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TECNICAS MICROBIOLOGICAS PARA EL DIAGNOSTICO DE INFECCIONES El diagnstico microbiolgico es el conjunto de procedimientos y tcnicas complementarias empleadas para establecer la etiologa

del agente responsable de una enfermedad infecciosa y poder as proceder a su tratamiento y a tomar, en caso de que fuera necesario, las medidas correspondientes para evitar la diseminacin del patgeno. Para llevarlo a cabo, se parte de la informacin acumulada por el mdico y que se recoge en la historia clnica del paciente en forma de sntomas, signos y diagnstico clnico ms probable a su entender. El diagnstico microbiolgico en bacteriologa puede clasificarse en distintos tipos: Directos: Implican la demostracin del agente patgeno, sus metabolitos o alguno de sus componentes antignicos en los fluidos orgnicos del paciente. Indirectos: Implican la demostracin de la huella que el agente patgeno ha dejado en su contacto con el sistema inmunocompetente del paciente. Una vez tenemos las muestras adecuadas, podemos comenzar a realizar las tcnicas diagnsticas correspondientes. Dentro del diagnstico microbiolgico incluiremos: 1.- Examen microscpico 2.- Crecimientos en cultivos 3.- Evidencia indirecta del crecimiento 4.- Tcnicas inmunitarias Cada una de estas tcnicas tiene sus ventajas y sus inconvenientes, pero son todas ellas muy necesarias para un buen resultado final. EXAMEN MICROSCPICO: La visualizacin de los microorganismos patgenos es la tcnica ms evidente. Sin embargo, debido a su pequeo tamao y a la similitud estructural existente entre algunos de ellos, se generan numerosas complicaciones. Para evitar el problema del tamao, se utilizan sistemas de ampliacin de imagen como lupas o microscopios. Las tinciones diferenciales y especficas, nos permitirn paliar el problema de la similitud. Habitualmente, la visin microscpica de los agentes patgenos no nos ofrecer un diagnstico definitivo, sino una orientacin diagnstica. Sin embargo, la visualizacin de estructuras especficas puede ser un hecho que nos garantizar una determinacin garantizada. Los microscopios pticos permiten ver bacterias, hongos y protozoos. Para ver virus es necesaria una resolucin mucho mayor que slo alcanza el microscopio electrnico, mientras que las tenias y trematodos no requieren tcnicas de ampliacin de imagen. Los exmenes en fresco dejan visualizar los microorganismos sin necesidad de fijarlos ni teirlos, y por tanto vivos. stos, son especialmente importantes en las infecciones producidas por parsitos intestinales puesto que pueden detectar huevos, quistes y trofozoitos que por sus caractersticas morfolgicas pueden generar por si solas un diagnstico definitivo. Las muestras de heces deben pretratarse antes de realizar la preparacin en fresco con el fin de aclarar y concentrar los parsitos. Tambin las infecciones producidas por Tricomonas vaginalis se diagnostican de este modo en el exudado uretral.

En ocasiones la visualizacin en fresco es insuficiente para diferenciar los microorganismos y es necesario aumentar el contraste respecto al medio en que se encuentran. Para ello se utilizan las tinciones, que posibilitan la observacin de la cantidad, tamao, morfologa y disposicin relativa de los microorganismos. Las tinciones suponen la muerte de los microorganismos ya que todas tienen un paso previo de fijacin al portaobjetos que se realiza con calor o con lavado en alcoholes. A continuacin, se aplican sustancias coloreadas que tien la superficie de los microorganismos. Se denominan simples cuando utilizan un solo colorante, o bien diferenciales cuando usan ms de uno y tien de forma especfica distintas estructuras bacterianas. Las tinciones diferenciales son las ms utilizadas ya que ofrecen ms informacin diagnstica. Algunas de las ms importantes son: a) Tincin de gram b) Tincin de Ziehl-Neelsen c) Tincin de auramina. La auramina es un compuesto que se une especficamente a las bacterias cido-alcohol resistentes y que emite luz verde brillante cuando es excitado con luz ultravioleta. Se utiliza en el diagnstico de tuberculosis. En las muestras de esputo de pacientes con esta enfermedad pueden aparecer bacilos que emiten luz verde manzana en el microscopio de fluorescencia cuando se tien con auramina. Esta tcnica es la ms utilizada el diagnstico de tuberculosis, pero tambin es til para la deteccin de otros patgenos como los quistes de Cryptosporidium, protozoo parsito intestinal causante de diarreas en individuos inmunocomprometidos. CRECIMIENTOS EN CULTIVOS Denominamos cultivo al proceso de laboratorio por el que se induce el crecimiento cuantitativo de los agentes patgenos. Para conseguir su crecimiento de manera artificial es necesario un aporte nutritivo suficiente as como las condiciones fsicas adecuadas para su desarrollo. Para ello se utilizan los medios de cultivo. Por lo general, todos los microorganismos necesitan unos elementos imprescindibles que incluyen fuentes de energa, de carbono, algunas sales y elementos y por supuesto agua. Algunos requieren adems otras sustancias adicionales como vitaminas o aminocidos esenciales para cada especie. Al igual que ocurre con su nutricin, no todos necesitan las mismas condiciones fsicas para crecer, por lo que hay que individualizar la temperatura, la humerdad, el pH y otras caractersticas si queremos que nuestros cultivos salgan adelante. En los laboratorios de microbiologa podemos encontrar medios de cultivo lquidos y slidos. En los medios lquidos las sustancias nutritivas se encuentran disueltas mientras que los slidos llevan habitualmente una base de agar que es lquido a altas temperaturas y solidifica al enfriarse. Este medio mantiene la humedad y conserva los nutrientes necesarios, permitiendo que los organismos formen colonias sobre l. Es por esto que los cultivos slidos tienen una serie de ventajas que se resumen en la posibilidad de cuantificar el nmero de unidades formadoras de colonias (previa dilucin) y en la capacidad para identificar preliminarmente un microorganismo basndonos en las caractersticas de la colonia formada (tanto color como morfologa). Hay muchos medios diferentes desarrollados para abarcar el mximo nmero posible de agentes patgenos. Segn

su capacidad para soportar el crecimiento microbiano se clasifican en medios generales (para el crecimiento de la mayora), de enriquecimiento (para bacterias y hongos sobretodo), selectivos (fomentan el crecimiento de determinados agentes mientras que evitan la aparicin de otros) y diferenciales (distinguen entre distintos agentes casi siempre en funcin de las colonias). Algunos de los medios de cultivo ms utilizados en el laboratorio son: a) El agar sangre y el agar chocolate Son los medios ms frecuentemente empleados y entran dentro de la categora de medios generales. Estn formados por nutrientes, agar y sangre de caballo o carnero que constituye un suplemento. La nica diferencia entre ambos es que en el agar chocolate la sangre est hemolizada (los nutrientes quedan a disposicin de los microorganismos. b) Agar de Sabouraud. Es un medio de cultivo para hongos ms cido y que contiene ms hidratos de carbono que los usados para las bacterias. Se siembra utilizando la tcnica de aislamiento (levaduras) y se cultiva (28-34C) para observar las caractersticas de las colonias (forma, color, bordes, brillo, textura). Los hongos filamentosos (o miceliales) crecen ms lentamente 7-15 das c) Otros medios El agar McConkey es un medio selectivo para gram negativos. Tambin existen los medios de manitol salado, caldo selenito, agar Campylosel (para Campylobacter) o el medio CIN (para Yersinia). El medio de Schaedler es un medio slido que se utiliza para el cultivo de microorganismos anaerobios mientras que los medios de Mueller-Hinton con y sin sangre son los estandarizados en la realizacin de pruebas de antibiograma. EVIDENCIA INDIRECTA DEL CULTIVO Siendo el ms evidente el efecto citoptico de algunos virus. Este efecto consiste en los cambios bioqumicos y moleculares, morfolgicos y de viabilidad celular, causados durante el ciclo de replicacin viral y visibles mediante la microscopa ptica. La mayor parte de las visiones del efecto citoptico se han dado en clulas infectadas en cultivo, en las que se puede llegar a observar una prdida de adherencia al sustrato, una inhibicin por contacto, agregacin celular, redondeamiento celular, formacin de sincitios, transformacin celular, etc. Aunque todos los virus lticos producen este tipo de efectos, pueden observarse una gran cantidad de manifestaciones distintas. TCNICAS INMUNOLGICAS Se pueden realizar llevando a cabo una deteccin de antgenos especficos del patgeno o por la deteccin de secuencias especficas en los cidos nucleicos del microorganismo. En cualquier caso requiere la utilizacin de tcnicas especficas como la realizacin de sondas de ADN/ARN o la amplificacin gnica. Adems de estas tcnicas diagnsticas, se pueden realizar una serie de pruebas de sensibilidad a los antibiticos

que sern francamente tiles a la hora de pautar un tratamiento contra la afectacin. Respecto a estas pruebas, debemos de tener en cuenta que las bacterias pueden adquirir genes de resistencia o experimentar mutaciones en su ADN que les confieran inmunidad frente a uno o ms antibiticos. Para determinar si una cepa microbiana es sensible a los antibiticos se utilizan estas pruebas: a) Tcnica de difusin en agar (mtodo de Kirby-Bauer). Es una prueba estndar internacional. Se utiliza un inculo bacteriano que incluye un nmero conocido de bacterias para sembrar un medio de cultivo (placa de Petri). Posteriormente, se depositan unos discos de papel impregnados con una concentracin determinada de antibitico. Despus, la placa es incubada durante unas 24 horas para permitir el crecimiento bacteriano confluente. Alrededor del disco donde se difundi el antibitico, la bacteria no crecer (zona de no crecimiento), denominndose esta zona "halo de inhibicin". A continuacin se mide el dimetro y se compara las medidas estndar dadas para ese antibitico. El tamao del halo de inhibicin permite determinar si el aislado clnico es sensible o resistente a un antibitico. b) Determinacin del punto de corte (breakpoint ) Se determina si la especie bacteriana puede crecer o no en presencia de una concentracin nica de antibitico considerada crtica para la multiplicacin de esa especie bacteriana. Es la utilizada habitualmente en hospitales en los test automatizados. c) Determinacin de la Concentracin Mnima Inhibitoria (CIM) Es la mnima concentracin de antibitico que impide el crecimiento bacteriano visible a las 24 horas de cultivo. Por ltimo, una pequea resea sobre el diagnstico de las infecciones causadas por hongos o virus. a) Diagnstico de las infecciones causadas por hongos: Adems del cultivo en Agar de Sabouraud (ya comentado anteriormente) se puede realizar una observacin al microscopio, que se da sobre todo cuando se realiza la inspeccin de hongos filamentosos, vindose hifas (en las que miraremos el grosor, tabiques, ngulo de las ramificaciones) y cuerpos fructferos (lugar de formacin de esporas del hongo). Tambin se pueden realizar test bioqumicos, utilizando sobretodo hidratos de carbono o compuestos nitrogenados para identificar levaduras, test inmunolgicos, que detectarn antgenos especficos de algunas especies de hongos, e identificaciones genticas mediante reacciones en cadena de la polimerasa. b) Diagnstico de las infecciones virales Se realiza mediante la deteccin de antgenos en sangre y cultivos celulares, aunque tambin por la serologa con deteccin de anticuerpos (teniendo en cuenta que una persona infectada va a sintetizar anticuerpos frente al virus que le ataca).

En los posibles cultivos, observaremos los ya conocidos efectos citopticos y no debemos olvidar las identificaciones genticas mediante reacciones en cadena de la polimerasa y las identificaciones por microscopa electrnica, aunque sean raramente usadas en la clnica. 2.4.2 Tcnicas microbiolgicas Las tcnicas microbiolgicas se utilizan para detectar si hay microorganismos sobre una muestra y para identificarlos y cuantificarlos. Por tanto, el primer paso en el estudio microbiolgico ser aislar las diferentes especies de microorganismos que haya en la muestra. 2.4.2.1 La siembra La tcnica para el aislamiento comienza preparando un inculo de siembra, que es la deposicin de una pequea porcin de la muestra en el medio o en los medios de cultivo adecuado, en funcin de las especies microbianas que se espera encontrar. Por eso existen distintos mtodos o tipos de siembra, en funcin de la muestra de partida, del medio en el que se siembra y de la finalidad del estudio. Describiremos la siembra para inoculacin y la siembra para aislamiento. - Siembra para inoculacin: La inoculacin consiste en tomar una pequea porcin de la muestra y diluirla para dispersarla y que crezca con ms facilidad en el medio de cultivo. Se puede inocular en medio lquido o en medio slido. - Siembra para aislamiento: La finalidad de este tipo de siembras es la de obtener cultivos puros. Se siembra en placa de Petri que contienen medios de cultivo slidos. Existen varios tipos de siembras para aislamiento: Siembra en estra o zig-zag, siembra por estra mltiple, siembra de los cuatro cuadrantes, siembra de los tres giros. 2.4.2.2 La observacin Para estudiar la forma y la movilidad de los microorganismos, es necesario observarlos mientras estn vivos. Adems, los cultivos que han de estudiarse han de ser recientes - jvenes- ya que los microbios de los cultivos antiguos -viejos- pierden movilidad. Las tcnicas utilizadas para la observacin son el examen en fresco, la coloracin y la tincin. - Examen en fresco: Pueden seguirse dos mtodos: * Mtodo de la gota pendiente. * Mtodo de la cmara hmeda.

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