ICB/ DEPTO.

DE MICROBIOLOGIA/ VIROLOGIA
Cultivo de vrus animais O cultivo de um determinado vrus animal limitado pela necessidade de um tecido vivo em que as clulas possuam receptores apropriados, e que sejam suscetveis replicao dos vrus aps a penetrao no citoplasma. Inicialmente dispunha-se apenas de animais de experimentao em que se conseguia obter a multiplicao dos vrus, como o vrus da Raiva em coelhos. Hoje em dia essa prtica persiste, sendo um exemplo importante a vigilncia de arboviroses (de artropod-born ou veiculado por artrpodes, como os vrus da dengue e febre amarela, transmitidos por mosquitos do gnero Aedes). Nesse procedimento hemolinfa de mosquitos ou sangue de animais silvestres so inoculados em crebro de camundongos neonatos, observando-se ocorre o aparecimento de sintomas de paralisia quando h presena de um arbovrus. Uma alternativa a inoculao desses fluidos nas cavidades (ex.: alantide) de ovos embrionados (Figura 1), cujo epitlio ou eventualmente o prprio tecido embrionrio seja sucetvel infeco por determinados vrus (por exemplo, os vrus do Sarampo, Influenza, Polio e Herpes crescem bem nessas condies).

Figura 1- Esquema de inoculao de vrus em ovos embrionados. O estudo dos vrus animais teve um grande avano a partir dos anos 40, quando se comeou a utilizar as culturas celulares, desenvolvidas inicialmente por Enders e colaboradores, para a multiplicao in vitro do vrus da poliomielite. As clulas podem ser obtidas a partir de culturas de explante. Essa tcnica consiste na utilizao de fragmentos de tecidos ou rgos, que so cultivados em meio adequado de crescimento celular. Os fragmentos aderidos superfcie de um frasco apropriado vo liberar espontaneamente as clulas, de maneira a formar uma camada monocelular. Essas culturas de clulas em monocamada podem tambm ser preparadas pelo tratamento do tecido original, ou da linhagem estabelecida j cultivada em frascos, com agentes dispersantes tais como: enzimas proteolticas (ex.: tripsina) e/ou substncias quelantes (ex.: EDTA). Assim, com a retirada das protenas, do clcio e do magnsio, necessrios para a ligao na estrutura do tecido ou superfcie de cultivo (plstico ou vidro), as clulas so dispersas. Isso feito em meio nutritivo, sendo que aps algumas horas de incubao as clulas aderem-se superfcie do novo frasco, e multiplicam se formando outra camada celular. A esse procedimento dado o nome de sub-cultivo, passagem ou repique (Figura 2).

As culturas primrias so derivadas diretamente dos tecidos. Esse tipo de cultura celular constitudo por clulas diplides (contm o mesmo nmero de cromossomos da espcie que deu origem cultura). A cultura primria geralmente mais sensvel que as demais para o cultivo de vrus, e pode ser utilizada para a produo de vacinas. Entretanto, apresenta algumas desvantagens, entre elas, a maior dificuldade de obteno, o alto custo e a possibilidade de contaminao por vrus latentes. As culturas primrias quando sub-cultivadas, em geral, degeneram e morrem aps a segunda ou terceira passagem.

Figura 2 Esquema indicando como realizado um subcultivo para propagao de cultura celular. Um exemplo ser realizado atravs de um filme em sala de aula. No decorrer de sub-cultivos das culturas primrias, pode haver a seleo de clones, capazes de sobreviver e se multiplicar por 50 ou mais passagens. Esses clones do origem s chamadas linhagens celulares, tambm denominadas de linhagens estabelecidas ou contnuas, que podem ser aneuplides (com nmero de cromossomos alterado). So sensveis para o isolamento de vrus e so de manuteno relativamente fcil. Os estoques devem ser congelados em baixo nmero de passagens, e reativados quando necessrio, mantendo assim a mesma sensibilidade infeco. Quando a cultura de explante feita a partir de tecido tumoral, em geral as linhagens celulares so obtidas mais rapidamente e so aneuplides. Estas podem ser teis para fins de diagnstico, isolamento e propagao de vrus, produo de reagentes, mas no para produo de vacinas. Outro mtodo, utilizado para a obteno de culturas celulares, baseia-se no cultivo de clulas em suspenso, obtidas de tecido originalmente no aderente ou adaptadas a essa condio. Neste caso, grandes populaes de clulas podem ser obtidas, sendo teis para o preparo de grandes volumes de vrus com altos ttulos, como na produo de antgenos para confeco de vacinas ou reagentes para diagnstico.

Isolamento de vrus de material clnico Como vimos acima, os sistemas celulares mais utilizados para o isolamento dos vrus so: as culturas de clulas in vitro, os ovos embrionados de galinha e os animais de laboratrio. A grande variedade de mtodos e sistemas utilizados no isolamento de vrus de amostras de material clnico reflete, de fato, que as condies timas de isolamento so distintas para cada vrus. Se um hospedeiro insensvel inoculado com uma amostra contendo determinado vrus, este provavelmente no ser isolado, e um resultado falso negativo ser obtido. As culturas celulares apresentam grande variao na sua suscetibilidade aos diferentes vrus, por exemplo: para o isolamento de poliovrus as culturas mais indicadas so as culturas primrias de rim de macaco ou as linhagens celulares de rim de macaco (GMK - rim de macaco verde ou LLC-MK2 - rim de Macaca mulata) ou ainda linhagens celulares humanas (RD - rabdomiosarcoma humano). Para adenovrus a linhagem mais indicada a HEp-2 (carcinoma epitelial humano); para o vrus do sarampo e o vrus Herpes, a linhagem celular mais indicada a VERO (rim de macaco verde). Quando pequenas quantidades de vrus esto presentes numa amostra, um resultado positivo s pode ser obtido quando o sistema mais sensvel utilizado. Portanto, muito importante que o laboratrio seja informado da sndrome clnica, ou do vrus suspeito, para que se possa utilizar o melhor mtodo de deteco. Nenhuma tcnica laboratorial (ou cultura celular) no entanto, ser eficiente, se a amostra no for colhida, transportada, armazenada e processada de forma adequada. As amostras precisam ser colhidas na fase aguda da infeco e sua escolha deve ser apropriada: fezes, para vrus entricos; secreo nasal para vrus respiratrios; sangue, para vrus de transmisso sangnea, etc. As amostras, quando colhidas com "swab" (tipo de cotonete), devem ser imediatamente colocadas em soluo salina tamponada ou meio de cultura, para evitar que ressequem com a conseqente desnaturao dos vrus. De forma geral, todas as amostras devem ser transportadas em temperatura de geladeira para o laboratrio imediatamente, e assim conservadas at o momento do diagnstico, para evitar a inativao dos vrus pelo calor.As amostras, antes da inoculao em culturas celulares, ou antes de serem usadas em qualquer teste de diagnstico, devero ser processadas adequadamente. Esse processamento, de modo geral, inclui fases de eluio dos vrus da amostra, com uso de salina tamponada; clarificao por centrifugao, para eliminao de resduos indesejveis, e descontaminao com agentes antibacterianos e/ou antifngicos. Evita-se assim, que resduos txicos ou microrganismos contaminantes interfiram no isolamento dos vrus e no diagnstico.