao dos tomos de hidrognio ligados aos tomos de carbono juntos na ligao dupla. Quando os dois tomos de hidrognio esto em lados opostos da ligao dupla, a configurao designada trans; quando os dois tomos de hidrognio esto no mesmo lado da ligao dupla, a configurao designada cis. Os cidos gordos trans presentes na dieta 8
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so provenientes de gorduras parcialmente hidrogenadas, de leos refinados, da carne, do leite e dos derivados de animais ruminantes. Os alimentos contendo gordura parcialmente hidrogenada contribuem com cerca de 80% a 90% da ingesto diria cidos gordos trans. Para alimentos provenientes de animais ruminantes esta contribuio bem menor, sendo estimada em torno de 2% a 8% (Larque et al., 2001). O ponto de fuso dos cidos gordos insaturados profundamente afectada pela posio e conformao da ligao dupla. Durante a hidrogenao, podem ocorrer alteraes na posio da ligao dupla, assim como alteraes na isomerizao cis-trans [1]. A converso dos ismeros cis, em ismeros trans, resulta num aumento do ponto de fuso. Polimorfismo das gorduras Uma das caractersticas da cristalizao dos TAGs o polimorfismo, ou seja, a ocorrncia de uma grande variedade de formas cristalinas diferentes, dependendo da forma como as molculas se orientam no estado slido (Birker e Padley, 1987). O polimorfismo usado deliberadamente no fabrico de gorduras, de modo a controlar a forma, tamanho e interaco dos cristais nos produtos. As formas cristalinas primrias dos TAGs so designadas por: , e (Figura 1), que correspondem s trs principais disposies transversais das cadeias de cidos gordos (Bailley e Ollis, 1986).
Figura 1. Polimorfismo dos triacilgliceris: forma (cristais do sistema hexagonal), forma (cristais do sistema triclnico) e forma (cristais do sistema ortorrmbico) (Fonte: Smith, 2008).
A forma polimrfica (cristais do sistema hexagonal) a mais instvel, com menor densidade e menor ponto de fuso. formada na fase inicial do processo de cristalizao da gordura devido ao arrefecimento rpido. Os cristais , devido sua falta de estabilidade, 9
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so transformados em segundos ou minutos na forma ou (Bailley e Ollis, 1986; Chryson, 1985). A forma (cristais do sistema ortorrmbico) constituda por uma rede com uma grande rea superficial, capaz de imobilizar uma grande quantidade de leo e de fase aquosa. Trata-se da forma estvel slida de certos tipos de TAGs, como aqueles do tipo Cn Cn+2, e tambm da maioria das misturas complexas naturais Os cristais so relativamente pequenos, finos, suaves e conferem ao produto uma superfcie brilhante (Gunstone, 1998). Os shortenings e as margarinas possuem uma textura suave e cremosa, devido incluso de cristais [1]. A forma (cristais do sistema triclnico) uma das mais estveis para a maioria dos TAGs puros e apresenta o ponto de fuso mais elevado. Algumas gorduras, de composio simples (exemplo: manteiga de cacau), podem tambm cristalizar nesta forma, dependendo das condies experimentais. Apesar de os cristais serem inicialmente pequenos, crescem em aglomerados em forma de agulhas, que so menos capazes de incorporar lquido e produzem a caracterstica textura granulosa (Gunstone, 1998). Os leos com TAGs com cidos gordos com diferentes comprimentos de cadeia (usualmente C16 e C18 ) tm maior probabilidade de cristalizar na forma , enquanto que aqueles constitudos quase inteiramente por cidos C18, tm tendncia para a forma (Gunstone, 1998). A maioria das gorduras apresenta polimorfismo monotrpico, isto , quando ocorre uma transio (por exemplo, de para ), o empacotamento das cadeias moleculares do triacilglicerol torna-se mais compacto, o que resulta num aumento do ponto de fuso (Marangoni, 1999; Rousseau et al., 1996). A taxa e a extenso da transformao so controladas pela composio molecular e configurao da gordura, condies de cristalizao e durao e temperatura do armazenamento. No fabrico de margarinas, a agitao mecnica e trmica durante o processamento e o armazenamento a temperaturas elevadas tende a acelerar a taxa de transformao dos cristais. Em geral, as gorduras que contm diferentes tipos de molculas tendem a
permanecer em formas cristalinas de baixo ponto de fuso. As gorduras que contm um limitado tipo de molculas transformam-se rapidamente em formas cristalinas com ponto de fuso mais elevado [1].
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O processo de cristalizao dividido em duas fases: nucleao e crescimento dos cristais. A nucleao envolve a formao de agregados de molculas que excederam um tamanho crtico e so, portanto, estveis. O processo de nucleao induzido pelo rpido arrefecimento da gordura inicialmente no estado lquido (Herrera et al., 1998; Timms, 1995). As propriedades reolgicas macroscpicas das redes cristalinas lipdicas destes produtos so extremamente importantes. Muitos dos atributos sensoriais, como a espalhabilidade, a sensao na boca e a textura esto dependentes da resistncia mecnica da rede cristalina (Piska et al., 2006). A investigao na rea de cristalizao de gorduras utiliza metodologias de: calorimetria diferencial de varrimento (differential scanning calorimeter, DSC), difraco por raios X, RMN e diferentes tcnicas de microscopia (Marangoni, 2005). Teor de gordura slida O teor de gordura slida (solid fat content, SFC) um parmetro que expressa o rcio gordura slida/gordura lquida de uma gordura a vrias temperaturas (Marangoni e Rousseau, 1995). Produtos com alto teor lipdico, como a manteiga, as margarinas, os cremes vegetais e similares, devem apresentar uma proporo adequada entre as fraces slida e lquida para que o produto tenha a textura e a funcionalidade (isto , espalhabilidade) desejada pelos consumidores (Toro-Vasquez et al., 2000). As determinaes do teor de gordura slida a diferentes temperaturas at fuso da amostra, pode ser representada em grficos, atravs de uma curva que ilustra as alteraes (OBrien, 2004). As alteraes causadas pela interesterificao dos TAGs reflectem-se nos valores de SFC, a diferentes temperaturas (Marangoni e Rousseau, 1995). Os mtodos mais utilizados para determinar o teor de gordura slida so: SFC por NMR e o ndice de gordura slida (solid fat ndex, SFI) por dilatometria (Timms, 1985). Os resultados da determinao por NMR, em termos de SFC, so semelhantes mas no comparveis directamente com os resultados em termos de SFI; no entanto os dois mtodos podem ser correlacionados (Chrysam, 1985). At dcada de 70 do sculo XX, a dilatometria era o mtodo mais comum. Esta tcnica um mtodo indirecto de avaliao do teor de gordura slida. Baseia-se na dilatao, ou seja, 11
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na alterao de volume que resulta da fuso total da gordura a determinada temperatura (Timms, 1985). Quando a gordura slida derrete, o volume da amostra aumenta e esta alterao pode ser medida por dilatometria (Shaidi e Wanasundara, 2002). Apesar da sua importncia, o mtodo SFI lento e laborioso. Em busca de um mtodo de anlise mais rpido, barato e automatizado, em 1974, os cientistas da Unilever foram os pioneiros no uso da tcnica de NMR de impulsos para a determinao do rcio slido/lquido em gorduras (Van Putte e Van den Enden, 1974). O rcio slido/lquido obtido pela tcnica de NMR expresso em forma de percentagem, onde 0% corresponde a uma amostra totalmente lquida e 100% a uma amostra totalmente slida (Timms, 2003). Nos dias de hoje, a determinao de SFC por NMR de baixa resoluo o mtodo padro internacionalmente aceite e de grande importncia na indstria de leos e gorduras (ISO 8292:1991). uma tcnica no destrutiva que possibilita resultados directos e rpidos (Martini et al, 2005; Goh e Ker, 1991). A tcnica de NMR uma tcnica espectrofotomtrica com uma variedade de aplicaes em anlises de estrutura e de composio. baseada no princpio que os ncleo do tomo de hidrognio se alinham num campo magntico. Estes ncleos alinhados podem ser excitados ao aplicar um segundo campo magntico na forma de uma onda de rdio, retornando sua posio de equilbrio posteriormente, num processo de relaxamento. A eficincia destes processos de relaxamento determinado pela mobilidade das molculas s quais pertencem os ncleos. Este o princpio bsico da determinao do SFC por NMR, que resulta da grande diferena na durao do relaxamento das fases lquidas e das fases slidas, uma vez que o sinal de uma fase slida desvanece-se mais rapidamente do que o de uma fase lquida (Van Duynhoven et al, 1999). O mtodo mede dois impulsos distintos: um sinal que emitido imediatamente a seguir ao impulso, e que proporcional ao total de gordura (slida e lquida) e outro, cerca de 70 s depois, proporcional quantidade de gordura lquida (Van Putte et al, 1975). O SFC o indicador de muitas caractersticas das margarinas, incluindo a sua aparncia, espalhabilidade, exsudao de leo e propriedades organolpticas (Ribeiro et al., 2009). Por exemplo, o SFC5 C e o SFC10 C de uma margarina determinam a sua facilidade em espalhar temperatura de refrigerao; o SFC25 C est relacionado com a estabilidade do produto e 12
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resistncia exsudao de leo temperatura ambiente; o SFC35 C est relacionado com a textura e propriedades de libertao de aroma e flavour na boca (Dian et al, 2007; Lida e Ali, 1998). O SFC10 C no deve ser superior a 32%, de forma a que a espalhabilidade esteja garantida temperatura de refrigerao (Lida e Ali, 1998). Para evitar que as margarinas produzam uma sensao gordurosa na boca, as margarinas devem apresentar obrigatoriamente SFC inferiores a 3,5% a 33,3 C, de forma a derreterem completamente temperatura corporal (Karabulut et al., 2004). As curvas de SFC antes e depois da interesterificao mostram mudanas considerveis no comportamento das gorduras, fornecendo informaes sobre: (i) a plasticidade e (ii) o ponto de fuso, que pode ser obtido da curva do SFC de forma grfica ou matemtica. O ponto de fuso definido como a temperatura qual a gordura apresenta 4% de slidos (Karabulut et al., 2004; Koh et al.1999). A grande maioria dos estudos de interesterificao publicados usa a curva de SFC como ferramenta para delinear aplicaes especficas das gorduras interesterificadas nos alimentos e optimizar o processo (Karabulut et al., 2004; Kok et al., 1999; List et al., 1977; Silva e Gioielli, 2006; Petrauskaite et al., 1998; Khatoon, 2000; Lida e Ali, 1998; Gioielli e Baruffaldi, 1988; Marangoni e Rousseau, 1998).
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Produo Enzimtica de Lpidos Estruturados ricos em cidos gordos mega-3, em reactor de alta presso 2.2
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TCNICAS DE MODIFICAO DAS PROPRIEDADES FSICO-QUMICAS DAS GORDURAS
Na natureza existem em abundncia leos vegetais e gorduras. No entanto, para atender s diversas aplicaes comerciais, os leos e as gorduras devem respeitar exigncias especficas para cada produto, nomeadamente a nvel funcional e estrutural. Por exemplo, para alguns bolos de pastelaria necessrio um determinado rcio de gordura slida/lquida, de forma a que o leo seja facilmente distribudo por toda a massa, cubra as partculas de farinha e auxilie no arejamento da massa. Ao mesmo tempo, pretende-se evitar um produto final demasiado gorduroso. J nas margarinas, necessrio um
determinado SFC, para conferir estrutura gordura, sem comprometer a sua espalhabilidade. Para suprir essas necessidades do mercado e para fornecer produtos uniformes a partir de matrias primas, nem sempre uniformes, surgiram as tcnicas de modificao de leos e gorduras. Estas tcnicas permitem uma maior flexibilidade de escolha das matrias primas e trazem tambm vantagens aos consumidores, pois permitem o fabrico de produtos de qualidade constante a preos razoveis (Coenen, 1974; Hoffmann, 1989c; Gioielli, 1986). Actualmente, esses mtodos esto to firmemente estabelecidos e so aplicados numa escala to grande que seria praticamente impossvel atender aos padres de mercado sem o uso de tcnicas de modificao. 2.2.1 HIDROGENAO Em 1987, Sabatier e Senderens (Frana) descobriram a hidrogenao cataltica. Normand aplicou mais tarde o processo s gorduras insaturadas. A hidrogenao o processo pelo qual o hidrognio adicionado s duplas ligaes dos cidos gordos (Figura 2), e foi desenvolvida para responder necessidade de: converter leos no estado lquido na sua forma semi-slida para melhorar a sua performance em certos alimentos; melhorar a estabilidade trmica e oxidativa do leo ou gordura. um processo de grande importncia, porque confere a desejada estabilidade e funcionalidade a certos produtos. A hidrogenao parcial tornou-se um processo muito usado para modificar leos de sementes e leos de peixe.
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Em 1990, um tero dos leos alimentares eram hidrogenados, e apenas um dcimo eram fraccionados ou interesterificados (Gunstone, 1998). Esta proporo tem vindo a mudar, devido s preocupaes inerentes ao consumo de cidos gordos trans formados durante a hidrogenao parcial. No processo de hidrogenao, o hidrognio em forma de gs reage com a gordura, a temperatura e presso elevadas e na presena de um catalisador. O catalisador mais utilizado o nquel, que removido da gordura, aps o processo de hidrogenao ter terminado. medida que o processo decorre, h um aumento gradual no ponto de fuso da gordura. O processo pode ser interrompido em qualquer momento [1].
Figura 2. Hidrogenao: o hidrognio gasoso reage com as duplas ligaes dos cidos gordos insaturados [1]. As seguintes mudanas tm lugar, quando o leo parcialmente hidrogenado: H uma mudana no ponto de fuso do leo, como consequncia do aumento na proporo de cidos gordos saturados e/ou trans, o que afecta a espalhabilidade, as caractersticas sensoriais, e a eficincia da panificao, H uma melhoria na estabilidade relativamente oxidao atmosfrica, Ocorre uma reduo no valor nutricional do produto, relacionado com a reduo nos nveis de cidos gordos essenciais (cidos -linolnico e linoleico) e a presena de cidos gordos trans (Gunstone, 1998). As condies da hidrogenao podem ser alteradas pelo fabricante para que o produto tenha as propriedades fsico-qumicas desejadas. Factores importantes so: o catalisador (dimetro do poro, comprimento do poro, nvel de actividade e quantidade), temperatura da reaco, a presso de hidrognio, o tempo e a intensidade de agitao. A hidrogenao favorecida por uma alta concentrao de hidrognio (aumento na presso, aumento na agitao) ao passo que a isomerizao favorecida por factores que levam a uma maior necessidade de hidrognio, que no pode ser completamente satisfeita (aumento na temperatura, maior quantidade de catalisador, um catalisador mais activo, um leo mais insaturado) (Gunstone, 1998). 15
Produo Enzimtica de Lpidos Estruturados ricos em cidos gordos mega-3, em reactor de alta presso 2.2.2 FRACCIONAMENTO
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Foram desenvolvidos diferentes mtodos para o fraccionamento de gorduras, principalmente com o objectivo de modificar a sua textura e ponto de fuso. O fraccionamento permite a separao de classes de TAG, mas no muda a distribuio posicional dos cidos gordos (Willis et al.,1998). Esta tcnica consiste na separao de leos e gorduras em dois ou mais componentes, dependendo da sua solubilidade (em lquidos, leos ou solventes) e ponto de fuso, por arrefecimento controlado. As fraces menos solveis e com ponto de fuso mais elevado so designadas estearinas e as fraces mais solveis, e com ponto de fuso mais baixo so as olenas. Estes dois produtos alargam as possibilidades de utilizao da gordura ou do leo original (Gunstone, 1998). O fraccionamento das gorduras levado a cabo principalmente por quatro razes: Remoo dos componentes minoritrios, que impedem a aplicao do leo; Enriquecimento do leo num TAG desejvel; Separao de uma gordura em duas ou mais fraces, que permitem uma aplicao mais ampla e de maior valor comercial do que a gordura-me; Como uma alternativa hidrogenao (Gunstone, 1998). O fraccionamento pode ser repetido mais do que uma vez para dar origem a outras fraces, mas isto s possvel quando so obtidos produtos com alto valor comercial, como por exemplo os sucedneos da manteiga de cacau. Na produo de sucedneos da manteiga de cacau tem sido usada a tcnica de fraccionamento em vrios leos, incluindo o leo de palmiste, leo de palma, leo de soja hidrogenado e leo de sementes de algodo (Kreulen, 1976). As tcnicas de fraccionamento mais utilizadas a nvel industrial so: a) Fraccionamento a seco: o mtodo mais comum que consiste numa cristalizao lenta e controlada, na ausncia de solvente. O objectivo separar os TAGs pelo seu
comportamento de cristalizao (Deffense, 1993). O leo no estado lquido arrefecido lentamente para permitir a formao de cristais grandes e uniformes, que so depois separados por filtrao. A formao e o crescimento dos cristais afectada pela composio do leo, taxa de arrefecimento e intersolubilidade TAG-TAG (Deffense, 1986). A separao das fases lquida e slida efectuada por centrifugao ou filtrao (Kreulen, 1976). 16
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b) Cristalizao na presena de um solvente, como a acetona ou o hexano: reduz a tendncia formao de cristais mistos e permite uma separao mais eficiente dos diferentes TAGs, em comparao com o fraccionamento a seco (Sonnet et al., 1986; Kreulen, 1976), mas um processo mais dispendioso e a sua utilizao limitada. c) Cristalizao na presena de um agente molhante: adicionada uma soluo aquosa de um detergente aps a cristalizao. A estearina slida, coberta pelo detergente, fica na fase aquosa, o que facilita a separao da olena e da estearina. Este procedimento j no muito utilizado actualmente (Gunstone, 1998).
2.2.3 INTERESTERIFICAO A preocupao acerca dos efeitos nefastos para a sade dos cidos gordos trans fez despertar o interesse em formas alternativas de produo de gorduras com o ponto de fuso adequado. Este objectivo pode ser concretizado atravs do processo de interesterificao de gorduras, por via qumica ou via enzimtica. Com a reaco de interesterificao, altera-se o teor de gordura cristalizada de uma mistura de gorduras, atravs da troca de grupos acilo entre TAGs. Ao contrrio da hidrogenao, a interesterificao no modifica a natureza dos cidos gordos na gordura e por consequncia no h formao de cidos gordos trans, ocorrendo apenas um simples rearranjo molecular. Deste modo, o valor nutricional das gorduras interesterificadas mantm-se inalterado relativamente s gorduras originais (Haumann, 1994). 2.2.3.1 INTERESTERIFICAO QUMICA A interesterificao qumica, conhecida desde 1844, o mtodo de interesterificao mais usado na indstria actualmente (Marangoni e Rousseau, 1995) e levada a cabo sob a influncia de um catalisador qumico (e.g. metxido de sdio). Este tipo de interesterificao modifica a posio dos cidos gordos dentro da molcula de triacilglicerol, aleatoriamente. Uma das principais aplicaes da interesterificao qumica no melhoramento da banha (gordura de porco). A banha tende a formar cristais grosseiros, difceis de controlar durante o armazenamento. Isto acontece porque 64% do cido palmtico est ligado na posio n-2 da molcula de glicerol. Ao tornar aleatria a distribuio posicional dos cidos gordos da
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banha por interesterificao qumica, as propriedades fsicas so melhoradas, e a banha reorganizada torna-se suave (DeMan, 1999). Outra aplicao desta tcnica no fabrico de margarinas, shortenings e spreads, para melhorar a sua textura, modificar o seu ponto de fuso e aumentar a sua estabilidade (Nawar, 1996; Ghazali et al., 1995). A interesterificao de leo de soja e leo de soja totalmente hidrogenado d origem a matrias-primas para a margarina. A nvel nutricional, a principal vantagem da interesterificao qumica a produo de margarinas e outros produtos, sem recurso hidrogenao, o que vai permitir um produto final livre de cidos gordos trans (Willis et al., 1998). Os processos de interesterificao qumica, a nvel industrial, decorrem a temperaturas da ordem dos 200 C, mas a utilizao dos catalisadores qumicos permite que a temperatura da reaco seja reduzida 100 a 50 C (Hustedt, 1976; Rozenaal, 1992; Soontag, 1979). A reaco demora entre 30 minutos a 2 horas. A concentrao de catalisador varia de 0,1 a 0,6% (m/m). medida que a concentrao de catalisador aumenta, ocorre uma maior perda de lpidos neutros, devido formao de sabes e steres metlicos (Kimoto et al., 1994; Nawar, 1996; Rozenaal, 1992). As matrias-primas utilizadas devem conter teores de gua inferiores a 0,01%, teores de AGL inferiores a 0,05% e ndice de perxidos inferior a 1,0 de modo a no inactivar o catalisador qumico utilizado (Kellens, 2000). As principais desvantagens da interesterificao qumica so: o consumo energtico elevado, a degradao dos PUFA, as reaces secundrias indesejadas, as dificuldades na remoo do catalisador aps a reaco e a necessidade de purificao da gordura
interesterificada (Erickson,1995). Existem tambm algumas vantagens: este um mtodo simples, rpido, e que no requer equipamento muito dispendioso, apesar de requerer um nmero relativamente elevado de operaes unitrias.
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Produo Enzimtica de Lpidos Estruturados ricos em cidos gordos mega-3, em reactor de alta presso 2.2.3.2 INTERESTERIFICAO ENZIMTICA
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As lipases microbianas extracelulares (glicerol ster hidrolases, EC 3.1.1.3) so excretadas pelos microrganismos para promoverem a digesto dos materiais lipdicos. Catalisam a hidrlise de gorduras para dar origem a cidos gordos livres (free fatty acids, FFA), MAGs, DAGs ou apenas FFAs e glicerol (Macrae, 1983). Sob condies experimentais adequadas, as lipases normalmente associadas hidrlise de lpidos em meios aquosos, podem tambm catalisar reaces de esterificao (reaco inversa da hidrlise, que ocorre em sistemas microaquosos) e transesterificao.
Nos anos 80, ocorreu uma descoberta revolucionria: ao contrrio do que se pensava, as lipases tambm funcionavam num ambiente com pouca gua e eram estveis nessas condies. Algumas das principais vantagens em utilizar lipases em meio orgnico em vez de as utilizar em meio aquoso, incluem:
Mudana do equilbrio termodinmico a favor da sntese; Reduo das reaces secundrias, dependentes da presena de gua; Eliminao da contaminao microbiana; Apropriado para reaces com substratos insolveis ou instveis em gua.
Em condies em que a quantidade de gua reduzida, a hidrlise da gordura minimizada para que a interesterificao catalisada por lipases seja a reaco dominante (Macrae, 1985; Jaeger et al., 1994). Indstrias como a Unilever, a Fuji oil e a Novozymes dedicaramse investigao nessa rea.
A transesterificao subdividida em quatro subclasses, de acordo com as espcies qumicas envolvidas. A alcolise a reaco entre um ster e um lcool. A acidlise a reaco entre um ster e um cido. A interesterificao a reaco entre dois steres diferentes, para gerar novos steres. Na aminlise, o ster reage com uma amina, gerando uma amida e um lcool (Figura 3).
A versatilidade das lipases torna-as dos biocatalisadores mais usados na tecnologia enzimtica e teis em diversas reaces, encontrando aplicaes em inmeros processos industriais (nomeadamente na modificao de propriedades dos alimentos - indstria de leos e gorduras alimentares e na indstria farmacutica e qumica fina).
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Produo Enzimtica de Lpidos Estruturados ricos em cidos gordos mega-3, em reactor de alta presso Hidrlise
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Esterificao
Transesterificao Alcolise
Acidlise
Interesterificao
Aminlise
Figura 3.Tipos de reaces catalisadas por lipases (Fonte: Saxena et al., 1999).
Uma caracterstica comum em algumas lipases microbianas, nomeadamente nas enzimas derivadas de Rhizomucor miehei e Thermomyces lanuginosa a especificidade 1,3. Isto significa que nas reaces com os TAGs as mudanas esto confinadas s posies n-1 e 3 e o grupo acil n-2 permanece inalterado. Esta especificidade frequentemente explorada na interesterificao enzimtica (Figura 4).
Se for utilizada uma lipase no especifica para catalisar a interesterificao, os triacilgliceris produzidos sero semelhantes aos obtidos por interesterificao qumica. Com uma lipase 1,3-especfica como catalisador da reaco, a migrao do acilo est confinada s posies n-1 e n-3, e assim produzida uma mistura de TAGs, que seria impossvel obter atravs da interesterificao qumica (Macrae, 1983).
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A especificidade e selectividade das lipases vai no s permitir a produo de leos com a composio desejada, como tambm uma menor formao de produtos secundrios.
Foi descrita a interesterificao enzimtica da gordura de palma, fraces da gordura de palma, e outros leos vegetais para dar origem a produtos que podem ser usados no fabrico da margarinas, com poucos ou nenhuns cidos gordos trans.
Existem diversos artigos que demonstram como, com uma enzima adequada, os LCFA PUFA, como os EPA e/ou DHA, podem ser incorporados em leos vegetais para conferir aos produtos um valor nutricional adicional.
Mistura de TAGS (A) Com catalisador qumico ou enzimtico no especfico.
(B) Com lipase 1,3-especfica.
Figura 4. Reaco de interesterificao: (A) com catalisador qumico ou catalisador enzimtico no especfico; (B) com lipase 1,3 especfica (Fonte: Macrae, 1983).
A produo sustentvel de leos e gorduras uma necessidade econmica, devido ao aumento do custo das matrias primas e sua menor disponibilidade (Cowan, 2008).
As reaces enzimticas tm vrias vantagens potenciais em relao a reaces similares com catalisadores qumicos. Geralmente ocorrem a condies mais suaves de temperatura e com maiores rendimentos.
A anlise do ciclo de vida do produto pode exprimir-se em termos de vrios indicadores ambientais, nomeadamente: consumo energtico, aquecimento global e poluentes produzidos. Atravs da anlise do Quadro 1, podemos ter uma ideia do que podemos 21
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poupar se optarmos por um processo de interesterificao enzimtica em detrimento de um processo de interesterificao qumica (Cowan, 2008).
Quadro 1. Poupana a nvel ambiental, por unidade de produo (1000 kg produto processado), ao optar pela interesterificao por via enzimtica em detrimento da interesterificao qumica (Cowan, 2008). Energia Fssil (MJ) Aquecimento global (kg CO2) Acidificao do Solo (g SO2) Enriquecimento da gua em nutrientes (g PO4) causador do fenmeno de eutrofizao Formao de fumo (g C2H4) 280 23 61 58 4
O uso de lipases imobilizadas na interesterificao enzimtica facilita o desenvolvimento dos processos comerciais, contnuos e em larga escala. Os sistemas em larga escala tm uma alta eficincia por unidade de volume do reactor e uma alta taxa de retorno dos custos relativos ao capital investido (Chibata e Tosa, 1976). Para alm disso, o uso de reactores com lipases imobilizadas diminui o potencial de contaminao do produto, pela presena de lipases residuais no produto; a tcnica de imobilizao melhora a estabilidade trmica e qumica das enzimas e abre oportunidades para um melhor controlo do processo e da qualidade do produto (Khmelnitsky et al., 1988; Messing, 1975). Para as reaces de interesterificao, os reactores descontnuos com agitao e as lipases imobilizadas, tm sido muito usados a nvel laboratorial e industrial, porque so extremamente versteis e fceis de operar (Marlot e Landgrand, 1985; Macrae, 1985). A utilizao de agitao magntica evita os gradientes de temperatura e concentrao dentro do reactor. Contudo, pode levar destruio das partculas do biocatalisador, em situaes de agitao muito intensa. Depois da reaco estar concluda, a separao da lipase imobilizada da mistura reaccional feita atravs de uma simples filtrao (Malcata et al, 1990).
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Como resultado de uma estratgia de marketing eficiente, o processo de interesterificao enzimtica est a ser gradualmente adoptado e, a nvel mundial, 22 unidades de interesterificao enzimticas foram, ou esto a ser construdas (Cowan et al., 2009). Estas unidades utilizam (4 ou mais) reactores de leito fixo em srie. O reactor de leito fixo consiste num cilindro, geralmente colocado na vertical, preenchido com as partculas do biocatalisador. A alimentao feita pela parte superior ou inferior da coluna. O movimento permanente do substracto atravs do leito contendo as clulas ou as enzimas imobilizadas permite obter velocidades de reaco elevadas resultantes de uma elevada concentrao do substracto. Apresenta ainda como vantagem uma destruio mnima das partculas do biocatalisador, devido abraso resultante do atrito, quando comparada com a observada nos tanques agitados (Osrio, 2008). No primeiro dos reactores em srie so removidos os compostos inactivadores enzimticos presentes no caudal de alimentao. Desse modo, o biocatalisador est protegido nos reactores a jusante e evita-se que este tenha de ser substitudo numa fase inicial. Para a remoo dos compostos inactivadores enzimticos generalizou-se o uso da slica (Dayton e Santos, 2008).
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Produo Enzimtica de Lpidos Estruturados ricos em cidos gordos mega-3, em reactor de alta presso 2.3 PARMETROS QUE INFLUENCIAM A ACTIVIDADE E ESTABILIDADE ENZIMTICAS
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Existem vrios factores que influenciam a actividade e a estabilidade das enzimas, e neste caso em particular das lipases, destacando-se pela sua importncia: a temperatura, a actividade da gua (aw), a presso e a presena de compostos inibidores da actividade enzimtica. (e.g. produtos de oxidao lpidica e cidos gordos livres) (Wisdom et al, 1987; Linfield, 1988; Posorke et al., 1988; Wang e Gordon, 1991, Correia e Ferreira-Dias, 1998; Xu et al, 1998). Temperatura A temperatura um parmetro que devemos ter em considerao sempre que temos como principal objectivo o aumento da velocidade de uma reaco enzimtica. O aumento da temperatura promove a actividade cataltica das enzimas, mas a partir de um dado valor provoca a sua inactivao reversvel ou irreversivelmente (Martinek et al, 1981; Ahern e Klibanov, 1985). Assim, medida que o tempo decorre, a lipase perde a actividade, devido inactivao trmica. Uma questo importante associada ao uso a longo prazo de uma lipase num biorreactor industrial como lidar com a sua inactivao trmica, j que a viabilidade econmica do processo industrial depende do tempo de vida til do biocatalisador, que est por sua vez directamente associado temperatura da reaco e termo-resistncia da enzima (Bailey e Ollis, 1986). A temperatura a que decorre a reaco de interesterificao deve aumentar a uma taxa que compense o decrscimo na actividade enzimtica, permitindo ao sistema manter constante a actividade cataltica (Dohan et al., 1978). Nas reaces enzimticas, medida que a temperatura aumenta, observa-se um efeito conjugado do aumento da velocidade da reaco e da acelerao da taxa de desnaturao da enzima (Malcata et al, 1990). Existe um valor de temperatura ptimo, a partir do qual a velocidade de reaco decresce com o aumento da temperatura (Campos, 1998). O aumento da temperatura para valores extremos pode desnaturar completa e irreversivelmente as lipases. A causa mais comum para inactivao das enzimas a temperaturas elevadas a perda da conformao original cataliticamente competente, i.e., a termodesnaturao. 24
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Demonstrou-se que a temperatura a que uma protena sofre desnaturao trmica est dependente da aw: quanto mais baixa a aw, mais elevada a temperatura de desnaturao (Turner et al, 1995). As enzimas que requerem baixa aw para a sua actividade cataltica, permanecem activas a temperaturas elevadas, estando protegidas contra a desnaturao. No fcil determinar a temperatura qual uma dada enzima vai sofrer desnaturao. Para a maioria das enzimas este processo inicia-se entre os 40 - 50 C (Bailley e Ollis, 1986). Existem no entanto enzimas termo-resistentes, como por exemplo as preparaes comerciais das lipases imobilizadas de Rhizomucor miehei (Lipozyme IM), Thermomyces lanuginosa (Lipozyme TL IM) e de Candida antarctica (Novozyme 435), produzidas pela Novozymes A/S, que desnaturam a temperaturas mais elevadas. A resistncia trmica e elevada actividade destas enzimas, tornam-nas adequadas bio-modificao de gorduras na ausncia de solventes orgnicos. Produtos de oxidao dos lpidos O processo de auto-oxidao o processo de oxidao induzido pela presena de oxignio, temperatura ambiente. Trata-se de um processo lento, que ocorre s at determinado grau. O oxignio reage com os cidos gordos insaturados. Inicialmente h formao de hidroperxidos (produtos de oxidao primria) que podem dar origem a produtos de oxidao secundria, como as -dicetonas ou cetonas insaturadas, os aldedos e os cidos gordos de cadeia curta. A termoxidao, ou oxidao a temperatura elevada processa-se mais rapidamente que a auto-oxidao. A oxidao dos leos e gorduras vai desenvolver off-flavours, designadamente o odor a rano, proveniente da presena de produtos secundrios de oxidao, que leva rejeio dos produtos por parte do consumidor (Frankel, 1995). Algumas gorduras so mais susceptveis que outras, consoante o grau de insaturao, a presena de anti-oxidantes e outros factores, como por exemplo, a exposio luz (fotoxidao). Quanto mais insaturada for a gordura ou o leo, maior a sua susceptibilidade oxidao rancificativa. A determinao do teor dos produtos de oxidao frequentemente elucidativa para quantificar a evoluo do grau de oxidao da gordura. A actividade e estabilidade das lipases diminuem na presena de produtos de oxidao, nomeadamente dos hidroperxidos (Correia e Ferreira-Dias, 1998; Xu et al., 1998). 25
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A utilizao de gorduras polinsaturadas, e por isso mais susceptveis oxidao, pode levar a uma diminuio da actividade e estabilidade operacional das lipases quando utilizadas em reactores contnuos (Osrio et al., 2006). O principal desafio, ao incorporar TAG enriquecidos em PUFAs em produtos alimentares, manter a sua estabilidade oxidativa, de modo a evitar que surjam off-flavours, durante o processamento ou armazenamento dos mesmos (Ferreira-Dias, 2009). Actividade da gua A actividade da gua (aw) uma medida da gua disponvel no sistema e corresponde relao entre a presso de vapor de gua desse sistema e a presso de vapor pura no ar saturado mesma temperatura (Parker e Birch, 1983). A interaco entre uma enzima e a gua que a rodeia so de importncia crucial para a catlise enzimtica (Kuntz e Kauzmann, 1974), uma vez que a gua influencia a manuteno da estrutura da enzima e o seu funcionamento. A remoo total da gua duma preparao enzimtica vai alterar a conformao da enzima e inactiv-la. As lipases so enzimas que apresentam uma cintica de activao interfacial na interface lpido-gua. Este fenmeno ocorre devido s caractersticas estruturais nicas desta classe de enzimas. As lipases contm uma unidade constituda por um oligopptido helicoidal, que protege o centro activo. Esta proteco abre de forma a expor o centro activo, quando interage com uma interface hidrofbica (lpidos), permitindo o livre acesso ao substrato (activao interfacial) (Reetz, 2002). Ao nvel molecular, o mecanismo de interesterificao envolve a hidrlise da molcula de ster, seguida de uma reaco de re-esterificao. Ou seja, necessrio que a gua esteja presente pelo menos em quantidades vestigiais, adsorvida s partculas da lipase (sistema microaquoso) (Macrae, 1983). Por outro lado, valores de aw elevados (1), em que a gua constitui uma fase separada do meio orgnico, promovem a reaco de hidrlise. Quando se utilizam lipases imobilizadas para catalisar uma reaco de interesterificao necessrio ter em linha de conta a aw necessria para se obter a actividade mxima. Diferentes enzimas tm exigncias diferentes em relao aw que necessitam para manter um nvel aprecivel de actividade cataltica. Para algumas lipases, a aw tem de ser 26
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aproximadamente 1, mas outras lipases como por exemplo, a do Rhizomucor miehei, demonstram uma actividade cataltica elevada para valores muitos baixos
(aproximadamente 0) e actividade cataltica ptima abaixo dos 0,5 (Halling, 2004). A estabilidade das enzimas aumenta consideravelmente em meios com baixos nveis de actividade da gua, tornando possvel biotransformaes a temperaturas mais elevadas que aquelas usadas em solues aquosas convencionais (Aldercreutz, 1982). A descoberta de que as enzimas podem ser usadas em meios orgnicos com baixo aw expandiu o leque de aplicaes potenciais das lipases. Apesar destes aspectos serem muito promissores para a biotecnologia, ainda existe uma grande lacuna relativamente ao comportamento enzimtico em meio no aquoso. cidos Gordos Livres Tal como os outros steres, os TAGs podem ser hidrolisados por via qumica ou enzimtica. A hidrlise parcial dos TAGs vai dar origem a MAGs, DAGs e AGL. Quando a hidrlise completa formam-se apenas AGL e glicerol. Existem estudos que referem a inactivao/inibio de lipases em presena de elevados teores de AGL (Dunn et. al, 1992). Contudo, outros estudos demonstram que os teores de AGL nos meios reaccionais sujeitos a interesterificao parecem no ter qualquer efeito negativo na estabilidade da enzima (Holm e Cowan, 2008). Presso A presso um parmetro fundamental do sistema, quando estamos na presena de reaces enzimticas. A aplicao de altas presses provoca modificaes locais ou globais na estrutura da protena, e pode em ltima instncia levar desnaturao da mesma (Weber e Drickamer, 1983). Recentemente foi sugerido que as altas presses podero modelar a actividade e estabilidade de diferentes enzimas, conduzindo a melhores aplicaes das mesmas (Mozhaev et al., 1996). A cintica e o equilbrio das reaces enzimticas podem diferir consideravelmente quando estas so levadas a cabo a altas presses, e em alguns casos a selectividade e estabilidade da reaco podem ser tambm influenciadas.
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As altas presses e as altas temperaturas tm efeitos antagonistas em ligaes fracas (ligaes por pontes de hidrognio, ligaes inicas e hidrofbicas). portanto expectvel que a estabilidade das protenas seja afectada de maneira diferente por estes dois parmetros (Silva e Webber, 1993). Aumentar a termoestabilidade das enzimas um tema de grande interesse para as aplicaes biotecnolgicas, uma vez que a temperatura aumenta a velocidade das reaces (Grupta, 1991). A alta presso ainda no um parmetro utilizado para aumentar os rendimentos em processos biocatalticos, principalmente pela instabilidade das enzimas a presses elevadas. De facto, a alta presso tem sido aplicada com sucesso na indstria alimentar e farmacutica pela sua aco desnaturante das enzimas e inactivadora de microrganismos. Uma aplicao importante na indstria alimentar o processamento a altas presses hidroestticas (High Pressure Process Technology, HPP), uma tcnica inovadora proposta para a estabilizao microbiolgica dos alimentos, e que vem surgir como alternativa aos tratamentos trmicos, como a pasteurizao. O tratamento HHP inactiva microrganismos e desnatura enzimas, sem afectar grandemente os compostos de baixa massa molecular, como as vitaminas, os pigmentos e outros compostos relacionados com as qualidades sensoriais e nutricionais do produto. No campo da enzimologia, a presso pode ser usada para modificar o comportamento cataltico das enzimas, mudando o passo limitante ou modulando a selectividade da enzima (Okamoto et al, 1991). A presso capaz de afectar a estrutura proteica, a nvel secundrio, tercirio e quaternrio (Lullien-Pellerin e Balny, 2002). Em geral, presses baixas induzem alteraes reversveis, ao passo que presses acima dos 500 MPa podem desnaturar as protenas irreversivelmente, na maioria dos casos, devido sua agregao. As presses moderadas (<150 MPa) afectam a estrutura quaternria da protena, devido s mudanas nas interaces hidrofbicas que mantm a estrutura das protenas, e favorecem a dissociao das protenas oligomricas (Northrop, 2002). Acima dos 200 MPa, observam-se alteraes notveis na estrutura terciria, mas a desnaturao reversvel das protenas pequenas monomricas elevadas (400-800 MPa). ocorre a presses mais
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A estrutura secundria das protenas normalmente afectada por presses acima dos 300 MPa. A modificao da estrutura secundria pode causar a desnaturao reversvel da enzima, dependendo da taxa de compresso e da extenso dos rearranjos estruturais (Mohana-Borges et al. 1999). Os seguintes estudos ilustram o efeito das altas presses na catlise enzimtica: A hidrlise da naringina, flavonide responsvel pela acidez nos sumos de toranja, catalisada por naringinase livre ou imobilizada em cpsulas de alginato de clcio, foi levada a cabo a altas presses. A 160 MPa, verificou-se um aumento na actividade e estabilidade operacional tanto da enzima livre, como imobilizada (Vila Real et al., 2007; Pedro et al., 2007). A utilizao da lipase imobilizada de Thermomyces lanuginosa (Lipozyme TL IMTM) como catalisador de reaces de interesterificao em meio livre de solvente: foi demonstrado que as altas presses (50, 100 e 150 MPa) podem ser usadas para modificar a selectividade original das lipases, na direco desejada (Osrio, et al., 2008).
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Produo Enzimtica de Lpidos Estruturados ricos em cidos gordos mega-3, em reactor de alta presso 2.4 MARGARINAS E CREMES DE BARRAR
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A primeira margarina foi desenvolvida como resposta a um desafio lanado por Napoleo III em meados do sc. XIX, que pretendia uma gordura segura, barata e fcil de preservar, que substitusse a manteiga. O principal objectivo de Napoleo era alimentar a nova classe operria, assim como os exrcitos. Na realidade, foi o qumico francs Hippolyte Mge-Mouris quem respondeu ao desafio e estabeleceu em meados do sc. XIX, o processo original que permitia obter a partir de leos no estado lquido, uma gordura slida, que designou por oleomargarina. Van den Bergh (Holanda) foi o responsvel pela maior produo desta primeira gerao de margarinas. No final do sc. XIX, a produo global de margarinas era de cerca de 300.000 toneladas (Parmentier, 2007). A inveno do processo de hidrogenao, patenteado por Wilhelm Normann em 1902, impulsionou a produo, ao incluir na composio das novas margarinas, os leos das principais oleaginosas (o leo de soja em particular). A hidrogenao foi naquela poca uma importante inovao a nvel cientfico e tecnolgico. Contudo, a tcnica de hidrogenao produzia produtos secundrios indesejveis, os ismeros trans dos cidos gordos. No final do sc. XX, foram realizados estudos sobre o metabolismos destes ismeros e conclui-se que prejudicavam a sade, a nvel
cardiovascular, porque aumentavam os nveis de colesterol LDL e baixavam os nveis de HDL. As autoridades passaram a impor limites no total de cidos gordos trans presentes nas gorduras para alimentao humana. Face a esta situao, surgiram duas alternativas: a primeira, melhorar a hidrogenao de forma a reduzir a produo de ismeros trans, atravs da monitorizao da temperatura, presso e tempo; e a segunda, a utilizao de tcnicas de interesterificao qumica ou enzimtica. Ao mesmo tempo, surgiram novos dados da investigao a nvel nutricional, que destacavam o papel benfico dos PUFAs, e aumentou a procura de leos vegetais ricos em cido linoleico e cido -linolnico, e praticamente desprovidos de colesterol. A resposta da indstria procura dos consumidores por produtos mais saudveis, foi o desenvolvimento de uma segunda gerao de margarinas, com baixos teores de gorduras trans e incorporao de PUFAs. 30
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Os estudos nutricionais mais recentes apontam para uma nova mudana no comportamento dos consumidores, que procuram produtos seguros, e promotores da sade (com uma funo preventiva, por exemplo das doenas cardiovasculares). A este respeito, surgiu uma terceira gerao de margarinas, ainda em desenvolvimento. Exemplos desta abordagem so as margarinas e cremes de barrar que contm fitoesteris para baixar os nveis de colesterol no sangue. Estas margarinas so comercializadas em larga escala nos pases mais desenvolvidos. A adio destes compostos geralmente no afecta sensorialmente o produto. No entanto, a adio de PUFA de cadeia longa, de origem marinha, como o DHA e o EPA, s margarinas, pode causar problemas a nvel da textura e do flavour. Segundo a legislao europeia, as matrias gordas para barrar so produtos que se apresentam sob a forma de emulso slida e malevel, derivadas de matrias gordas vegetais e/ou animais, slidas e/ou lquidas, prprias para consumo humano, cujo teor de matria gorda de origem lctea no excede 3% do teor de matria gorda. Consoante o teor total de matria gorda classificam-se em: (i) margarina, produto obtido a partir de gorduras e leos vegetais e/ou animais, com um teor de matrias gordas entre 80% e 90%, com consistncias variveis; (ii) margarina trs quartos, produto obtido a partir de matrias gordas de origem vegetal e ou animal, com um teor de matria gorda mnimo de 60% e mximo de 62%; (iii) meia margarina, minarina ou halvarina, produto obtido a partir de matrias gordas de origem vegetal e/ou animal, com um teor de matria gorda mnimo de 39% e mximo de 41%; (iv) creme para barrar X%, produto obtido a partir de matrias gordas de origem vegetal e/ou animal, com teores de matria gorda (a) inferiores a 39%, (b) superiores a 41% e inferiores a 60% e (c) superiores a 62% e inferiores a 80%.
2.4.1 A TECNOLOGIA DE PRODUO DE MARGARINAS E CREMES DE BARRAR
As margarinas so constitudas por uma fase aquosa e uma fase lipdica e podem ser caracterizadas como emulses de gua em leo (A/O). A fase aquosa est finamente dispersa, na forma de gotas na fase contnua de gordura. O processamento de margarinas e cremes de barrar pode ser dividido nos seguintes subprocessos: preparao da fase aquosa e da fase lipdica; preparao da emulso, arrefecimento, cristalizao e batedura; e embalagem e armazenamento (Figura 5).
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Figura 5. Esquema geral de fabrico de margarinas (Fonte: Faur, 1996). Preparao da fase aquosa e da fase lipdica A fase aquosa preparada de forma descontnua num tanque. A gua utilizada deve ser potvel, e se necessrio pode ser sujeita a um pr-tratamento (Young, 1983), por filtrao ou radiao UV. Para alm da gua, a fase aquosa pode conter sal ou salmoura, protenas do leite (margarina de mesa e cremes de barrar light), estabilizadores (cremes de barrar light), conservantes e aromatizantes solveis em gua. O ingrediente maioritrio da fase lipdica a mistura de diferentes leos e gorduras. Para conseguir margarinas com as propriedades funcionais desejadas, o rcio de gorduras e leos na mistura decisiva. Ao escolherem-se os leos e gorduras, deve-se atender s 32
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propriedades desejadas para o produto final: o ponto de fuso, a consistncia, a plasticidade e a composio em cidos gordos que vai condicionar a resistncia oxidao. fase lipdica que se adicionam as gorduras interesterificadas. Os principais leos vegetais utilizados so: leos de coco e palmiste, gordura de palma, leos de amendoim, soja, milho, girassol, algodo e o azeite. Os leos de origem animal podem ser provenientes de animais marinhos e peixes (ricos em n-3 PUFA). As gorduras como a banha e o sebo (ricas em cidos gordos saturados) so provenientes de animais terrestres. As caractersticas, como por exemplo o ponto de fuso dos leos vegetais e marinhos, podem ser alteradas atravs de tcnicas de modificao, como a hidrogenao, o fraccionamento e a interesterificao. Caso contrrio, s poderamos utilizar gordura de palma e gorduras de animais terrestres para o fabrico de margarinas com pontos de fuso entre 28 e 42 C. Os vrios leos e gorduras, misturados ou isoladamente, so armazenados em tanques. So mantidos a temperaturas acima do seu ponto de fuso e sob agitao, de forma a evitar o fraccionamento da gordura e facilitar a sua manipulao. Para alm da mistura de gorduras, a fase lipdica constituda tambm por ingredientes minoritrios lipossolveis como emulsionantes, lecitina, aromatizantes, corantes e antioxidantes. Estes ingredientes minoritrios so dissolvidos na mistura de gorduras, antes da fase aquosa ser adicionada, e portanto, antes do processo de preparao da emulso. Preparao da emulso Os vrios leos e gorduras ou misturas de gorduras so transferidos para o tanque de preparao da emulso. As gorduras com ponto de fuso mais elevado so adicionadas primeiro, seguidamente adicionam-se as gorduras com ponto de fuso mais baixo e finalmente os leos. Para completar a preparao da fase lipdica, os emulsionantes e os outros ingredientes lipossolveis minoritrios so adicionados mistura de gorduras. Quando todos os ingredientes da fase lipdica foram misturados adequadamente, a fase aquosa adicionada e criada a emulso, sob agitao controlada mas intensa. Pasteurizao Do tanque de equalizao, a emulso bombeada continuamente e passa atravs de um permutador de calor, para que decorra o processo de pasteurizao, antes da entrada na linha de cristalizao. O processo de pasteurizao decorre a 75-85 C durante 16s e tem vrias vantagens: assegura a inibio do crescimento bacteriano e de outros microrganismos, melhorando a estabilidade microbiolgica da emulso. Alm disso, a pasteurizao da emulso assegura que a emulso chegue linha de cristalizao a 33
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temperatura constante, permitindo texturas de produto constantes. Ao pasteurizar a emulso e ao bombe-la atravs de uma bomba de alta presso, a temperaturas 5-10 C mais elevada que o ponto de fuso da fase lpidica, previne-se tambm a ocorrncia de uma emulso parcialmente cristalizada, quando esta chega ao equipamento de cristalizao. Arrefecimento, cristalizao e batedura A emulso bombeada para a linha de cristalizao atravs de uma bomba de pisto de alta presso. A emulso arrefecida e cristalizada na superfcie do tubo de arrefecimento dos permutadores de superfcie raspada. medida que os cristais se formam, so removidos das paredes das tubagens por raspadores. Quando a emulso cristaliza, os cristais de gordura formam uma rede tridimensional, que retm as gotas de gua e o leo lquido, resultando num produto com propriedades plsticas semi-slidas. Embalagem e armazenamento O produto embalado e armazenado para posterior distribuio. Parte da estabilizao fsica da margarina ocorre s depois de esta ter sado do permutador de calor de superfcie raspada, podendo prolongar-se por mais do que algumas horas. Durante este perodo os cristais vo ligar-se, o que vai contribuir para a dureza do produto. Se uma margarina tiver forte tendncia para formao de cristais , os cristais inicialmente formados podem, sob determinadas condies de armazenamento, transformar-se na forma cristalina . Esta transformao, traduz-se numa alterao de textura, mais granulosa, devido presena de cristais de maior dimenso. Em casos mais extremos, esta transformao pode tambm resultar em exsudao de leo do produto e coalescncia parcial da fase aquosa, o que aumenta a susceptibilidade microbiolgica. Uma forma de evitar este problema reduzir a temperatura de armazenamento para 0 C (Chryson, 1985).
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Produo Enzimtica de Lpidos Estruturados ricos em cidos gordos mega-3, em reactor de alta presso 3 MATERIAIS E MTODOS
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MATERIAIS
Biocatalisadores Os biocatalisadores utilizados foram as preparaes comerciais de lipases termoestveis, imobilizadas em resinas sintticas, gentilmente cedidas por Novozymes, A/S, Bagsvaerd, Dinamarca: as lipases 1,3 selectivas de Rhizomucor miehei (Lipozyme RM IM) e Thermomyces lanuginosa (Lipozyme TL IM) e a lipase de Candida antarctica (Novozym 435). Foi tambm usada a lipase/aciltransferase de Candida parapsilosis, produzida por sobreexpresso do gene correspondente em Pichia pastoris, conforme descrito por Brunel et al. (2004). A produo, purificao e imobilizao desta enzima em Accurel MP 1000 foi realizada pelo grupo do Prof. E. Dubreucq, SupAgro, Montpellier, Frana.
Substratos Foi preparada uma mistura reaccional, de igual composio para todos os ensaios: 45 % (m/m) de leo de palmiste (palm kernel oil, PK), 45 % (m/m) de estearina de palma (palm stearin, PS) e 10% (m/m) de um concentrado comercial de TAGs enriquecido em -3 PUFA (EPAX 4510 TG) . A gordura de palmiste e a estearina de palma, previamente refinadas, branqueadas e desodorizadas, foram gentilmente fornecidas pela FIMA/VG, Produtos Alimentares, Portugal; o concentrado comercial de TAG enriquecido em n-3 PUFA, EPAX 4510TG, foi doado pela Pronova Biocare, Sandefjord, Noruega. Estearina de Palma O leo de palma extrado do mesocarpo do fruto da palmeira Elaieis guineensis L.. A estearina de palma a fraco mais slida obtida por fraccionamento deste leo, aps cristalizao a temperatura controlada. uma fonte natural de gordura slida, por ser rica em cidos gordos saturados e pode ser utilizada no fabrico de produtos como shortenings, margarinas, cremes de barrar e em produtos de pastelaria. O seu valor comercial baixo, o que explica a sua grande difuso pela indstria.
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Produo Enzimtica de Lpidos Estruturados ricos em cidos gordos mega-3, em reactor de alta presso leo de Palmiste
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O leo de palmiste extrado da semente do fruto da palmeira Elaieis guineensis L.. A composio em cidos gordos do leo de palmiste diferente da da gordura de palma: contm aproximadamente 82% cidos gordos saturados (48% cido lurico, 16% cido mirstico e 8% de cido palmtico) e 18% de cidos gordos insaturados (15% cido oleico e 3% cido linoleico). Em climas temperados slido temperatura ambiente, mas funde-se a valores de temperatura inferiores corporal (Rognon, 1996). Pela sua riqueza em cido lurico, tal como o leo de coco, o PK designado por gordura larica. Concentrado de Tracilgliceris enriquecido em -3 PUFA (EPAX 4510 TG) O concentrado de TAG ricos em n-3 PUFA, EPAX 4510 TG, produzido a partir de leos de peixe seleccionados. Contm cerca de 80% PUFAs, dos quais 45% so EPA e 10% so DHA (65% cidos gordos n-3 totais ) (Product Sheet: EPAX 4510).
Reagentes e outros materiais Os solventes utilizados foram todos de grau de pureza pro analisis e obtidos de diferentes fontes.
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Produo Enzimtica de Lpidos Estruturados ricos em cidos gordos mega-3, em reactor de alta presso 3.2 MTODOS
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3.2.1 ENSAIOS DE INTERESTERIFICAO ENZIMTICA PRESSO ATMOSFRICA
Os ensaios de interesterificao presso atmosfrica e em descontnuo, decorreram em reactores cilndricos de vidro de parede dupla, com capacidade de 100 cm3.
Entrada de gua Sada de gua
Figura 6. Reactor de vidro de parede dupla. A manuteno da temperatura estvel e controlada a 60 C (erro aproximado de +/- 0,2 C), foi conseguida atravs de um circuito fechado, com circulao de gua no interior da parede dupla do reactor (Figura 6). A gua foi aquecida atravs de um banho termostatizado.
Pesou-se 40 g do meio reaccional (composto pela mistura de PK, PS e EPAX 4510 TG). Aps a fuso da gordura no reactor e toma de 5mL de meio reaccional (0,46g), adicionou-se 2g do biocatalisador (5,6% (m/m)) e a reaco iniciou-se de imediato, na ausncia de solvente orgnico. Os reactores foram vedados com rolhas de borracha revestidas a folha de alumnio, a fim de evitar a entrada de oxignio e assim minimizar as reaces de oxidao durante o processo. Retiraram-se amostras de 5mL (gordura + biocatalisador), mantendo-se o reactor sob agitao (nos ensaios com agitao) e colocando-se o mesmo sob agitao no momento da toma da amostra (nos ensaios sem agitao), de forma a que a proporo de gordura e enzima se mantivesse mais ou menos constante nas diferentes amostras. Ao longo de cada batch foram retiradas quatro amostras, sendo uma delas correspondente ao T0 (antes do incio da reaco), e as outras (T1, T2 e T3) correspondentes primeira, segunda e terceira horas de reaco. O T0 serviu para comparao das propriedades da mistura de gorduras antes e depois do processo de interesterificao.
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Cada toma de 5ml foi filtrada num funil de vidro forrado com papel de filtro, numa estufa a 70C, de forma a separar as partculas do biocatalisador do meio reaccional. A gordura foi recolhida para tubos de RMN e frascos de plstico, devidamente identificados, e armazenada a -18C, para anlises posteriores.
Foram realizados dois ensaios de interesterificao a 60C e presso atmosfrica com 3 horas de durao cada para a enzima Novozym 435TM (um dos ensaios com agitao e outro sem agitao para simular as condies dentro do reactor de altas presses).
O biocatalisador e a mistura reaccional eram armazenados no frigorfico entre utilizaes.
3.2.2 ENSAIOS
DE
REUTILIZAO
DO
BIOCATALISADOR
PRESSO
ATMOSFRICA Aps 3h de reaco presso atmosfrica, catalisada pela Novozym 435TM, em meio sob agitao magntica e em meio no agitado, o biocatalisador foi removido do meio reaccional, adicionado das pores retiradas ao longo do ensaio e utilizado num novo ensaio com meio fresco, nas condies descritas para o primeiro ensaio (c.f. 3.2.1.). A utilizao sucessiva do mesmo biocatalisador foi feita em 6 batches, o que totaliza 18h de utilizao. A enzima foi reutilizada cinco vezes, de modo a averiguar a estabilidade operacional de cada biocatalisador.
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3.2.3 ENSAIOS DE INTERESTERIFICAO ENZIMTICA EM REACTOR DE ALTA PRESSO
3 2
8 5 Figura 7. Esquema (A) e fotografia (B) do aparelho de alta presso: vaso de altas presses (1) , tubo de ao (2), vlvula (3), manmetro (4), bomba manual (5), bujo (6), clulas de reaco (7) e banho termostatizado (8).
Figura 8. Vaso de altas presses (topo) contendo leo hidrulico Enerpac HF95Y (A); tubos de propileno com tampa de rosca e capacidade para 7mL de mistura reaccional (B); colocao dos tubos no reactor (C). Os ensaios de interesterificao decorreram num vaso de altas presses de ao inoxidvel, imerso num banho de gua termoestatizado, a 60 C ( +0,1 C) (Figura 7). Efectuaram-se ensaios s seguintes presses: 25, 50 e 100 MPa ( + 2 MPa). O fluido de pressurizao utilizado foi o leo hidrulico (EnerpacHF95Y) e a presso desejada era obtida com o auxlio de uma bomba manual (Enerpac, modelo P228) e controlada por um manmetro (Budenberg Gauge Co. Limited). 39
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Em cada ensaio de interesterificao enzimtica, as reaces decorreram em simultneo em 6 tubos de polipropileno, resistentes s altas presses, com uma capacidade de 7mL. Os 6 tubos, completamente cheios de mistura reaccional e hermeticamente fechados, de forma a impedir a entrada do leo hidrulico, eram colocados na vertical, dentro do vaso das altas presses, tal como ilustrado na Figura 8. Dois dos tubos eram utilizados como controlo, e por isso s continham meio reaccional. Aos outros quatro tubos eram adicionadas as lipases imobilizadas (na proporo de 5,6% (m/m) relativamente massa de meio reaccional) : LipozymeTM RM IM, LipozymeTM TL IM ,NovozymTM 435 e a lipase/aciltransferase de Candida parapsilosis imobilizada em Accurel MP 1000. Cada batch durava 3 horas, tal como nos ensaios presso atmosfrica. De modo anlogo, a mesma enzima foi reutilizada cinco vezes, de modo a testar a estabilidade dos
biocatalisadores. Um dos tubos de controlo permanecia ao longo dos 6 batches. Quando o batch terminava, baixava-se a presso do vaso lentamente e o meio reaccional era separado do biocatalisador por filtrao em papel numa estufa a 70 C. Todas as amostras eram armazenadas a -18 C para anlises posteriores. O biocatalisador recuperado e a mistura reaccional eram guardados no frigorfico entre cada utilizao a -4 C. O tempo de reaco, a composio da mistura reaccional e a carga de biocatalisador foram exactamente as mesmas que as usadas no ensaios presso atmosfrica, de forma a que fosse possvel comparar os resultados.
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Produo Enzimtica de Lpidos Estruturados ricos em cidos gordos mega-3, em reactor de alta presso 3.2.4 DETERMINAO DO TEOR DE GORDURA SLIDA A 35 C
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Tal como na indstria alimentar, o seguimento da interesterificao da mistura de gorduras foi feito indirectamente atravs da determinao do teor de gordura slida a 35 C (SFC35 C). O SFC foi determinado na FIMA, Produtos Alimentares, Lda, atravs da tcnica de Ressonncia Magntica Nuclear (RMN) por impulsos, num espectrofotmetro Minispec mq 20, da Bruker, como definido pelos padres internacionais (ISO 8292:1991). Para determinar o SFC35 C, prepararam-se as amostras previamente: a gordura foi exposta a uma sequncia pr-definida de binmios tempo-temperatura. Primeiro, procedeu-se fuso da amostra, num banho a 60 C, durante aproximadamente 10 minutos, com o objectivo de destruir qualquer forma de cristal ou gordura slida.
Em seguida, arrefeceu-se a gordura at sua cristalizao completa, num banho a 0 C, durante 60 minutos.
Finalmente, os tubos foram mantidos temperatura qual a leitura a ser realizada, 35 C. O SFC35 C como j foi referido, um atributo muito importante nas margarinas de mesa, e deve ser o mais baixo possvel, de forma a que no ocorra uma sensao desagradvel na boca, provocado pela textura arenosa e granulosa da gordura. Para cada tempo de reaco, t, a percentagem de reduo de SFC35C foi calculado atravs da seguinte frmula:
(eq. 1)
onde, SFC0: SFC35 C da mistura reaccional inicial SFCt: SFC35 C da mistura reaccional aps o final de um tempo t de interesterificao
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Considera-se que a actividade apresentada pelo biocatalisador ao fim do primeiro batch a sua actividade mxima, nessas condies reaccionais (100%). Assim, a actividade residual ao final de cada batch ser calculada atravs da seguinte expresso:
(eq.2)
onde, A (%): actividade relativa do biocatalisador no final do batch n, expressa em percentagem, % Red. SFC a 35 C Batch n: percentagem de reduo de SFC35 batch n, % Red. SFC a 35 C Batch 1: percentagem de reduo de SFC35 batch 1.
C C
no final do
no final do
3.2.5 DETERMINAO DOS CIDOS GORDOS LIVRES O teor de cidos gordos livres (AGL) das amostras foi determinado seguindo o procedimento indicado pela Norma Portuguesa de determinao da acidez em leos e gorduras comestveis (NP-903).
NaoH 0,1N
Ponto de equivalncia Amostra com concentrao desconhecida de cidos gordos livres
Figura 9. Ponto de viragem da titulao dos cidos gordos livres presentes na amostra com uma soluo de NaOH 0,1 N, identificvel pelo aparecimento de um tom rosa plido [2].
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Cada amostra foi fundida numa estufa a 70 C e pesou-se cerca de 1 g de toma de amostra. Essa toma foi dissolvida em 50 mL de uma mistura de solventes (ter etlico e etanol a 95%, mistura 1:1 (V/V)). O etanol foi previamente neutralizado. De seguida, procedeu-se titulao dos cidos gordos livres presentes na amostra, com uma soluo aquosa de NaOH 0,1 N, em presena do indicador fenolftalena at ao ponto de equivalncia (Figura 9). A acidez (A) foi expressa em termos de percentagem de cido oleico, e igual a:
(eq.3)
onde, V : o volume consumido, expresso em mililitro de soluo titulada de NaOH, c: a concentrao exacta, em mole por litro, da soluo titulada de NaOH utilizada, M: a massa molar, em grama por mole, do cido adoptado para a expresso dos resultados ( igual a 282 para o cido oleico), m: a massa, em grama da toma do ensaio. Uma vez que se utilizou uma soluo 0,1 N de NaOH para neutralizar cido oleico, a frmula vem:
(eq. 4)
3.2.6 DETERMINAO DOS PRODUTOS DE OXIDAO PRIMRIOS E SECUNDRIOS Os produtos de oxidao foram determinados por espectrofotometria no UV (Ultra Violeta), segundo a Norma Portuguesa NP 970. A anlise por espectofotometria no UV pode fornecer indicaes sobre a qualidade de uma matria gorda, o seu estado de conservao e as modificaes devidas ao processamento tecnolgico.
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A presena de produtos de oxidao primria (hidroperxidos conjugados) e produtos de oxidao secundria (cidos gordos livres, aldedos e cetonas) avaliada por espectofotometria no UV a = 232 nm e = 270 nm, respectivamente. As absorvncias nos comprimentos de onda previstos no mtodo so devidas respectivamente presena de sistemas dinicos e trinicos conjugados. Pesa-se num balo aferido de 25 ml, cerca de 0,25 g da amostra fundida, completando o volume com o solvente, iso-octano para espectrofotometria, e homogeneiza-se. Enchem-se as cuvettes de quartzo com a soluo obtida e medem-se as absorvncias, usando como referncia o solvente utilizado, nos seguintes comprimentos de onda: 232, 268, 270 e 272 nm . Os valores medidos devem estar preferencialmente no intervalo entre 0,1 a 0,8. Caso contrrio, torna-se necessrio repetir as medies recorrendo a solues mais concentradas ou mais diludas. Selecciona-se para valor de absorvncia a 270nm, o maior dos valores de absorvncia, medidos nos comprimentos de onda 268, 270 e 272nm, relativo aos produtos secundrios de oxidao. Os valores de absorvncia so expressos em termos de extino especfica (extino de uma soluo de matria gorda a 1g/100ml no solvente prescrito, para um percurso ptico de 1 cm), designado por K (coeficiente de extino). Exprimem-se as extines especficas (coeficientes de extino) nos diferentes
comprimentos de onda, de acordo com a frmula:
(eq. 5)
onde, K: extino especfica no comprimento de onda , E: extino medida no comprimento de onde . c: concentrao da soluo em g/ 100 ml. s: espessura da tina em centmetros.
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Produo Enzimtica de Lpidos Estruturados ricos em cidos gordos mega-3, em reactor de alta presso 4 RESULTADOS E DISCUSSO
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Como foi referido anteriormente (c.f. 3.2.4) determinou-se o teor de gordura slida a 35C, para todas as amostras antes e aps interesterificao, presso atmosfrica e a altas presses (25, 50, 75 e 100 MPa). A extenso da interesterificao foi avaliada indirectamente atravs da reduo do teor de gordura slida da mistura a 35 C, depois da interesterificao. temperatura de 35C, prxima da temperatura corporal humana, desejvel um teor baixo em gordura slida para que o produto final tenha a textura adequada, causando uma sensao agradvel na boca. Um valor elevado de SFC35C confere ao produto uma textura grosseira indesejvel. 4.1 EFEITOS DA AGITAO NA CINTICA DA REACO
A evoluo dos valores de SFC35C do meio reaccional ao longo dos 6 batches sucessivos de interesterificao catalisados pela lipase comercial Novozym 435TM, com e sem agitao, e que decorreram presso atmosfrica, encontra-se representada na figura 10.
Figura 10. Evoluo dos valores de SFC
35 C
da mistura reaccional ao longo dos sucessivos

TM
batches de interesterificao catalisados pela Novozym 435 agitao (B), presso atmosfrica e a 60 C.
, com agitao (A) e sem
A diminuio dos valores de SFC35
indica que a enzima testada capaz de catalisar a
interesterificao a 60 C e presso atmosfrica, com e sem agitao do meio reaccional (Figura 10). Estes valores de SFC foram utilizados para calcular a percentagem de reduo do SFC35C ao longo das reaces, de acordo com a equao atrs mencionada (c.f. 3.2.4). 45
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Figura 11. Evoluo da percentagem de reduo dos valores de SFC35
da mistura
reaccional ao longo do tempo (h), durante as sucessivas utilizaes da enzima Novozym 435TM nos ensaios de interesterificao, com agitao (A) e sem agitao (B), presso atmosfrica e a 60 C.
Atravs da anlise da figura 11, pode-se verificar ao longo das 6 utilizaes de Novozym 435, que a percentagem de reduo de SFC35
C
das misturas reaccionais foi menor nos
ensaios sem agitao, o que se explica pela presena de limitaes difusionais. Observouse tambm um comportamento semelhante com os restantes biocatalisadores testados (Lopes, 2009).
Figura 12. Evoluo da percentagem de reduo dos valores de SFC catalisados pela enzima Novozyme 435 atmosfrica e a 60 C.
TM
35 C
da mistura
reaccional no final de cada batch de 3 horas, durante os ensaios de interesterificao, com agitao (A) e sem agitao (B), presso
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A percentagem de reduo de SFC35 C em ambos os ensaios, mantm-se aproximadamente constante no final de cada batch de 3 horas, o que permite concluir que a actividade cataltica da enzima se mantm (Figura 12).
4.2
EFEITOS DA PRESSO NA ACTIVIDADE DE INTERESTERIFICAO E NA ESTABILIDADE ENZIMTICA
Apresentam-se em seguida os resultados dos ensaios de interesterificao realizados com os quatro biocatalisadores testados, a 60 C e a 25, 50 e 100 MPa ( tambm a 75 MPa para Candida parapsilosis). Nas figuras 13 e 14 pode-se observar a evoluo dos valores de SFC35C das misturas reaccionais interesterificadas pelas diferentes lipases, aps cada utilizao de 3 horas s diferentes presses, e as respectivas percentagens de reduo. Em cada figura, so tambm apresentados os resultados dos ensaios presso atmosfrica (0,1 MPa), sem agitao. Relativamente Lipozyme RM IMTM, o valor de SFC35 aumento no muito acentuado do SFC35
C
no final do primeiro batch
semelhante para todas as presses e ao longo dos batches seguintes verifica-se um

C
final (Figura 13 (A)). Parece tratar-se de uma
enzima pouco sensvel s variaes de presso, mas que diminui ligeiramente a sua actividade com o aumento da mesma (Figura 13 (B)). A enzima Lipozyme TL IMTM no perde actividade cataltica, uma vez que os valores de SFC 35C mantm-se praticamente constantes ao longo dos 6 batches (Figura 13 (C)). Esta enzima mantm-se activa ao longo das utilizaes de 3h e sua actividade parece aumentar com o aumento da presso (Figura 13 (D)). O mesmo se verifica para a Novozym 435TM, uma vez que as misturas interesterificadas mantm os valores de SFC35C constantes no final das 5 reutilizaes (Figura 14 (A)) e, imagem da Lipozyme TL IM, a sua actividade cataltica parece aumentar com o aumento da presso (Figura 14 (B)). Com a lipase/aciltransferase de Candida parapsilosis, o valor de SFC35
C
da mistura
reaccional no final do 1 batch semelhante para todas as presses superiores atmosfrica e a percentagem de reduo menor que a. de notar que o SFC 35 C final da mistura interesterificada presso atmosfrica sem agitao superior e a percentagem de reduo menor que a das misturas submetidas a altas presses.
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Para esta lipase, a presso parece ter um efeito activador da sua actividade. Contudo, ao longo dos batches seguintes, verifica-se um aumento linear do SFC35 C, o que prova uma diminuio da actividade de interesterificao da enzima (Figura 14 (C)). Para as presses de 25, 50, 75 e 100 MPa, verifica-se um decrscimo da sua actividade logo aps o primeiro batch de 3 horas. Ao longo das 6 utilizaes sucessivas do mesmo biocatalisador, a cada uma das presses, observa-se uma diminuio linear da actividade cataltica (Figura 14 (D)). Os valores de SFC35
C
foram convertidos em actividade relativa, de modo a descrever a
cintica de desactivao enzimtica (c.f.3.2.4). A figura 15 apresenta as actividades relativas de interesterificao de cada enzima nos ensaios presso atmosfrica sem agitao e nos ensaios a altas presses. Pele anlise da figura 15 (A) constata-se que a enzima Lipozyme RM IMTM se apresenta mais estvel presso atmosfrica. Para presses mais elevadas (25, 50 e 100 MPa), a actividade relativa do biocatalisador decresce linearmente. A Lipozyme TL IMTM parece manter a sua estabilidade operacional ao longo das sucessivas reutilizaes quando sujeita a presses superiores atmosfrica. Pelo contrrio, verifica-se uma inactivao desta enzima quando actua presso atmosfrica (Figura 15 (B)). De acordo com a figura 15 (C), o comportamento da Novozym 435TM muito semelhante ao da Lipozyme TL IMTM: a estabilidade operacional do biocatalisador parece aumentar com a presso. De acordo com a figura 15 (D), a manuteno da estabilidade operacional da
lipase/aciltransferase de Candida parapsilosis maior presso atmosfrica. s presses de 25, 50, 75 e 100 MPa observa-se um decrscimo dessa estabilidade.
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Figura 13.Valores de SFC 35 C das misturas interesterificadas por Lipozyme RM IM (A) e Lipozyme TL IM (C), a diferentes presses, aps cada utilizao de 3h e respectivas percentagens de reduo de SFC35 C (B) e (D). 49
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Figura 14. Valores de SFC 35 C das misturas interesterificadas por Novozym 435 (A) e pela lipase/aciltransferase de Candida parapsilosis (C) a diferentes presses, aps cada utilizao de 3h e respectivas percentagens de reduo de SFC35 C (B) e (D). 50
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Figura 15. Actividade relativa de Lipozyme RM IM, Lipozyme TL IM, Novozym 435 e da lipase/aciltransferase de Candida parapsilosis nos ensaios a 60 C presso atmosfrica, sem agitao, e nos ensaios a altas presses (25, 50 e 100 MPa), (A) (B) (C) e (D) respectivamente. 51
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4.3
EFEITO DA PRESSO NA REACO DE HIDRLISE
OS AGL so um produto da interesterificao enzimtica. Esta reaco decorre geralmente em simultneo com a reaco de hidrlise. A percentagem de AGL um importante critrio de qualidade: uma elevada percentagem neste tipo de compostos indesejvel, uma vez que contribuem para a formao de off-flavors (rano) quando sofrem oxidao. No entanto, a produo de baixos teores de MAG e DAG pode ser benfica para o fabrico de margarina. Os DAG podem ser usados como estabilizadores dos cristais , e os MAG (na concentrao de 0,3%) so adicionados como emulsionantes nas emulses leo/gua. Os teores de AGL presentes nas misturas reaccionais aps cada reutilizao das enzimas a 0,1, 25, 50 e 100 MPa, encontram-se representados na figura 16.
Figura 16. Evoluo dos teores de cidos gordos livres presentes nas misturas reaccionais, submetidas a reaces de interesterificao a 0,1 MPa e a altas presses (25, 50 e 100 MPa), ao longo dos 6 batches, pelas enzimas Lipozyme RM IMTM (A), Lipozyme TL IMTM (B), Novozym 435TM e pela lipase/aciltransferase de Candida parapsilosis (C).
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O teor de AGL relativamente baixo nas misturas de gordura antes de serem submetidas reaco de interesterificao ( = 0,18). Ao fim do primeiro batch, o teor de AGL aumenta, o que traduz um favorecimento da reaco de hidrlise. Este facto pode ser explicado pela presena de gua nos suportes de imobilizao ou por uma maior actividade de interesterificao neste primeiro ensaio. Para dois dos biocatalisadores testados, a Lipozyme RM IMTM e a lipase/aciltransferase de Candida parapsilosis, verifica-se uma diminuio do teor de cidos gordos livres ao longo das diversas reutilizaes, provavelmente devido ao consumo de gua presente no prprio biocatalisador e, consequentemente diminuio da extenso da reaco de hidrlise. Os altos teores de AGL nas misturas reaccionais interesterificadas pela lipase/aciltransferase (batches 1 e 2) devem-se ao aw inicial de 0,97 deste biocatalisador (Osrio et al.,2009). Para a Lipozyme TL IMTM e para a Novozym 435TM, o teor de cidos gordos livres da mistura reaccional permanece praticamente constante ao longo dos 6 batches, com um valor mdio de aproximadamente 2,3 e 2,7, respectivamente.
Os teores de AGL das misturas reaccionais interesterificadas presso atmosfrica, so semelhantes queles observados nas misturas reaccionais interesterificadas a altas presses.
4.4
EFEITO DA PRESSO NA OXIDAO DA MISTURA REACCIONAL
Os resultados dos produtos de oxidao primrios e secundrios durante os vrios ensaios de interesterificao presso atmosfrica, com e sem agitao, e a alta presso, temperatura de 60 C, so apresentados nos quadros 2 e 3.
presso atmosfrica, so apenas apresentados os valores dos produtos de oxidao presentes antes do incio da reaco (tempo zero) e no final da primeira (3h) e da ltima (18h) utilizao do biocatalisador (tempo trs do batch 1 e tempo 3 do batch 6). Nos ensaios presso atmosfrica, verifica-se que as misturas reaccionais interesterificadas em reactor com e sem agitao tm teores muito semelhantes de produtos primrios e secundrios de oxidao. Tambm no ocorrem variaes considerveis nestes teores ao longo do tempo em que decorreram os ensaios, o que demonstra que a oxidao desprezvel.
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Quadro 2. Teores de produtos primrios e secundrios de oxidao formados durante os ensaios de interesterificao presso atmosfrica, catalisados por Novozym 435TM, em reactor, com e sem agitao, e temperatura de 60 C.
Produtos de oxidao Ensaio Amostra Tempo zero Com agitao Batch 1 Tempo 3 Batch 6 Tempo 3 Tempo zero Sem agitao Batch 1 Tempo 3 Batch 6 Tempo 3 Produtos primrios 4,4 4,4 4,2 4,1 4,6 4,1 Produtos secundrios 1,4 0,4 0,4 1,4 0,4 1,4
Em relao aos ensaios a alta presso, apresentam-se apenas os resultados das amostras referentes ao tempo zero, aos tubos de controlo que no continham enzima (brancos) eque foram sujeitos a cada preso e primeira e ltima utilizao dos diferentes biocatalisadores (Quadro 3 ).
Ao compararmos os quadros 2 e 3, apercebemo-nos que os valores das absorvncias referentes presena dos produtos primrios e secundrios de oxidao formados durante os ensaios a altas presses so superiores aos valores correspondentes dos ensaios presso atmosfrica. Este resultado pode ser explicado pelo facto de a presso induzir uma modificao na estrutura da gordura por um mecanismo desconhecido que origina compostos que absorvam no mesmo comprimento de onda dos produtos de oxidao. Nos ensaios a altas presses, o oxignio disponvel para a oxidao apenas aquele que se encontra dissolvido na amostra, o que, no nosso entender, ser um factor limitante da reaco. interessante observar que os tubos de controlo que se mantiverem ao longo dos 6 batches (18h) a altas presses apresentam valores mais altos de absorvncia a 232nm (13,1; 18,8 e 18,1) e absorvncia a 270nm (4,7; 5,8 e 5,6), mostrando que este fenmeno no est relacionado com a actividade enzimtica, mas apenas com o aumento da presso.
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Quadro 3. Teores de produtos primrios e secundrios de oxidao, formados durante os ensaios de interesterificao presso atmosfrica, catalisados por Lipozyme TLIM, Lipozyme RM IM, Novozym 435 e pela lipase/aciltransferase de Candida parapsilosis, em reactor de altas presses, temperatura de 60 C.
Produtos de oxidao Presso Amostra Lipozyme TL IM "Batch" 1 Lipozyme TL IM "Batch" 6 Lipozyme RM IM "Batch" 1 Lipozyme RM IM "Batch" 6 Novozym 435 "Batch" 1 25 MPa Novozym 435 "Batch" 6 Lipase/aciltransferase "Batch" 1 Lipase/aciltransferase "Batch" 6 Branco Branco que se mantm ao longo dos 6 "batches" Tempo zero Lipozyme TL IM "Batch" 1 Lipozyme TL IM "Batch" 6 Lipozyme RM IM "Batch" 1 Lipozyme RM IM "Batch" 6 Novozym 435 "Batch" 1 50 MPa Novozym 435 "Batch" 6 Lipase/aciltransferase "Batch" 1 Lipase/aciltransferase "Batch" 6 Branco Branco que se mantm ao longo dos 6 "batches" Tempo zero Lipozyme TL IM "Batch" 1 Lipozyme TL IM "Batch" 6 Lipozyme RM IM "Batch" 1 Lipozyme RM IM "Batch" 6 100 MPa Novozym 435 "Batch" 1 Novozym 435 "Batch" 6 Lipase/aciltransferase "Batch" 1 Lipase/aciltransferase "Batch" 6 Branco Branco que se mantm ao longo dos 6 "batches" Produtos primrios 6,4 5,3 5,9 8,0 7,8 6,4 8,3 5,9 6,6 13,1 3,6 4,5 6,4 7,6 7,2 8,6 7,4 8,1 7,5 11,2 18,8 4,1 6,4 6,9 6,7 6,3 6,9 7,4 7,0 6,9 6,2 18,1 Produtos secundrios 2,3 2,4 2,2 2,5 2,6 2,3 2,8 1,9 2,2 4,7 1,4 2,6 2,0 2,5 1,6 2,8 2,5 3,0 2,1 1,8 5,8 1,5 2,7 2,1 2,6 2,3 2,6 2,5 2,0 2,1 2,0 5,6
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Produo Enzimtica de Lpidos Estruturados ricos em cidos gordos mega-3, em reactor de alta presso 5 CONCLUSES E SUGESTES PARA FUTUROS TRABALHOS
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No mbito da presente tese, avaliou-se indirectamente o processo de interesterificao de uma mistura de gorduras (45% (m/m) PS, 45% (m/m) PK e 10% (m/m) EPAX 4510), presso atmosfrica e a altas presses, atravs da determinao do SFC pela tcnica de RMN. O biocatalisador Novozym 435TM demonstrou a sua capacidade para catalisar reaces de interesterificao presso atmosfrica, com e sem agitao do meio reaccional, atravs da diminuio dos teores de gordura slida a 35 C da mistura reaccional. Ao longo das sucessivas reutilizaes da enzima, o decrscimo nos valores de SFC
35 c
foi-se tornando
menos evidente, devido perda da actividade cataltica. A percentagem de reduo do SFC35 C foi menor sem agitao, o que se explica pela presena de limitaes difusionais. As quatro enzimas (Lipozyme RM IMTM, Lipozyme TL IMTM, Novozym 435TM e a lipase/aciltransferase de Candida parapsilosis) que catalisaram os ensaios de
interesterificao a 25, 50, 75 e 100 MPa, demonstraram que se mantm activas a altas presses. Verificou-se que a actividade cataltica diminua ligeiramente com o aumento da presso para a enzima comercial Lipozyme RM IMTM" e para a lipase/aciltransferase. J para a Novozym 435TM e para a Lipozyme TL IMTM observou-se exactamente o oposto: um aumento da actividade cataltica com o aumento da presso.
Em relao estabilidade operacional, a enzima que se manteve mais estvel ao longo das sucessivas reutilizaes foi a Lipozyme TL IMTM. Pelo contrrio, a enzima que perdeu mais rapidamente a sua actividade foi a lipase/aciltransferase.
A presena de cidos gordos livres na mistura reaccional, provenientes do primeiro passo da interesterificao enzimtica ou de hidrlise, tem sido um factor limitante na obteno de melhores rendimentos, em comparao com o mtodo de interesterificao qumica tradicional. Os teores de AGL das misturas reaccionais interesterificadas a altas presses foram muito semelhantes aos teores de AGL das misturas reaccionais interesterificadas presso atmosfrica. Como tal, pode-se concluir que a presso no exerceu influncia sobre este parmetro.
Os teores de produtos primrios e secundrios de oxidao das misturas reaccionais interesterificadas a altas presses foram superiores aos das misturas reaccionais 56
2011
interesterificadas presso atmosfrica. Pode-se concluir que o aumento da presso, altera a estrutura da gordura atravs de um mecanismo desconhecido que origina compostos que absorvam no mesmo comprimento de onda dos produtos de oxidao.
O facto da mistura reaccional ser constituda, em 10%, por um concentrado rico em cidos gordos n-3 PUFA, torna-a mais vulnervel oxidao. Sugere-se que em trabalhos futuros, se incorporem compostos antioxidantes na mistura reaccional, a fim de minimizar a formao de produtos primrios e secundrios de oxidao.
Seria tambm interessante, para completar este trabalho, fazer a anlise por cromatografia lquida de alta eficincia (High Performance Liquid Cromatography, HPLC) do perfil dos TAGs presentes nas amostras, a fim de esclarecer se ocorreram alteraes na selectividade das enzimas e se obtiveram lpidos estruturados diferentes daqueles obtidos presso atmosfrica.
Para finalizar, este estudo preliminar mostrou que a interesterificao catalisada por enzimas imobilizadas, pode ser uma alternativa ao processo tradicional de interesterificao qumica. Demonstrou tambm ser possvel a realizao da interesterificao enzimtica mesmo em condies consideradas geralmente como desfavorveis para a actividade enzimtica. Este processo mais ecolgico melhora a actividade enzimtica; modifica a selectividade dos biocatalisadores e permite a obteno de lpidos estruturados diferentes daqueles obtidos presso atmosfrica.
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Produo Enzimtica de Lpidos Estruturados ricos em cidos gordos mega-3, em reactor de alta presso 6 REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS
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PRODUO ENZIMTICA DE LPIDOS ESTRUTURADOS, RICOS EM CIDOS GORDOS POLINSATURADOS MEGA-3, EM REACTOR DE ALTA PRESSO

Joana Mendes Madeira Rodrigues

Dissertao para obteno do Grau de Mestre em Engenharia Alimentar

CONCLUSES E SUGESTES PARA FUTUROS TRABALHOS...............................56 REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS .............................................................................58

ENQUADRAMENTO TERICO PROPRIEDADES FISICO-QUMICAS DAS GORDURAS

2.1.2 PROPRIEDADES FSICAS DAS GORDURAS

TCNICAS DE MODIFICAO DAS PROPRIEDADES FSICO-QUMICAS DAS GORDURAS

(B) Com lipase 1,3-especfica.

2.4.1 A TECNOLOGIA DE PRODUO DE MARGARINAS E CREMES DE BARRAR

3.2.1 ENSAIOS DE INTERESTERIFICAO ENZIMTICA PRESSO ATMOSFRICA

Entrada de gua Sada de gua

O biocatalisador e a mistura reaccional eram armazenados no frigorfico entre utilizaes.

3.2.3 ENSAIOS DE INTERESTERIFICAO ENZIMTICA EM REACTOR DE ALTA PRESSO

Ponto de equivalncia Amostra com concentrao desconhecida de cidos gordos livres

comprimentos de onda, de acordo com a frmula:

Figura 10. Evoluo dos valores de SFC

da mistura reaccional ao longo dos sucessivos

, com agitao (A) e sem

A diminuio dos valores de SFC35

indica que a enzima testada capaz de catalisar a

Figura 11. Evoluo da percentagem de reduo dos valores de SFC35

das misturas reaccionais foi menor nos

EFEITOS DA PRESSO NA ACTIVIDADE DE INTERESTERIFICAO E NA ESTABILIDADE ENZIMTICA

no final do primeiro batch

semelhante para todas as presses e ao longo dos batches seguintes verifica-se um

final (Figura 13 (A)). Parece tratar-se de uma

foram convertidos em actividade relativa, de modo a descrever a

EFEITO DA PRESSO NA REACO DE HIDRLISE

EFEITO DA PRESSO NA OXIDAO DA MISTURA REACCIONAL

Haumann, B.F. (1994) Tools: hydrogenation, interesterification. INFORM, 5(6) p.668-

Lida, A. M. D. N., Ali, A. R. (1998) J Am Oil Chem Soc 75: 1625.

Rozenaal, A. (1992) Interesterification of oils and fats. INFORM, 3(11), pp.1232-1237.

Gmez-Aldapa, C.A. (2002) J Am Oil Chem Soc 79: 855

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Young, V. (1983). Margarine production. American soybean, pp. 66-73.

[1] http://www.iseo.org/FoodFatsOils2006.pdf [2] http://img.sparknotes.com/figures/3/3a5994498f24d59f5d5d762b40844a2a/titsetup.gif

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