Cromatografia de Gases

UNIVERSIDAD DE CHILE FACULTAD DE CIENCIAS QUMICAS Y FARMACUTICAS DEPARTAMENTO DE CIENCIA DE LOS ALIMENTOS Y TECNOLOGA QUMICA LABORATORIO DE QUMICA DE ALIMENTOS
Y MATERIAS GRASAS
VALIDACION DE LA METODOLOGA ANALTICA PARA LA DETERMINACIN DE ACIDOS GRASOS EN ACEITES DE OLIVA EXTRA VIRGEN
MEMORIA PARA OPTAR AL TTULO DE QUIMICO FARMACUTICO
VIVIANA ROSARIO JOFRE REBOLLEDO
Director: Q. Dr. Paz Robert Co- Director: QF. Nalda Romero
SANTIAGO, CHILE ENERO DE 2009
LA
PRESENTE
INVESTIGACIN
SE
LLEV
CABO
CON
EL
FINANCIAMIENTO DEL PROYECTO INNOVA-CORFO FORTALECIMIENTO DE LA INDUSTRIA OLIVINICOLA NACIONAL (07CN13IAM-10).
ii
DEDICATORIA
A herMario, mi padre Mario, mi Estrella del cielo y mi familia, los amo con todo mi corazn
iii
AGRADECIMIENTOS
Me gustara agradecer:
A mi herMario por su apoyo, comprensin, amor y dedicacin. A mi padre Mario y mi madre Julia por incentivarme a estudiar y llegar ms lejos siempre;
A todos los integrantes de mi familia, quienes me brindaron mucho amor, amistad y apoyo durante todo el largo proceso de la universidad;
A la profesora Paz Robert, patrocinante y directora de la memoria, por invitarme a trabajar junto a ella y estar dispuesta a ayudarme en cada momento que lo necesit;
A los profesores del laboratorio, Sra. Lilia Masson, Sra. Nalda Romero y Sr. Jaime Ortiz, por acompaarme durante este proceso con sus consejos;
A Juan Carlos Moreno y Javier Ubilla por brindarme su colaboracin en cada jornada de trabajo en el laboratorio de qumica de los alimentos;
A Arturo Fernndez, por su gran ayuda, compaa y amistad durante este ao en el laboratorio;
A cada uno de los que de alguna forma se han hecho participes de mi vida universitaria.
iv
INDICE
DEDICATORIA ........................................................................................................... ii AGRADECIMIENTOS ............................................................................................... iv INDICE ....................................................................................................................... v INDICE DE TABLAS ................................................................................................. ix INDICE DE FIGURAS .............................................................................................. xv RESUMEN ..............................................................................................................xvii SUMMARY ............................................................................................................. xviii I. INTRODUCCION .................................................................................................... 1 1.1. Antecedentes generales ...................................................................................... 1 1.2. Distribucin de Olivos en Chile............................................................................ 2 1.2.2. Norte Chico ........................................................................................... 3 1.2.3. Zona Central ......................................................................................... 3 1.3. Variedades de Olivos en Chile ............................................................................ 4 1.4. Variedades de Aceite de Oliva ............................................................................ 6 1.4.1. Aceites de oliva vrgenes: ..................................................................... 7 1.4.2. Aceite de oliva refinado: ....................................................................... 8 1.4.3. Aceite de oliva contiene exclusivamente aceites de oliva refinados y aceites de oliva vrgenes: ............................................................................... 8 1.4.4. Aceite de orujo de oliva crudo: ............................................................. 8 1.4.5. Aceite de orujo de oliva refinado: ......................................................... 9 1.4.6. Aceite de orujo de oliva: ....................................................................... 9 1.5. Cualidades del aceite de oliva ............................................................................. 9 1.6. Legislacin vigente para el aceite de oliva ........................................................ 11
1.7. Validacin de mtodos analticos ...................................................................... 13 II. OBJETIVOS ......................................................................................................... 15 2.1. Objetivo general ................................................................................................ 15 2.2. Objetivos especificos ......................................................................................... 15 III. MATERIALES Y METODOS ............................................................................... 16 3.1. Materiales .......................................................................................................... 16 3.1.1 Reactivos: .................................................................................................... 16 3.1.2 Equipo ......................................................................................................... 16 3.1.3 Material de Laboratorio................................................................................ 17 3.2. Metodologia ....................................................................................................... 17 3.2.1 Implementacin de la tcnica analtica para la determinacion de la composicin en cidos grasos de aceite de oliva extra virgen. ............................ 17 3.2.1.1. Preparacin de la muestra............................................................... 17 3.2.1.2. Anlisis Cromatogrfico ................................................................... 18 3.2.2. Aplicacin de los parmetros de desempeo a las metodologas analticas de determinacin de cidos grasos. ..................................................................... 19 3.2.2.1 Intervalo de linealidad y sensibilidad del mtodo. ............................ 19 3.2.2.2 Lmite de deteccin y cuantificacin del mtodo .............................. 20 3.2.2.3 Medidas de precisin ........................................................................ 23 3.2.2.4.Medidas de exactitud: Recuperacin................................................ 24 IV. RESULTADOS Y DISCUSIONES....................................................................... 26 4.1. Determinacin de la linealidad y sensibilidad .................................................... 26 4.2 Limite de deteccin y de cuantificacin .............................................................. 28 4.3 Medidas de Precisin ......................................................................................... 32 4.3.1 Repetibilidad ................................................................................................ 32 4.3.2 Replicabilidad .............................................................................................. 34
vi
4.4 Medidas de exactitud ......................................................................................... 35 4.4.1. Recuperacin ............................................................................................. 35 4.4 Muestras analizadas .......................................................................................... 36 V. CONCLUSIONES ................................................................................................ 40 VI. BIBLIOGRAFIA ................................................................................................... 41 VII. ANEXOS ............................................................................................................ 45 ANEXO 1 .............................................................................................................. 45 Determinacin de la linealidad y sensibilidad ................................................... 45 1.1. Preparacin de la solucin madre de los principales cidos grasos presentes en el aceite de oliva extra virgen. .................................................................................. 45 1.2. Construccin de las curvas de calibracin ........................................................ 46 ANEXO 2 .............................................................................................................. 48 Determinacin del lmite de deteccin y de cuantificacin. .............................. 48 2.1. Preparacin de la solucin madre ..................................................................... 48 2.2. Construccin de las curvas de calibracin ........................................................ 49 2.3. Clculo de y/x de la regresin para la determinacin de los lmites de deteccin y cuantificacin. ........................................................................................................ 51 2.4. Clculo del lmite de deteccin y de cuantificacin ........................................... 53 ANEXO 3 .............................................................................................................. 55 Repetibilidad ..................................................................................................... 55 ANEXO 4 .............................................................................................................. 57 Replicabilidad ................................................................................................... 57 ANEXO 5 .............................................................................................................. 59 Recuperacin ................................................................................................... 59 ANEXO 6 .............................................................................................................. 61 Muestras ........................................................................................................... 61
vii
6.1. Composicin en porcentaje de los cidos grasos de las muestras de aceite de oliva analizadas ........................................................................................................ 61 6.2. Anlisis estadstico ANOVA .............................................................................. 64 6.2.1. Anlisis ANOVA para el cido palmtico (C16:0) ................................ 64 6.2. 2. Anlisis ANOVA para el cido palmitoleico (C16:1 ) ........................ 65 6.2.3. Anlisis ANOVA para el cido heptadecanoico (C17:0) ..................... 66 6.2. 4. Anlisis ANOVA para el cido heptadecenoico (C17:1) .................... 67 6.2.5. Anlisis ANOVA para el cido esterico (C18:0)................................ 68 6.2.6. Anlisis ANOVA para el cido oleico (C18:1) ..................................... 69 6.2.7. Anlisis ANOVA para el cido linoleico (C18:2) ................................. 70 6.2.8. Anlisis ANOVA para el cido linolnico (C18:3) ............................... 71 6.2.9. Anlisis ANOVA para el cido araqudico (20:0) ................................ 72 6.2.10. Anlisis ANOVA para el cido eicosenoico (C20:1) ......................... 73 6.2.11. Anlisis ANOVA para el cido behnico (C22:0).............................. 74
viii
INDICE DE TABLAS
Pgs.
TABLA 1.
Nmero de plantaciones por variedad de olivo.
TABLA 2.
Composicin de cidos grasos, expresada en % de steres metlicos segn el CODEX STAN 33-1981, COI y Reglamento Sanitario de los Alimentos Chile.
TABLA 3.
Concentracin (mg/mL) y porcentaje de los cidos palmtico, esterico, oleico y linoleico, expresados como porcentaje de steres metlicos.
16
TABLA 4.
Intervalos de concentracin de los principales cidos grasos cido palmtico (C16:0), cido esterico
16
(C18:0), cido oleico (C18:1), cido linoleico (C18:2). TABLA 5. Concentraciones de los cidos grasos minoritarios
TABLA 6.
Intervalos de concentracin de steres metlicos de los cidos grasos minoritarios: palmitoleico (C16:1),
18
linoleico (C18:3), araqudico (C20:0), eicosenoico (C20:1), behnico (C22:0).
TABLA 7.
Intervalos de concentracin (mg/mL), sensibilidad (pendiente), intercepto, coeficiente de correlacin y error estndar de la sensibilidad y del intercepto, para
21
ix
la determinacin de la linealidad de los cidos palmtico (C16:0), esterico (C18:0), oleico (C18:1) y linoleico (C18:2).
TABLA 8.
Intervalos de concentracin, sensibilidad (pendiente), intercepto, coeficiente de correlacin, error estndar de la sensibilidad y del intercepto y desviacin estndar de la regresin para la determinacin de la linealidad de los cidos palmitoleico (C16:1), linolnico (C18:3), araqudico (C20:0), eicosenoico (C20:1) y behnico (C22:0).
24
TABLA 9.
Lmites de deteccin y cuantificacin del mtodo (mg/mL)
26
TABLA 10.
Resultados de repetibilidad. Se presenta el promedio (X) de los porcentajes de steres metlicos, la desviacin estndar (DE) y el coeficiente de variacin (CV) de cada cido graso
27
TABLA 11.
Resultados de replicabilidad. Se presenta el promedio (X) de los porcentajes de steres metlicos, la desviacin estndar (DE) y el coeficiente de variacin (CV) de cada cido graso
28
TABLA 12.
Porcentajes de recuperacin (R) y desviacin estandar (DE) obtenido para los cidos C16:0, C18:0, C18:1 y C18:2.
29
TABLA 13.
Perfil en cidos grasos de aceites de oliva extra virgen, variedades arbequina, picual y frantoio, expresado como % de steres metlicos
30
TABLA 14.
Preparacin de solucin madre, peso de cada estndar (mg), concentracin y composicin en porcentaje de los steres metlicos de los cidos palmtico, esterico, oleico y linoleico.
38
TABLA 15.
Concentracin y rea obtenida para la curva de calibracin del cido palmtico C16:0
39
TABLA 16.
Concentracin y rea obtenida para la curva de calibracin del cido esterico C18:0
39
TABLA 17.
Concentracin y rea obtenida para la curva de calibracin del cido oleico C18:1
40
TABLA 18.
Concentracin y rea obtenida para la curva de calibracin del cido linoleico C18:2
40
TABLA 19.
Cantidades pesadas [mg] y concentracin [mg/mL] de cada cido graso
41
xi
TABLA 20.
Concentracin y rea obtenida para la curva de calibracin del cido palmitoleico C16:1
42
TABLA 21.
Concentracin y rea obtenida para la curva de calibracin del cido linolnico C18:3
42
TABLA 22.
Concentracin y rea obtenida para la curva de calibracin del cido araqudico C20:0
42
TABLA 23.
Concentracin y rea obtenida para la curva de calibracin del cido eicosenoico C20:1
43
TABLA 24.
Concentracin y rea obtenida para la curva de calibracin del cido behnico C22:0
43
TABLA 25.
Valores de yi e yi obtenidos mediante la curva de calibracin del cido palmitoleico.
44
TABLA 26.
Valores de yi e yi obtenidos mediante la curva de calibracin del cido linolnico.
44
TABLA 27.
Valores de yi e yi obtenidos mediante la curva de calibracin del cido araqudico.
45
xii
TABLA 28.
Valores de yi e yi obtenidos mediante la curva de calibracin del cido eicosenoico
45
TABLA 29.
Valores de yi e yi obtenidos mediante la curva de calibracin del cido behnico.
45
TABLA 30.
Valores de y/x obtenido para cada cido graso.
46
TABLA 31.
reas de cada ster metlico de los cidos grasos en las 10 repeticiones de la muestra de aceite de oliva variedad arbequina
49
TABLA 32.
Composicin en cidos grasos expresada como porcentaje de steres metlicos en las 10 muestras analizadas, promedio, desviacin estndar y
49
coeficiente de variacin.
TABLA 33.
reas de cada ster metlico de los cidos grasos en las 10 repeticiones de la muestra de aceite de oliva variedad arbequina
51
TABLA 34.
Composicin en cidos grasos expresada como porcentaje de steres en las 10 muestras analizadas, promedio, variacin. desviacin estndar y coeficiente de
51
xiii
TABLA 35.
Datos obtenidos para el clculo de la recuperacin del cido palmtico C16:0
52
TABLA 36.
Datos obtenidos para el clculo de la recuperacin del cido esterico C18:0
53
TABLA 37.
Datos obtenidos para el clculo de la recuperacin del cido oleico C18:1
53
TABLA 38.
Datos obtenidos para el clculo de la recuperacin del cido linoleico C18:2
54
TABLA 39.
Composicin de cidos grasos expresado en porcentaje de steres metlicos, promedio y desviacin estndar de 10 muestras analizadas de aceite de oliva variedad picual
55
TABLA 40.
Composicin de cidos grasos expresado en porcentaje de steres metlicos, promedio y desviacin estndar de 10 muestras analizadas de aceite de oliva variedad arbequina
55
TABLA 41.
Composicin de cidos grasos expresado en porcentaje de steres metlicos, promedio y desviacin estndar de 10 muestras analizadas de aceite de oliva variedad frantoio
56
xiv
INDICE DE FIGURAS
Pgs.
FIGURA 1.
Participacin de las distintas regiones en el rea plantada con olivos
FIGURA 2.
Variedades de olivos ms plantadas expresadas en porcentaje.
FIGURA 3.
Curva de calibracin para el cido palmtico (C16:0)
22
FIGURA 4.
Curva de calibracin para el cido esterico (C18:0)
22
FIGURA 5.
Curva de calibracin para el cido oleico (C18:1)
23
FIGURA 6.
Curva de calibracin para el cido linoleico (C18:2)
23
FIGURA 7.
Curva de calibracin para el cido palmitoleico (C16:1)
24
FIGURA 8.
Curva de calibracin para el cido linolnico (C18:3)
25
xv
FIGURA 9.
Curva de calibracin para el cido araqudico (C20:0)
25
FIGURA 10.
Curva de calibracin para el cido eicosenoico (C20:1)
25
FIGURA 11.
Curva de calibracin para el cido behnico (C22:0)
25
FIGURA 12.
Cromatograma aceite de oliva extra virgen, variedad arbequina, (1) c. Palmtico, (2) c. Palmitoleico, (3) c. Heptadecanoico y
33
heptadecenoico, (4) c. Esterico, (5) c. Oleico, (6) c. Linoleico, (7) c. Araqudico, (8) c. Linolnico, Behnico. (9) c. Eicosenoico, (10) c.
xvi
RESUMEN El presente trabajo tuvo por objetivo validar e implementar una metodologa analtica por cromatografa de gases para la composicin en cidos grasos de un aceite de oliva extra virgen, variedad arbequina. Se determin la linealidad del mtodo de deteccin para los principales cidos grasos presentes en el aceite de oliva extra virgen, utilizando steres metlicos de los cidos palmtico (C16:0), esterico (C18:0), oleico (C18:1) y linoleico (C18:2) en contenidos similares a los del aceite. Las curvas de calibracin obtenidas presentaron un coeficiente de correlacin superior a 0,99. Se determin el lmite de deteccin y de cuantificacin para los cidos grasos minoritarios presentes en el aceite de oliva extra virgen, utilizando steres metlicos de los cidos palmitoleico (C16:1), linolnico (C18:3), araqudico (C20:0), eicosenoico (C20:1) y behnico (C22:0) en contenidos similares a los del aceite. Las concentraciones del lmite de cuantificacin (0,017-0,154 mg/ml) fueron superiores al lmite de deteccin (0,005-0,046 mg/ml), cercanas al ltimo punto de la curva de calibracin. La precisin se determin por medio de la repetibilidad y la replicabilidad. La repetibilidad se evalu con 10 muestras de aceite de oliva extra virgen en un mismo da, por un mismo analista y en el mismo instrumento. La replicabilidad se evalu en 10 das diferentes. Los coeficientes de variacin obtenidos en repetibilidad y replicabilidad para los cidos grasos se ajustaron a la norma de la AOCS, excepto el cido esterico, que super el CV mximo permitido de 4%. La exactitud se evalu a travs de la determinacin de la recuperacin en una muestra de aceite sin y con (fortificacin) la adicin de los steres metlicos de los cidos palmtico, esterico, oleico y linoleico. Se obtuvieron valores de recuperacin entre 77 y 109%. Se analizaron 26 muestras de aceites de oliva de las variedades arbequina, picual y frantoio, encontrando diferencias significativas en el porcentaje de steres metlicos de algunos cidos grasos. La variedad arbequina present valores significativamente mayores (p<0.05) en C16:0, C16:1, C17:0, C17:1 con respecto a las variedades picual y frantoio. La variedad picual presento valores significativamente mayores (p<0,05) en C18:0 y C18:1 y significativamente menores (p<0,05) de C18:2 y C18:3, con respecto a las variedades de arbequina y frantoio. Para los cidos 20:0, 20:1 y 22:0 no se encontraron diferencias significativas.
xvii
SUMMARY VALIDATION OF ANALYTICAL METHOD FOR THE DETERMINATION OF FATTY ACIDS IN EXTRA VIRGIN OLIVE OIL.
The objective of the present work was to validate and to implement the fatty acid composition of a virgin extra olive oil, arbequina variety by gas chromatography. The linearity of the detection method for the main fatty acids in the virgin extra olive oil was determined using methyl esters of the palmitic (C16:0), stearic (C18:0), oleic (C18:1) and linoleic (C18:2) acids with similar contents to those of the oil. The correlation coefficient of the calibration curves obtained was above to 0.99. The quantification and detection limit was determined for fatty acids minority in the virgin extra olive oil, using methyl esters of the palmitoleic (C16:1), linolenic (C18:3), araquidic (C20:0), eicosenoic (C20:1) and behenic (C22: 0) acids, in similar contents to those of the oil. The concentration of the quantification limit (0,017-0,154 mg/ml) was higher than the detection limit (0,005-0,046 mg/ml), near to the last point of the calibration curves. Repeatability and replicability were used as the precision parameter. The repeatability was evaluated with 10 virgin extra olive oil samples in a same day, by a same analyst and instrument. The replicability was evaluated in 10 days different. The variation coefficients obtained in repeatability and replicability for fatty acids were in according with the AOCS, except for the stearic acid, with CV above 4%. The exactitude was evaluated through the determination of the recovery in an oil sample without and with (fortification) the addition of methyl esters of palmitic, stearic, oleic and linoleic acids. The recovery values were between 77 and 109%. Twenty six olive oil samples of the arbequina, picual and frantoio varieties were analyzed, significant differences in the percentage of methyl esters of fatty acids were found. The arbequina variety showed values of C16:0, C16:1, C17:0, C17:1 significantly higher (p<0.05) than picual and frantoio varieties. The picual variety showed values significantly higher (p<0.05) for C18:0 and C18:1 and lower (p<0.05) for C18:2 and C18:3, respect to arbequina and frantoio varieties. There were not significant differences for C20:0, C20:1 and C22:0 acids.
xviii
I. INTRODUCCION
1.1. Antecedentes generales
Desde su introduccin en la Pennsula Ibrica, probablemente por parte de los romanos y rabes alrededor del siglo VI a.C., el olivo ha sido considerado como smbolo de paz, felicidad y de la cultura mediterrnea, adems de producir aceite de oliva. Del vocablo griego elaia deriva la palabra latina olea y olivum (olivo); de la palabra hebrea zait viene la palabra rabe az-zait y zaitum que posteriormente han dado lugar al nombre espaol de aceite y aceituna.
Grecia era una potencia en el cultivo de los olivos. Estos llevaron el olivo y aceite de oliva por el Mediterrneo. Sin embargo, los romanos fueron los que se encargaron de mejorar las tcnicas de cultivo y de la elaboracin de aceite de oliva, el cual en la antigua Roma se utilizaba con fines teraputicos, comestibles y combustible. Durante la Edad Media la produccin de aceite disminuy considerablemente ya que el mundo estaba dominado por las guerras, por lo cual el aceite de oliva se consideraba un producto lujoso. Junto a la llegada de Cristbal Coln a Amrica, a fines del siglo XV, llegaron olivos los cuales fueron distribuidos principalmente en Per, Mxico, Argentina y Chile.
A pesar de que hoy en da los olivos se pueden encontrar en todos los pases del mundo, la zona Mediterrnea sigue siendo el centro de mayor produccin, siendo Espaa el pas con ms olivos y con mayor produccin de aceite de oliva. No obstante, existen pases en donde la produccin es ms bien pequea pero creciente, Chile es un ejemplo.
El desarrollo de la produccin del Aceite de Oliva ha venido evolucionando de acuerdo al desempeo de la industria en los ltimos aos, dado el gran aumento de la demanda tanto nacional como internacional, lo que incentiva a realizar importantes inversiones en el nivel productivo, impulsndose as, a alcanzar mayores volmenes de produccin.
Se estima que el 65% de las superficies plantadas estn destinadas a la produccin de aceite de oliva y el resto a la elaboracin de aceitunas de mesa.
Las exportaciones de aceite de oliva virgen chileno durante el ao 2007 aumentaron un 58% y 70% en cantidad y valor respectivamente comparado con el ao 2006. Los principales pases a los cuales Chile exporta son Estados Unidos (42%), Espaa (14%), Canad, Venezuela y Mxico con cifras cercanas al 5% cada uno (Iglesias, 2008).
1.2. Distribucin de Olivos en Chile
1.2.1. Norte Grande
I Regin: En esta zona la principal rea productiva es el valle de Azapa, ya que las condiciones agroclimticas son excelentes, sin embargo el agua es escasa.
1.2.2. Norte Chico
III Regin: En la provincia de Huasco las plantaciones se encuentran distribuidas en Freirina y Vallenar, pero la mayor superficie se encuentra en el valle de Huasco. En esta zona el 80% de las plantaciones estn destinadas a la produccin de aceitunas en salmuera, el restante 20% est dirigido a la produccin de aceite de oliva, encontrando variedades aceiteras tales como Empeltre y Liguria.
IV Regin: El 80% de la superficie plantada se encuentra en la comuna de Ovalle, la cual se dedica principalmente a la produccin de aceite. Las variedades aceiteras que se pueden encontrar en esta zona son: Frantoio, Arbequina, Leccino, Empeltre y Ascolano.
1.2.3. Zona Central
Regin Metropolitana: En la provincia de Melipilla se produce aceite principalmente con variedades aceiteras tales como Frantoio, Leccino y Arbequina.
VII Regin: En la comuna de Sagrada Familia se localiza la mayora de los olivos de la regin, ya que est la empresa olivcola, productora de aceite de oliva, ms
importante de la regin. Las variedades aceiteras que se encuentran en esta regin son Leccino, Frantoio, Empeltre y Liguria.
La distribucin de la superficie nacional de acuerdo al nmero de plantaciones de olivos en las distintas regiones del pas se observa en la figura 1.
FIGURA 1. Participacin de las distintas regiones en el rea plantada con olivos.
1.3. Variedades de Olivos en Chile
La mayor parte de las variedades de olivos presentes en el mundo provienen de la zona mediterrnea de Europa, principalmente Espaa e Italia. Actualmente los cultivos chilenos ms importantes son Arbequina, Frantoio, Leccino, Picual y Coratina. En la tabla 1 se indica el nmero de plantaciones correspondiente a cada variedad de olivos, los porcentajes correspondientes a las variedades de los olivos se presentan en la figura 2. El cultivo de estos se desarrolla principalmente entre las regiones de Tarapac y de La Araucana.
TABLA 1. Nmero de plantaciones por variedad de olivo. Variedad N Plantaciones Arbequina Frantoio Leccino Picual Coratina Otros 36 30 23 18 10 60
Fuente. Catastro asociacin de olivicultores. Variedades desde 1940 hasta 2006, segn datos encuesta.
Variedades ms Plantadas
34%
20% 17%
Arbequina Frantoio Leccino Picual Coratina
6%
10%
13%
Otros
Fuente. Catastro asociacin de olivicultores. Variedades desde 1940 hasta 2006, segn datos encuesta.
FIGURA 2. Variedades de olivos ms plantadas expresadas en porcentaje. Frantoio: Variedad italiana, muy comn en la zona de La Toscana, y que se ha propagado a numerosos pases productores de aceite. Su fruto de tamao mediano, produce un aceite de mucha calidad organolptica, muy frutal, de tonos verdosos y muy estable, ya que es rico en polifenoles.
Leccino: Se cultiva en toda la pennsula italiana, ya que se utiliza como agente polinizador. Es una variedad de fruto grande y de maduracin muy pareja. Su aceite es bastante amargo y tiene un sabor muy verde.
Coratina: Otra variedad italiana, que se cultiva principalmente en la regin de La Puglia (Bari). Gracias a su altsimo contenido de polifenoles generalmente se utiliza para enriquecer mezclas y no como monovarietal. Su fruto es grande y produce un aceite de color muy amarillento.
Arbequina: Esta variedad es originaria de Espaa y entrega un fruto ovalado y pequeo. Su aceite ha tenido muy buena aceptacin en los mercados poco habituados al consumo de aceite de oliva.
Picual: Proveniente de Espaa, es la variedad ms importante del mundo, representa el 20% del total mundial y el 50% de las plantaciones ibricas. Su fruto es mediano muy estable, de color verde y con un sabor picante bien acentuado.
Otros tipos de olivos plantados corresponden a Nocellara del Belice, Empeltre, Liguria, Barnea, Hojiblanca, Arbosana, Manzanilla, Bosana, Biancolilla, Picholine, Suri, Cerasuola, Racimo (Racimo negra, racimo verde, racimo grando), Santa Emiliana, Sevillana, Pendolino, Grappoic y Taggiasca
1.4. Variedades de Aceite de Oliva
El COI/T.15/NC n 3/Rev. 1. 2003 denomina los diferentes tipos de aceites de oliva segn el modo de obtencin y la acidez de ste. A continuacin se presentan los criterios de clasificacin: 1.4.1. Aceites de oliva vrgenes:
Aceite obtenido del fruto del olivo nicamente por procedimientos mecnicos u otros procedimientos fsicos en condiciones, sobre todo trmicas, que no implique la alteracin del aceite y no hayan sufrido tratamiento alguno distinto del lavado, decantacin, el centrifugado y la filtracin, se excluyen de los aceites obtenidos mediante disolventes o por procedimientos de reesterificacin, y toda mezcla con aceites de otra naturaleza.
Dichos aceites son objeto de la clasificacin y de las denominaciones siguientes:
Aceite de Oliva Virgen Extra: aceite de oliva virgen con una acidez libre, expresada en cantidad de cido oleico, como mximo de 0,8g por 100g, siendo la mediana de sus defectos 0, y la del atributo frutado superior a 0.
Aceite de Oliva Virgen: aceite de oliva virgen con una acidez libre mxima de 2g por 100g, siendo la mediana de sus defectos inferior o igual a 2,5, y la del atributo frutado superior a 0
Aceite de oliva Lampante: aceite de oliva virgen con una acidez libre, superior a 2g por 100g siendo la mediana de sus defectos superior a 2,5, y la del atributo frutado superior a 0.
1.4.2. Aceite de oliva refinado:
Aceite de oliva obtenido mediante el refinado de aceites de oliva vrgenes, cuya acidez no podr ser superior a 0,3 g por 100g, y cuyas otras caractersticas son conformes a las establecidas por esta categora. 1.4.3. Aceite de oliva contiene exclusivamente aceites de oliva refinados y aceites de oliva vrgenes:
Aceite de oliva constituido por una mezcla de aceite de oliva refinado y de aceites de oliva vrgenes distintos del aceite lampante, cuya acidez libre no podr ser superior a 1g por 100g, y cuyas otras caractersticas son conformes a las establecidas por esta categora.
1.4.4. Aceite de orujo de oliva crudo:
Aceite obtenido a partir del orujo de oliva mediante tratamiento con disolvente o por medios fsicos, o que corresponda, con excepcin de algunas caractersticas determinadas, a un aceite de oliva lampante.
1.4.5. Aceite de orujo de oliva refinado:
Aceite obtenido mediante refino de aceite de oliva de orujo crudo, cuya acidez libre, expresada en cido oleico, no podr ser superior a 0,3g por 100g y cuyas otras caractersticas son conformes a esta categora.
1.4.6. Aceite de orujo de oliva:
Aceite constituido por una mezcla de aceite de orujo de oliva refinado y de aceites de oliva vrgenes distintos del lampante, cuya acidez libre, expresada en cido oleico, no podr ser superior a 1g por 100g y cuyas otras caractersticas son conformes a las establecidas para esta categora.
De lo anterior se deduce que la Industria Olivcola Chilena posee un enorme potencial de desarrollo, el cual requiere apoyo tecnolgico de ltima generacin para mejorar la calidad de sus productos y defenderse de medidas paraarancelarias que contribuyan en la penetracin de los mercados internacionales.
1.5. Cualidades del aceite de oliva
El aceite de oliva es un alimento que posee grandes cualidades nutricionales benficas para la salud, que se basan en el contenido y composicin de sus cidos grasos. Estos forman parte de los fosfolpidos de la membrana, siendo precursores de sustancias de gran importancia y de diversas funciones fisiolgicas, como las prostaglandinas, prostaciclinas, tombroxanos y leucotrienos, sustancias a las que
se atribuyen funciones como las agregacin y antiagregacin plaquetaria, la vasoconstriccin o vasodilatacin, respuestas de mayor o menor carcter inflamatorio o antiinflamatorio.
Un aceite de oliva de excelente calidad (extra virgen) est compuesto principalmente, por un cido monoinsaturado, que es el cido oleico (65-85%), de la familia omega 9 y un cido poliinsaturado, que es el linoleico (4-14%), el cual pertenece al grupo de los omega 6, ambos con una marcada accin benfica sobre el sistema cardiovascular, adems de que no contiene cidos grasos trans. Se sabe que una dieta rica en aceite de oliva, disminuye las concentraciones de colesterol plasmtico, tanto del total como del LDL, el cual es aterognico, adems mantiene y eleva la concentracin de colesterol HDL, el cual es antiaterognico. Otro efecto de una dieta rica en cidos grasos monoinsaturados es que se favorece la formacin de compuestos con accin antiagregante y vasodilatadora, es decir, tiene un efecto antitrombognico. As mismo, a nivel vascular el acido oleico disminuye la presin sistlica y la diastlica. Tambin muestra una influencia positiva en funciones digestivas: gstricas, biliares, pancreticas e intestinales (Serra, 2006).
Los cidos grasos trans son cidos grasos que contienen al menos un doble enlace trans, a pesar de ser insaturados se comportan como cidos grasos saturados, aumentando el riesgo de enfermedades cardiovasculares, adems la incorporacin de los cidos grasos trans a los fosfolipidos de la membrana celular provoca cambios en la permeabilidad y la hace ms fcilmente oxidable, proceso que acelera el envejecimiento celular (Hernndez, 1999). Son producidos durante los procesos de hidrogenacin o de refinacin de aceites y grasas. Sin embargo,
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estn presentes naturalmente en productos como la mantequilla y la carne de rumiantes. La presencia de isomeros trans de los cidos oleico, linoleico y linolnico en el aceite de oliva por sobre los niveles permitidos, podra indicar que existe alguna adulteracin con aceites vegetales hidrogenado aceites de oliva refinados, donde se han aplicado altas temperaturas.
1.6. Legislacin vigente para el aceite de oliva
En la tabla 2, se presenta la composicin en cidos grasos por cromatografa de gases (% esteres metlicos), de acuerdo con el CODEX STAN 331981 (Rev. 2-2003), COI/T.15/NC n 3/Rev. 1 2003 y Reglamento Sanitario de los Alimentos Decreto Supremo 977-96 Chile.
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TABLA 2. Composicin de cidos grasos, expresada en % de steres metlicos segn el CODEX STAN 33-1981, COI y Reglamento Sanitario de los Alimentos Chile. Acido Graso CODEX COI DS 977 96 C14:0 (Mirstico) C16:0 (Palmtico) C16:1 (Palmitoleico) C17:0 (Heptadecanoico) C17:1 (Heptadecenoico) C18:0 (Esterico) C18:1 (Oleico) C18:2 (Linoleico) C18:3 (Linolnico) C20:0 (Araqudico) C20:1 (Eicosenoico) C22:0 (Behnico) C24:0 (Lignocrico) C18:1t C18:2t + C18:3t NE= no especificado Para dar cumplimiento a estas especificaciones es que se hace importante caracterizar los atributos de calidad de los aceites de esta industria como producto de consumo nacional y de exportacin. Para la caracterizacin es necesario llevar a cabo procesos de anlisis de los aceites en cuestin, a travs de mtodos debidamente validados. 0 - 0,05 7,5 - 20,0 0,3 - 3,5 0,0 - 0,3 0,0 - 0,3 0,5 - 5,0 55,0 - 83,0 3,5 - 21,0 NE 0,0 - 0,6 0,0 - 0,4 0,0 - 0,2 0,0 - 0,2 0,0 - 0,05 0,0 - 0,05 0,05 7,5 - 20,0 0,3 - 3,5 0,03 0,03 0,5 - 5,0 55,0 - 83,0 3,5 - 21,0 1,0 0,6 0,4 0,2 0,2 0,05 0,05 < 0,1 7 - 17 0,3 - 4 NE NE 1-3 65 - 85 4 - 14 0,5 - 1,5 < 0,5 < 0,2 < 0,2 < 0,1 NE NE
12
1.7. Validacin de mtodos analticos
La validacin segn la FDA es el establecimiento de la evidencia documental de que un procedimiento analtico conducir, con un alto grado de seguridad, a la obtencin de resultados precisos y exactos, dentro de las especificaciones y los atributos de calidad previamente establecidos. Otra definicin de una validacin es el procedimiento para demostrar que el mtodo analtico es aceptable para el fin que se pretende (Harris, 2006).
La validacin de los mtodos analticos es una actividad fundamental en los sistemas de calidad de los laboratorios. El proceso de validacin, guarda una estrecha relacin con la representatividad de los resultados, dependiendo del objetivo de los anlisis y del tipo de muestra (San Martn, 2000).
Existen dos tipos de validacin: prospectiva y retrospectiva.
Una validacin prospectiva es la que se realiza cuando la verificacin del cumplimiento de las condiciones establecidas para un proceso o mtodo analtico, se llevan a cabo antes de la comercializacin del producto. Este tipo de validacin se aplica cuando se elabora un nuevo mtodo analtico. Es tpico en los laboratorios de investigacin y desarrollo, y se realiza de acuerdo con un protocolo perfectamente planificado. Comprende el estudio de todos los criterios necesarios para demostrar el buen funcionamiento del mtodo.
Una validacin retrospectiva es la que se realiza para verificar la idoneidad del proceso analtico. La garanta de la calidad de un producto queda constatada a
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travs de los datos analticos del producto ya comercializado. Se aplica a mtodos no validados previamente y de los que se tiene una amplia historia de resultados.
En una validacin de mtodos analticos se miden los siguientes parmetros: exactitud, precisin, selectividad, limite de deteccin y cuantificacin.
La exactitud evala la cercana existente entre el valor hallado en el analsis respecto al valor verdadero o valor de referencia.
La precisin permite conocer la variabilidad del mtodo determinando replicabilidad y repetibilidad, en las que se evala la variabilidad del mtodo efectuando el analisis en las mismas condiciones (analista, instrumentos, reactivos, dia) y la variabilidad del mtodo sobre la misma muestra pero en diferentes condiciones respectivamente.
Limite de deteccin determina la mnima cantidad del analito en la muestra que puede ser detectada, pero no necesariamente cuantificada.
Lmite de cuantificacin determina la mnima cantidad del analito que puede ser determinada con precisin y exactitud.
Selectividad determina si el mtodo analtico en desarrollo entrega una seal medible correspondiente slo a la presencia de los analitos de la muestra sin interferencias de impurezas, productos de degradacin u otras sustancias presentes en ella.
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II. OBJETIVOS
2.1. Objetivo general
Validar e implementar una metodologa por CG para cidos Grasos en Aceite de Oliva extra virgen, variedad Arbequina.
2.2. Objetivos especificos
Implementar la metodologa analitica por CG para la determinacin de la composicin en cidos grasos en aceite de oliva extra virgen.
Validar
la
metodologa
analtica
mediante
la
aplicacin
de
parmetros de desempeo: Determinar el Intervalo de linealidad mtodo mediante una curva de calibracin. Determinar el lmite de deteccin y cuantificacin del mtodo. Determinar la precisin del mtodo a partir de la replicabilidad y la repetibilidad. Determinar la exactitud del mtodo en trminos de y sensibilidad del
recuperacin.
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III. MATERIALES Y METODOS
3.1. Materiales Aceite de Oliva extra virgen variedad Arbequina, cosecha 2007, obtenido de
Chile-Oliva, que se utiliz para la validacin. 26 muestras de aceite de oliva extra-virgen, 10 muestras de variedad
arbequina, 10 muestras de variedad picual y 6 muestras de variedad frantoio, obtenidas de Chile-Oliva.
3.1.1 Reactivos:
Stndares de steres metlicos: cido palmtico (C16:0), cido
palmitolico (C16:1), cido esterico (C18:0), cido oleico (C18:1), cido linoleico (C18:2), cido linolnico (C18:3), cido araqudico (C 20:0), cido eicosenoico (C20:1), cido behnico (C22:0) (Sigma). Hexano para anlisis Metanol para anlisis KOH para anlisis
3.1.2 Equipo Cromatografo: Hewlett Packard (HP) 5890 serie II con detector FID, integrador HP 3395, con columna SP-2560 (100 m x 0,25 m film x 0,20 d.i.; SUPELCO, USA)
16
3.1.3 Material de Laboratorio
Jeringa 1 L para GC (SGE) Pipetas pasteur Micropipetas 200 y 1000 L Tubos tapa rosca 5 mL Matraces aforados 5, 10 y 25 mL
3.2. Metodologia
3.2.1 Implementacin de la tcnica analtica para la determinacion de la composicin en cidos grasos de aceite de oliva extra virgen.
Se implement la metodologa para la determinacin de la composicin en cidos grasos por cromatografa de gases considerando las recomendaciones del Diario Oficial de las Comunidades Europeas REGLAMENTO (CE) N 796/2002 DE LA COMISIN de 6 de mayo de 2002 por el que se modifica el Reglamento (CEE) N 2568/91.
3.2.1.1. Preparacin de la muestra
Los
steres
metlicos
de
los
cidos
grasos
se
prepararon
por
transesterificacin en frio con una solucin metanlica de hidrxido potsico, de acuerdo al mtodo, descrito en el Diario Oficial de las Comunidades Europeas.
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Procedimiento
En un tubo con tapa rosca de 5 ml se pes aproximadamente 0,1g (7 gotas) de la muestra de aceite. Se agreg 3 ml de hexano y se agit. Luego, se aadi 0,5 ml de la solucin metanlica 2 N de hidrxido potsico, se tap, se cerr bien y se agit enrgicamente durante 30 segundos. Se dej reposar hasta que la parte superior de la solucin qued clara, aproximadamente 45 minutos. Luego, se extrajo la fase de hexano que contena los steres metlicos y se inyect en el cromatgrafo de gases. Es aconsejable mantener la solucin en el frigorfico (<5C) hasta el momento de realizar el anlisis cromatogrfico. No se recomienda guardar la solucin durante ms de 12 horas.
3.2.1.2. Anlisis Cromatogrfico
Los steres metlicos se analizaron por cromatografa de gases de acuerdo al siguiente programa: Temperatura del inyector Temperatura del detector : 230C. : 250C.
Programacin de la temperatura del horno: temperatura inicial de 180C durante 15 minutos y luego se aument a razn de 0,5C/min hasta 193C. Gas portador: hidrgeno a una presin de 30 psi
Se inyect un volumen de 1,0 L de las soluciones Standard y de la muestra. La identificacin de los steres metlicos, se realiz con soluciones patrones.
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3.2.2. Aplicacin de los parmetros de desempeo a las metodologas analticas de determinacin de cidos grasos.
3.2.2.1 Intervalo de linealidad y sensibilidad del mtodo.
El intervalo de linealidad y sensibilidad del mtodo se realiz para los principales cidos grasos presentes en el aceite de oliva extra-virgen,
correspondientes a los cidos palmtico (C16:0), esterico (C18:0), oleico (C18:1) y linoleico (C18:2), en porcentajes similares a los del aceite de oliva.
Para realizar la curva de calibracin se prepar una solucin estndar con los steres metlicos de los cidos grasos C16:0, C18:0, C18:1 y C18:2 en hexano. La tabla 3 muestra la concentracin y porcentaje de los cidos grasos, expresados como steres metlicos.
TABLA 3. Concentracin (mg/mL) y porcentaje de los cidos palmtico, esterico, oleico y linoleico, expresados como porcentaje de steres metlicos. Acido Graso mg/mL % C16:0 (Ac. Palmtico) C18:0 (Ac. Esterico) C18:1 (Ac. Oleico) C18:2 (Ac. Linoleico) 8,28 2,04 49,97 6,44 12,4 3,1 74,9 9,6
Cada curva de calibracin se construy realizando 6 diluciones de la solucin estndar y se aforaron a 5 mL, de tal manera que el rea de los steres metlicos del aceite de oliva (muestra) pudiera ser interpolada en ella. En la tabla 4 se presenta el intervalo de concentracin de cada ster metlico de cido graso.
19
Cada dilucin se inyect en el CG, registrndose las reas obtenidas, y graficndolas frente a la concentracin (mg/mL). De stos grficos se calcul la, pendiente, intercepto y coeficiente de correlacin (r).
TABLA 4. Intervalos de concentracin de los principales steres metlicos de los cidos palmtico (C16:0), esterico (C18:0), oleico (C18:1) y linoleico (C18:2). Concentracin Concentracin Acido Graso mnima (mg/mL) mxima (mg/mL) C16:0 C18:0 C18:1 C18:2 0,83 0,20 5,00 0,64 7,45 1,84 44,97 5,80
El valor de la sensibilidad se obtuvo de la pendiente de la curva de calibracin de cada ster de cido graso, de acuerdo a la ecuacin.
Y = S* x + b Donde: Y= rea S= Sensibilidad (rea*mL/mg) X= Concentracin (mg/mL) b= Intercepto 3.2.2.2 Lmite de deteccin y cuantificacin del mtodo
(1)
El lmite de deteccin corresponde a la concentracin mnima que puede ser detectada por el instrumento usado en el anlisis, y que arroja una seal cualitativa. El lmite de cuantificacin corresponde a la concentracin mnima en que el instrumento puede producir una seal cuantificable.
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El lmite de deteccin y cuantificacin del mtodo para la determinacin de la composicin en steres metlicos, en aceite de oliva extra virgen variedad Arbequina, se calcul para las seales ms pequeas, correspondientes a los cidos palmitoleico (C16:1), linolnico (C18:3), araqudico (C20:0), eicosenoico (C20:1) y behnico (C22:0). Se realiz el clculo de los lmites de deteccin y cuantificacin, a travs de una curva de calibracin de estos cidos grasos, en concentraciones cercanas a la real en Aceite de Oliva.
Para determinar el lmite de deteccin y de cuantificacin, se prepar una solucin estndar con los steres metlicos de los cidos grasos C16:1, C18:3, C20:0, C20:1, C22:0, en hexano. En la tabla 5 se presenta la concentracin de los steres metlicos de los cidos grasos en mg/mL.
TABLA 5. Concentraciones de los steres metlicos de los cidos grasos minoritarios. Concentracin cido graso [mg/mL] C16:1 (Ac. Palmitoleico) 2,0 C18:3 (Ac. Linolnico) C20:0 (Ac. Araqudico) C20:1 (Ac. Eicosenoico) C22:0 (Ac. Behnico) 4,9 0,1 1,0 2,1
La curva de calibracin se prepar tomando 6 alcuotas de la solucin estndar, y se aforaron a 5 mL. En la tabla 6, se presentan los intervalos de concentracin utilizados en la curva de calibracin. Cada dilucin se inyect en el CG, registrndose las reas obtenidas, y graficndolas frente a la concentracin (mg/mL). De stos grficos se calcul la pendiente, intercepto, coeficiente de correlacin (r) y desviacin estndar.
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TABLA 6. Intervalos de concentracin de steres metlicos de los cidos grasos minoritarios: palmitoleico (C16:1), linoleico (C18:3), araqudico (C20:0), eicosenoico (C20:1), behnico (C22:0). cidos Concentracin Concentracin Grasos mnima (mg/mL) mxima (mg/mL) C16:1 0,080 1,00 C18:3 C20:0 C20:1 C22:0 0,020 0, 016 0, 020 0, 009 0,69 0, 56 0, 40 0, 30
Se utiliz la desviacin estndar de la regresin de las curvas de calibracin de cada cido graso, la cual se calcul de acuerdo a la ecuacin 2.
y/x=
Donde:
(yi - yi)2 (n-2)
(2)
= Desviacin estndar de la regresin yi = Valor observado del punto en la ordenada yi= Valor terico del punto obtenido por la prediccin del modelo de regresin n = Nmero de puntos de la curva de calibracin.
Los lmites de deteccin y cuantificacin se calcularon a travs de las ecuaciones 3 y 4.
Lmite de deteccin (LD) es:
CLD= 3 S
(3)
22
Lmite de cuantificacin (LC) es:
CLC= 10 S
(4)
Donde: CLD= Concentracin del limite de deteccin (mg/mL) CLC= Concentracin del limite de cuantificacin (mg/mL) = Desviacin estndar de la regresin (rea). b = intercepto de la curva de calibracin (rea) S= pendiente de la curva de calibracin (rea* mL/mg)
3.2.2.3 Medidas de precisin
Precisin: es el parmetro que expresa la cercana de coincidencia o grado de dispersin, entre una serie de mediciones obtenidas de mltiples muestreos de una misma muestra homogenea bajo condiciones establecidas. Se evala a travs de los parmetros de replicabilidad y repetibilidad.
Repetibilidad: Se determin la repetibilidad de steres metlicos de una misma muestra de aceite de oliva extra virgen, variedad arbequina. Se metilaron 10 muestras de aceite de oliva extra virgen, variedad arbequina, de acuerdo al mtodo de metilacin detallado en 2.1.1 y se inyectaron en el cromatgrafo de gases, de acuerdo al mtodo detallado en 2.1.3, en el mismo da. Se calcularon, los valores promedio, desviacin estndar y porcentaje de coeficiente de variacin. Replicabilidad: Se determin la replicabilidad de steres metlicos de una misma muestra de aceite de oliva extra virgen variedad arbequina. Se metilaron 10
23
muestras de aceite de oliva extra virgen, variedad arbequina, de acuerdo al mtodo de metilacin detallado en 2.1.1 y se inyectaron en el cromatgrafo de gases, de acuerdo al mtodo detallado en 2.1.3, en distintos das. Se calcularon los valores promedio, desviacin estndar y porcentaje de coeficiente de variacin.
3.2.2.4.Medidas de exactitud: Recuperacin.
Se metilaron dos muestras de aceite de oliva en paralelo, una real y una fortificada con estndares dentro del intervalo de linealidad del mtodo. Se obtuvieron los datos de las reas de steres metlicos de los cidos grasos: cido palmtico (C16:0), cido esterico (C18:0), cido oleico (C18:1), y cido linoleico (C18:2) y se calcularon los porcentajes (%) de recuperacin.
Para el clculo de los porcentajes de recuperacin, se procedi de la siguiente forma:
1 Se inyect en el CG una muestra real y se obtuvo un rea para cada ster metlico del cido graso a medir.
2 Se agreg una cantidad conocida de cada ster metlico de cido graso a la muestra (concentracin fortificacin agregada), se inyect en el CG y se obtuvo el rea correspondiente a cada cido graso con la respectiva fortificacin.
3 Las reas fueron restadas y con este resultado (rea de la fortificacin) se calcul la concentracin obtenida de cada cido graso, utilizando las curvas de calibracin de ellos (concentracin fortificacin obtenida).
24
El porcentaje de recuperacin se calcul de acuerdo con la ecuacin 5
% Recuperacin = Donde: Cfo= Concentracin fortificacin obtenida Cfa= Concentracin fortificacin agregada
Cfo * 100 Cfa
(5)
25
IV. RESULTADOS Y DISCUSIONES
4.1. Determinacin de la linealidad y sensibilidad
En la tabla 7 se muestra el intervalo de concentracin (mg/mL) de los estndares de los steres metlicos de los cidos grasos, sensibilidad (pendiente), intercepto, coeficiente de correlacin y error estndar de la sensibilidad y del intercepto, para la determinacin de los cidos palmtico, esterico, oleico y linoleico, los cuales corresponden a los principales cidos grasos presentes en el aceite de oliva. El intervalo de concentracin estudiado correspondi al que generalmente presentan los aceites de oliva extra virgen (variedad arbequina) TABLA 7. Intervalos de concentracin (mg/mL), sensibilidad (pendiente), intercepto, coeficiente de correlacin y error estndar de la sensibilidad y del intercepto, para la determinacin de la linealidad de los cidos palmtico (C16:0), esterico (C18:0), oleico (C18:1) y linoleico (C18:2).
Acido graso C16:0 C18:0 C18:1 C18:2 Intervalo de concentracin (mg/mL) 7,45 - 0,83 1,84 - 0,20 44,97 - 5,00 5,80 - 0,64 S 607561 811465 587630 480022 ES* 7888 49715 12506 4925 N 63450 155547 -100040 -27759 ES** 37892 58864 362599 18282 r 0,9996 0,9923 0,9991 0,9998
S= sensibilidad (pendiente de la curva), n= intercepto, ES= error estndar, ES* de la pendiente, ES** del intercepto
En las figuras 3, 4, 5 y 6, se muestran los grficos de rea versus concentracin (mg/mL) para los estndares de los steres metlicos de los cidos palmtico, esterico, oleico y linoleico, respectivamente.
26
En la tabla 7 y las figuras 3-6, se observa una alta correlacin, dada por el coeficiente de correlacin r para las curvas de calibracin de cada uno de los cidos grasos e intervalo de concentracin estudiados.
Curva Calibracin C16:0

5000000 4500000 4000000 3500000 3000000 2500000 2000000 1500000 1000000 500000 0 0,00
rea
1,00
2,00
3,00
4,00
5,00
6,00
7,00
8,00
C oncentracin [mg/mL]
FIGURA 3. Curva de calibracin para el cido palmtico (C16:0)

2000000 1800000 1600000 1400000 1200000 1000000 800000 600000 400000 200000 0 0,00
reas
0,20
0,40
0,60
0,80
1,00
1,20
1,40
1,60
1,80
2,00
FIGURA 4. Curva de calibracin para el cido esterico (C18:0)
27

30000000 25000000 reas 20000000 15000000 10000000 5000000 0 0,00 5,00 10,00 15,00 20,00 25,00 30,00 35,00 40,00 45,00 50,00
FIGURA 5. Curva de calibracin para el cido oleico (C18:1)

3000000 2500000 reas 2000000 1500000 1000000 500000 0 0,00 1,00 2,00 3,00 4,00 5,00 6,00 7,00
FIGURA 6. Curva de calibracin para el cido linoleico (C18:2)
4.2 Limite de deteccin y de cuantificacin
En la tabla 8 se muestra el intervalo de concentracin (mg/mL) de los estndares de los steres metlicos de los cidos grasos, sensibilidad (pendiente), intercepto, coeficiente de correlacin, error estndar de la sensibilidad y del intercepto y desviacin estndar de la regresin, para la determinacin de los
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cidos palmitoleico, linolnico, araqudico, eicosenoico y behnico, los cuales corresponden a los cidos grasos presentes en menor concentracin en aceites de oliva. El intervalo de concentracin estudiado correspondi al que generalmente presentan los aceites de oliva extra-virgen (variedad arbequina).
TABLA 8. Intervalos de concentracin, sensibilidad (pendiente), intercepto, coeficiente de correlacin, error estndar de la sensibilidad y del intercepto y desviacin estndar de la regresin para la determinacin de la linealidad de los cidos palmitoleico (C16:1), linolnico (C18:3), araqudico (C20:0), eicosenoico (C20:1) y behnico (C22:0).
Acido graso C16:1 C18:3 C20:0 C20:1 C22:0 Intervalo de concentracin (mg/mL) 1,00 - 0,20 0,692 - 0,099 0,563 - 0,040 0,200 - 0,020 0,300 - 0,128 S 324939 34484 377935 576894 381434 ES* 5466 673 15667 18522 14319 n 1682 14914 1622 -3581 -1236 ES** 3314 227 5171 4367 2809 r 0,9999 0,9998 0,9974 0,9987 0,9986 4989 188 1061 983 2174
S= sensibilidad (pendiente del grfico rea vs concentracin), n= intercepto (del grfico rea vs concentracin), ES= desviacin estndar, ES* de la pendiente, ES** del intercepto, = desviacin estndar de la regresin.
En las figuras 7, 8, 9, 10 y 11 se muestran los grficos de rea versus concentracin (mg/mL) para los cidos palmitoleico, linolnico, araqudico, eicosenoico y behnico, respectivamente.
En la tabla 8 y las figuras 7-11, se observa una alta correlacin, dada por el coeficiente de correlacin (r) para las curvas de calibracin de cada uno de los cidos grasos e intervalos de concentracin estudiados.
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350000 300000 250000 200000 150000 100000 50000 0 0,150 0,250 0,350
C aC urv alibracin C 16:1
0,450
0,550
0,650
0,750
0,850
0,950
1,050
Concentracin (m m g/ L)
FIGURA 7. Curva de calibracin para el cido palmitoleico (C16:1)

35000 30000 Area 25000 20000 15000 0,000
0,100
0,200 0,300 0,400 Concentracin (mg/mL)
0,500
0,600
FIGURA 8. Curva de calibracin para el cido linolnico (C18:3)

250000 200000 Area 150000 100000 50000 0 0,000 0,100 0,200 0,300 0,400 Concentracin (mg/mL) 0,500 0,600
FIGURA 9. Curva de calibracin para el cido araqudico (C20:0)

150000 130000 110000 Area 90000 70000 50000 30000 10000 -10000 0,000 0,050 0,100 0,150 Concentracin (mg/mL) 0,200 0,250
FIGURA 10. Curva de calibracin para el cido eicosenoico (C20:1)
30

120000 100000 Area 80000 60000 40000 20000 0 0,000 0,050 0,100 0,150 0,200 Concentracin (mg/mL) 0,250 0,300 0,350
FIGURA 11. Curva de calibracin para el cido behnico (C22:0)
En la tabla 9 se presenta el limite de deteccin y de cuantificacin (mg/ mL) determinado para los cidos palmitoleico, linolnico, araqudico, eicosenoico y behnico, calculado en relacin a la desviacin estndar de la regresin con la que se obtuvo la curva de calibracin de cada cido graso. TABLA 9.Lmites de deteccin y cuantificacin del mtodo (mg/mL) Acido graso LD LC C16:1 C18:3 C20:0 C20:1 C22:0 0,046 0,016 0,009 0,005 0,017 0,154 0,055 0,029 0,017 0,057
LD= lmite de deteccin; LC= Lmite de cuantificacin
Los valores de limite de deteccin y cuantificacin se encuentran debajo del ltimo punto de la curva de calibracin de todos los cidos grasos. Los cidos palmitoleico, linolnico, araqudico, eicosenoico y behnico tienen un limite de deteccin de 0,046, 0,016, 0,009, 0,005, 0,017 mg/mL respectivamente, lo cual quiere decir que si la concentracin de estos cidos grasos en un aceite de oliva est por debajo de estos valores, no sern detectados, es decir, no arrojarn una
31
seal detectable. Si bin un valor mayor al lmite de deteccin arroja una seal, sta es slo una medida cualitativa, ya que los valores de lmite de cuantificacin son mayores. Los valores de lmite de cuantificacin para los cidos palmitoleico, linolnico, araqudico, eicosenoico y behnico son 0,154, 0,055, 0,029, 0,017, 0,057 mg/mL, de tal forma que cuando la concentracin de estos cidos grasos en el aceite de oliva se encuentra sobre estos valores se podr asegurar que se est cuantificando certeramente.
4.3 Medidas de Precisin
4.3.1 Replicabilidad
En la tabla 10 se presenta el promedio del porcentaje de steres metlicos, la desviacin estndar y el coeficiente de variacin para los cidos grasos mirstico, palmtico, palmitoleico, heptadecanoico, heptadecenoico, esterico, oleico,
linoleico, linolnico, araqudico, eicosenoico, behnico y lignocrico. Estos valores fueron calculados para la determinacin de la replicabilidad del mtodo.
32
TABLA 10. Resultados de replicabilidad. Se presenta el promedio (X) de los porcentajes de steres metlicos, la desviacin estndar (DE) y el coeficiente de variacin (CV) de cada cido graso Ac.Graso X DE CV C14:0 (c. Mirstico) C16:0 (c. Palmtico) C16:1 (c. Palmitoleico) C17:0 (c. Heptadecanoico) C17:1 (c. Heptadecenoico) C18:0 (c. Esterico) C18:1 (c. Oleico) C18:2 (c. Linoleico) C18:3 (c. Linolnico) C20:0 (c. Araqudico) C20:1 (c. Eicosenoico) C22:0 (c. Behnico) C24:0 (c. Lignocrico) tz: trazas La AOAC (Association of Official Analytical Chemists) indica que para los analitos que se encuentran entre un 0,1 - 1,0%, 1,0 - 10,0% y sobre 10%, el CV mximo permitido es de un 8%, 4% y 2%, respectivamente. En este contexto la mayora de los cidos grasos que componen el aceite de oliva, C17:0, C17:1, C18:3, C20:0, C20:1 y C22:0, se encuentran en el rango entre 0,1-1% y presentaron CV menores a un 3%. Los cidos C16:1 y C18:0, en un rango entre 110% presentaron CV de 1 y 4,2%, respectivamente. Para el caso de los que se encuentran sobre un 10%, como los cidos C16:0 y C18:1, el CV fue de 1 y 0,17%, respectivamente. Por lo tanto el cido esterico es el nico que no cumple con estos criterios. tz 12,45 1,08 0,10 0,22 2,11 73,15 8,97 0,31 0,40 0,47 0,14 tz -0,14 0,01 0,00 0,00 0,09 0,12 0,16 0,00 0,00 0,01 0,00 --1,11 1,04 1,94 1,85 4,16 0,17 1,74 0,88 0,83 2,86 3,07 --
33
4.3.2 Repetibilidad
En la tabla 11 se presenta el promedio del porcentaje de steres metlicos, la desviacin estndar, coeficiente de variacin de los porcentajes de los cidos grasos mirstico, oleico, palmtico, linoleico, palmitoleico, linolnico, heptadecanoico, heptadecenoico, behnico,
esterico,
araqudico,
eicosenoico,
lignocrico. Estos valores fueron calculados para la determinacin de la repetibilidad del mtodo.
TABLA 11. Resultados de repetibilidad. Se presenta el promedio (X) de los porcentajes de steres metlicos, la desviacin estndar (DE) y el coeficiente de variacin (CV) de cada cido graso Ac. Graso C14:0 (c. mirstico) C16:0 (c. palmtico) C16:1 (c. palmitoleico) C17:0 (c. heptadecanoico) C17:1 (c. heptadecenoico) C18:0 (c. esterico) C18:1 (c. oleico) C18:2 (c. linoleico) C18:3 (c. linolnico) C20:0 (c. araqudico) C20:1 (c. eicosenoico) C22:0 (c. behnico) C24:0 (c. lignocrico) tz: trazas Los cidos C17:0, C17:1, C18:3, C20:0, C20:1 y C22:0, en un rango de 0,11%, presentaron valores de CV menores a un 7%, respondiendo satisfactoriamente al criterio del valor mximo del coeficiente de variacin permitido (<8%) por la X (%) tz 12,56 1,09 0,10 0,21 2,33 72,73 8,77 0,31 0,40 0,45 0,13 tz DE -0,21 0,02 0,00 0,00 0,33 0,48 0,29 0,02 0,01 0,03 0,01 -CV -1,70 1,58 1,96 2,33 14,10 0,66 3,26 6,14 1,77 6,30 5,98 --
34
AOAC para este rango de concentracin del analito. Para los cidos grasos en el intervalo de concentracin de 1-10%, el cido C16:1, cumple con tener un CV< 4%, en cambio, el cido C18:0 present un valor muy superior (14%) al aceptado. Los cidos C16:0 y C18:1, con porcentajes sobre 10%, presentaron valores de CV menores al 2%. Por lo tanto el cido esterico es el nico que no cumple con estos criterios.
Los valores obtenidos de CV para la repetibilidad fueron superiores a los de replicabilidad, lo que se puede explicar por el cambio de da, ya que las otras condiciones (analista e instrumento) no fueron variadas durante el estudio. De esta forma se puede concluir que el cambio de da de anlisis de una muestra de aceite de oliva afecta los parmetros que se est midiendo, sin perjuicio de que los resultados que se obtengan sean certeros.
4.4 Medidas de exactitud
4.4.1. Recuperacin
En la tabla 12 se presentan los porcentajes de recuperacin, desviacin estndar y coeficiente de variacin de los cidos palmtico, oleico, linoleico y linolnico, los cuales se presentan en mayor porcentaje en el aceite de oliva.
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TABLA 12. Porcentajes de recuperacin (R) y desviacin estandar (DE) obtenido para los cidos C16:0, C18:0, C18:1 y C18:2. Acido Graso %R DE C16:0 109 9,6 C18:0 C18:1 C18:2 77 101 91 9,3 14,9 18,2
Los resultados de recuperacin obtenidos (Tabla 12), alcanzaron valores entre un 77 y 109%. El cido esterico present el menor valor de recuperacin. Los cidos palmtico, oleico y linoleico presentan un alto valor de recuperacin, lo que se traduce en que el mtodo es exacto para estos cidos grasos, pero es poco exacto para el cido esterico que presenta una recuperacin ms baja.
4.4 Muestras analizadas
Se analiz el perfil en cidos grasos de un conjunto de muestras (n= 26) de aceites de oliva extra virgen, de las variedades arbequina, frantoio y picual. La distribucin de los cidos grasos y su desviacin estndar se muestra en la tabla 13. La composicin en cidos grasos de cada muestra se detalla en anexo 6.1.
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TABLA 13. Perfil en cidos grasos de aceites de oliva extra virgen, variedades arbequina, picual y frantoio, expresado como % de steres metlicos Variedad aceite / cido graso C16:0 (c. Palmtico) C16:1 (c. Palmitoleico) C17:0 (c. Heptadecanoico) C17:1 (c. Heptadecenoico) C18:0 (c. Esterico) C18:1 (c. Oleico) C18:2 (c. Linoleico) C18:3 (c. Linolnico) C20:0 (c. Araqudico) C20:1 (c. Eicosenoico) C22:0 (c. Behnico) Arbequina (n=10) 12,5 1,10a 1,0 0,21a 0,1 0,03a 0,2 0,06a 2,5 0,27b 74,7 2,50a 6,8 1,18b 0,3 0,05b 0,4 0,04a 0,7 0,17a 0,1 0,05a Picual (n=10) 11,2 0,83b 0,9 0,14b 0,04 0,02b 0,09 0,03b 2,9 0,30a 79,6 0,88b 3,4 0,38a 0,2 0,04b 0,4 0,03a 0,8 0,12a 0,09 0,05a Frantoio (n=6) 11,3 0,56b 0,9 0,09b 0,06 0,01b 0,09 0,03b 2,5 0,35b 76,5 1,04c 6,5 0,67b 0,3 0,04a 0,4 0,03a 0,8 0,10a 0,1 0,06a
Letras distintas significa diferencia estadstica significativa a un nivel de confianza de 95%
En la tabla 13 se observa que la variedad arbequina present un contenido significativamente mayor (p<0,05) de cidos palmtico, palmitoleico, heptadecanoico y heptadecenoico con respecto a las variedades picual y frantoio. La variedad picual present un contenido significativamente mayor (p<0,05) de cido esterico y un contenido significativamente menor (p<0,05) de cido linoleico, con respecto a las variedades arbequina y frantoio. El cido oleico present diferencias significativas en las tres variedades. Los cidos araqudico, eicosenoico y behnico no presentan diferencias estadsticas significativas (Anexo 6.2). Uno de los factores que ms afecta a la distribucin de cidos grasos, es la variedad de la aceituna y su grado de maduracin (Prez- Arquillu et al, 2003).
El CODEX STAN 33-19818(Rev. 2-2003) indica intervalos de concentracin para cada cido graso. La media de concentracin de los cidos grasos de las muestras de las variedades arbequina, picual y frantoio cumplen con estos
37
intervalos, con excepcin del C20:1(0,7%; 0,8%; 0,8%, respectivamente) valores superiores al rango establecido por esta norma para este cido graso (0,0-0,4%). La variedad picual present un contenido de cido linoleico menor (3,4%) al establecido por el reglamento (3,5- 21,0%). Un comportamiento similar para el C20:1 (0,4%) y C18:2 (3,5-21,0%) se observ al comparar los valores de composicin en cidos grasos con la norma COI/T.15/NC n3/Rev.15 de diciembre de 2003.
El DS 977-96 Reglamento Sanitario de los Alimentos, establece que los aceites de oliva vrgenes deben cumplir con intervalos de concentracin de los cidos grasos, expresados en % de steres metlicos. La media de las muestras analizadas de las variedades arbequina, picual y frantoio cumplen estos parmetros, con excepcin del C20:1(0,7%; 0,8%; 0,8%) en cada una de ellas, cuyos valores son superiores a los limites establecidos por esta norma (<0,2%), y del C18:3 (0,3%; 0,2%; 0,3%), cuyos porcentajes son inferiores a los lmites establecidos por esta normativa para este cido graso (0,5 - 1,5%). En esta normativa no se consideran los cidos C17:0 y C17:1, por lo que no se puede establecer si los valores obtenidos estn dentro o fuera del intervalo de aceptacin.
El cido palmtico, principal cido graso saturado en los aceites de oliva, presenta valores medios de 12,5, 11,2 y 11,3% para arbequina, picual y frantoio, respectivamente. Se trata de valores medios que concuerdan a los descritos para las variedades picual (11,9%) y frantoio (10,9%), pero no para arbequina (20,1%) (Moyano et al., 2005; Snchez Casas 2003, Aguilera 2003). Otro de los principales cidos grasos saturados es el cido esterico, cuyo rango vara entre 2,2 - 2,8 %; 2.6 - 3.2% y 2,2 - 2,9% para los aceites de las variedades arbequina, picual y
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frantoio, respectivamente. Estos resultados son similares a los descritos para la variedad picual (2,7%) y superiores a los descritos para arbequina (1,38%) y frantoio (1,5%) (Moyano et al 2005, Snchez Casas 2003, Aguilera 2003).
En cuanto a los cidos insaturados destaca, por su importancia nutricional (antes mencionada), el cido oleico, el cual se encuentra por sobre un 70% en las muestras de las tres variedades, de stas, picual presenta el valor ms elevado (79,7%), le sigue frantoio (76,5%) y finalmente arbequina (74,7%). Estos resultados concuerdan con diversos autores (INIA Uruguay 2007, Aguilera 2003, Snchez Casas 2003, Matas et al 2003) para la variedad picual (79,31%), pero no para las variedades arbequina (66,96%) y frantoio (78,32%). El contenido de cido linoleico de la variedad picual (3,4%) est de acuerdo con el perfil descrito por Snchez Casas (2003) (3,48%) y el de la variedad frantoio (6,5%) con el de Aguilera (2003) (6,79%). La variedad arbequina (6,8%) se aleja de los valores descritos como
aceptables para esta variedad (10,75%) (INIA Uruguay 2007).
El cido linolnico, que presenta el mayor grado de insaturacin del aceite de oliva, muestra un contenido de 0,3% para la variedad arbequina, similar a los valores reportados por Motilva (2001) de 0,34%. Sin embargo para las variedades picual (0,2%) y frantoio (0,3%) se han encontrado valores mayores (0,73%) y menores (0,48%), respectivamente.(INIA Uruguay, 2007).
En la figura 12, se muestra un cromatograma de aceite de oliva, en donde se ve claramente el predominio de los cidos grasos insaturados (C16:1, C17:1, C18:1, C18:2, C18:3, C201) por sobre los saturados, (C16:0, C17:0, C18:0, C20:0,
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C22:0), en especial del cido monoinsaturado C18:1, que es el que caracteriza al aceite de oliva, por su alto contenido.
FIGURA 12. Cromatograma aceite de oliva extra virgen, variedad arbequina, (1) c. Palmtico, (2) c. Palmitoleico, (3) c. Heptadecanoico y heptadecenoico, (4) c. Esterico, (5) c. Oleico, (6) c. Linoleico, (7) c. Araqudico, (8) c. Linolnico, (9) c. Eicosenoico, (10) c. Behnico.
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V. CONCLUSIONES
La metodologa analtica implementada result ser adecuada para cumplir con los objetivos propuestos en este estudio ya que permiti la determinacin de los cidos grasos del aceite de oliva dentro del rango que pueden esperarse en un aceite de oliva comercial, con excepcin del cido esterico que no cumpli con los valores normados de CV en repetibilidad y replicabilidad.
Las tcnicas para la determinacin de los cidos grasos resultaron ser lineales, entre 0,83 - 7,45 mg/mL; 0,20 - 1,84 mg/mL; 5,00 - 44,97 mg/mL y 0,64 5,80 mg/mL para los cidos palmtico, esterico, oleico y linoleico, respectivamente, presentando en todos los casos un coeficiente de correlacin superior a 0,99.
Los cidos mirstico y lignocrico no arrojaron seal detectable por el integrador, en ninguna de las muestras analizadas para la determinacin de la repetibilidad y reproducibilidad, por lo que se concluye que se encuentran en trazas.
Con los resultados obtenidos en la repetibilidad y replicabilidad se afirma que la metodologa cumple con la precisin por repetibilidad y replicabilidad para todos los cidos grasos, excepto para el cido esterico.
Los valores obtenidos para la recuperacin de los cidos palmtico (109%), oleico (101%) y linoleico (91%) son aceptables, y se puede concluir que el mtodo es exacto para la determinacin de estos cidos grasos. El cido esterico
present una recuperacin baja de (77%).
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VI. BIBLIOGRAFIA
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42
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43
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VII. ANEXOS ANEXO 1
Determinacin de la linealidad y sensibilidad La determinacin de la linealidad y la sensibilidad se realiz a travs de una curva de calibracin para cada ster metlico de cido graso que se analiz. (cidos palmtico, esterico, oleico y linoleico)
1.1. Preparacin de la solucin madre de los principales cidos grasos presentes en el aceite de oliva extra virgen.
Se prepar 25 mL de la solucin de los steres metlicos de los cidos palmtico, esterico, oleico y linoleico, los cuales se encontraban en una composicin porcentual similar a la del aceite de oliva. Las cantidades pesadas, la concentracin [mg/mL] y el porcentaje de cada ster de cido graso en la solucin se presentan en la tabla 14.
TABLA 14. Preparacin de solucin madre, peso de cada estndar (mg), concentracin y composicin en porcentaje de los steres metlicos de los cidos palmtico, esterico, oleico y linoleico. cido graso Peso (mg) mg/ mL % solucin C16:0 C18:0 C18:1 C18:2 206,90 51 1249,30 161 8,28 2,04 49,97 6,44 12,40 3,06 74,89 9,65
45
1.2. Construccin de las curvas de calibracin
Se prepararon entre 4 y 7 diluciones de la solucin madre y se inyectaron en el CG. Con los datos de rea obtenidos para cada concentracin de cada ster de cido graso, se construy una curva de calibracin que se us en la determinacin de la linealidad y la sensibilidad. Las tablas 15, 16, 17 y 18 muestran la concentracin del ster metlico del cido graso en la solucin y el rea obtenida para cada una de ellas, presentndose adems la ecuacin de la curva de calibracin obtenida y el coeficiente de correlacin.
TABLA 15. Concentracin y rea obtenida para la curva de calibracin del cido palmtico C16:0 Conc[mg/mL] rea 7,45 6,62 4,97 3,31 1,66 0,83 4566179 4143296 3020626 2106970 1071276 564173
Y= 607561X + 63450 r= 0,9996
46
TABLA 16. Concentracin y rea obtenida para la curva de calibracin del cido esterico C18:0 Conc[mg/mL] rea 1,22 0,82 0,41 0,20 1261959 826872 488378 280290
Y= 811465X + 155547 r= 0,9923
TABLA 17. Concentracin y rea obtenida para la curva de calibracin del cido oleico C18:1 Conc[mg/mL] rea 44,97 39,98 29,98 19,99 9,99 5,00 26393072 23796528 16750704 11816640 5730778 3003653
Y= 587630X - 100040 r= 0,9991 TABLA 18. Concentracin y rea obtenida para la curva de calibracin del cido linoleico C18:2 Conc[mg/mL] rea 5,80 5,15 2,58 1,29 0,64 2743378 2467896 1195356 577057 298660
Y= 480022X - 27759 r= 0,9998
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ANEXO 2
Determinacin del lmite de deteccin y de cuantificacin.
La determinacin de los lmites de deteccin y de cuantificacin se realiz a travs de la construccin de curvas de calibracin para los cidos grasos en menor porcentaje en el aceite de oliva(cidos palmitoleico, linolnico, araqudico, eicosenoico y behnico).
2.1. Preparacin de la solucin madre
Se prepar 5 mL de solucin de los estndares de los steres metlicos de los cidos palmitoleico, linolnico, araqudico, eicosenoico y behnico, con una concentracin parecida al aceite de oliva. Las cantidades pesadas y la concentracin de cada ster metlico de cido graso en la solucin se presentan en la tabla 19. TABLA 19. Cantidades pesadas [mg] y concentracin [mg/mL] de cada cido graso Acido graso Peso (mg) mg/mL C16:1 C18:3 C20:0 C20:1 C22:0 10,0 24,7 20,1 5,0 10,7 2,0 4,94 4,02 1,0 2,14
48
2.2. Construccin de las curvas de calibracin
Se prepararon entre 3 y 5 diluciones de la solucin madre y se inyectaron en el CG. Con los datos de rea obtenidos para cada concentracin de los steres metlicos de los steres metlicos de los cidos grasos, se construy una curva de calibracin que se us en la determinacin de la linealidad y la sensibilidad. Las tablas 20, 21, 22, 23 y 24 muestran la concentracin del ster metlico del cido graso en la solucin y el rea obtenida para cada una de ellas, presentndose adems la ecuacin de la curva de calibracin obtenida y el coeficiente de correlacin. TABLA 20. Concentracin y rea obtenida para la curva de calibracin del cido palmitoleico C16:1 mg/ml rea 1,000 0,800 0,600 0,400 0,200 321665 264676 201271 133115 62506
Y= 324939X + 1682 r= 0,9999 TABLA 21. Concentracin y rea obtenida para la curva de calibracin del cido linolnico C18:3 mg/ml rea 0,494 0,296 0,099 32026 24968 18405
Y= 34484X + 14914 r= 0,9998
49
TABLA 22. Concentracin y rea obtenida para la curva de calibracin del cido araqudico C20:0 mg/ml rea 0,563 0,241 0,080 0,040 208480 90230 31951 15124
Y= 377935X + 5171 r= 0,9974
TABLA 23. Concentracin y rea obtenida para la curva de calibracin del cido eicosenoico C20:1 mg/ml rea 0,200 0,120 0,020 112243 64845 8313
Y= 576894X - 3581 r= 0,9987 TABLA 24. Concentracin y rea obtenida para la curva de calibracin del cido behnico C22:0 mg/ml rea 0,300 0,214 0,128 112043 82841 46136
Y= 381434X 1236 r= 0,9986
50
2.3. Clculo de y/x de la regresin para la determinacin de los lmites de deteccin y cuantificacin.
Para calcular los lmites de deteccin y cuantificacin de los cidos grasos palmitoleico, linolnico, araqudico, eicosenoico y behnico se utiliz la siguiente ecuacin (2):
y/x=
Donde: = Desviacin estndar de la regresin
(yi - yi)2 (n-2)
yi = Valor observado del punto en la ordenada yi= Valor terico del punto obtenido por la prediccin del modelo de regresin n = Nmero de puntos de la curva de calibracin.
En las tablas 25, 26, 27, 28 y 29 se muestran los datos de yi e yi para cada concentracin usada en la curva de calibracin, adems se muestra el valor del y/x, y un ejemplo de su clculo con el cido palmitoleico. TABLA 25. Valores de yi e yi obtenidos mediante la curva de calibracin del cido palmitoleico. Conc.[mg/mL] yi y'i 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 321665 264676 201271 133115 62506 326621 261633 196645 131657 66669
51
n= 5 Ejemplo para el clculo de y/x y/x= ( ( (321665-326621)+ (264676- 261633)+ (201271- 196645)+ (133115131657)+ (62506- 66669))2/ 3) y/x = 4989 TABLA 26. Valores de yi e yi obtenidos mediante la curva de calibracin del cido linolnico. Conc.[mg/mL] yi y'i 0,494 0,296 0,099 32026 24968 18405 31949 25121 18327
n=3
y/x=188 TABLA 27. Valores de yi e yi obtenidos mediante la curva de calibracin del cido araqudico. Conc.[mg/mL] yi y'i 0,563 0,241 0,080 0,040 208480 90230 31951 15124 y/x= 1061 TABLA 28. Valores de yi e yi obtenidos mediante la curva de calibracin del cido eicosenoico Conc.[mg/mL] yi y'i 0,20 0,12 0,02 112243 64845 8313 111634 65941 8826 208600 90124 30886 16169
n=4
n= 3
y/x= 983
52
TABLA 29. Valores de yi e yi obtenidos mediante la curva de calibracin del cido behnico. Conc.[mg/mL] yi y'i 0,300 0,214 0,128 112043 82841 46136 113194 80390 47587
n= 3
y/x= 2174
2.4. Clculo del lmite de deteccin y de cuantificacin
Los lmites de deteccin y de cuantificacin se calcularon con las ecuaciones 3 y 4. En la tabla 30 se presenta un resumen de los valores de y/x de cada cido graso. Luego se presenta el clculo del y/x para cido palmitoleico como ejemplo, y los valores de los y/x de los restantes cidos grasos.
Limite de deteccin (LD)
CLD= (b + 3)- b S
(3)
Lmite de cuantificacin (LC) es:
CLC= (b + 10)- b S
(4)
En donde: CLD= Concentracin del limite de deteccin (mg/mL) CLC= Concentracin del limite de cuantificacin (mg/mL) = Desviacin estndar de la regresin (rea). b = intercepto de la curva de calibracin (rea) S= pendiente de la curva de calibracin (rea* mL/mg)
53
TABLA 30. Valores de y/x obtenido para cada cido graso. cido graso C16:0 C18:3 C20:0 C20:1 C22:0 4989 188 1061 983 2174
a) Clculo de la concentracin de los lmites de deteccin y de cuantificacin del cido palmitoleico Ejemplo clculo concentracin del lmite de deteccin. CLD= 3 S CLD= (4989 *3)/324939 CLD= 0,046 mg/mL
Ejemplo clculo concentracin del lmite de cuantificacin.
CLC= 10 S CLC= (4989*10) /324939 CLC= 0,154 mg/mL
b) Concentracin del lmite de deteccin y cuantificacin del cido linolnico CLD= 0,016 mg/mL CLC= 0,055 mg/mL
54
c) Concentracin del lmite de deteccin y cuantificacin del cido araqudico CLD= 0,009 mg/mL CLC= 0,029 mg/mL
d) Concentracin del lmite de deteccin y cuantificacin del cido eicosenoico CLD= 0,005 mg/mL CLC= 0,017 mg/mL
e) Concentracin del lmite de deteccin y cuantificacin del cido behnico CLD= 0,017 mg/mL CLC= 0,057 mg/mL
ANEXO 3 Replicabilidad
En la tabla 31 se muestran los datos de rea obtenidos en cada anlisis de las 10 muestras de aceite de oliva variedad arbequina, analizadas en el mismo da, por el mismo analista y en el mismo equipo, con los cuales se elabor la tabla 32 que muestra el porcentaje, promedio, desviacin estndar y coeficiente de variacin de cada cido graso, parmetros con los cuales se evalu la replicabilidad para ellos.
55
TABLA 31. reas de cada ster metlico de los cidos grasos en las 10 repeticiones de la muestra de aceite de oliva variedad arbequina
cido graso M1 C16:0 2012573 C16:1 2012573 C17:0 16126 C17:1 34808 C18:0 341843 C18:1 376651 C18:2 1454939 C20:0 65806 C18:3 51288 C20:1 75431 C22:0 23617 M2 M3 M4 M5 M6 M7 M8 M9 M10 2667760 2034201 3057822 2020763 2801558 1906268 3534246 2543189 3393582 2667760 2034201 3057822 2020763 2801558 1906268 3534246 2543189 3393582 21931 16198 24726 16237 22300 15303 27663 20432 25572 46451 35338 53967 36130 48412 33544 61136 41525 58391 446921 341973 520424 335901 472833 308427 572208 461367 595223 493372 377311 574391 372031 521245 341971 633344 502892 465912 1966151 1419001 2192077 1495458 2033634 1409283 2579901 1759385 2395621 87614 65468 101548 66035 91982 60790 112992 80712 107947 68305 50002 77489 51193 71136 47106 87673 61874 82807 103638 73178 113323 79054 107278 75602 137967 93202 127918 30883 21527 34581 23034 31569 20272 38396 27959 35641
TABLA 32. Composicin en cidos grasos expresada como porcentaje de steres metlicos en las 10 muestras analizadas, promedio, desviacin estndar y coeficiente de variacin.
cido graso C16:0 C16:1 C17:0 C17:1 C18:0 C18:1 C18:2 C20:0 C18:3 C20:1 C22:0 M1 12,34 1,08 0,10 0,21 2,10 73,14 8,92 0,40 0,31 0,46 0,14 M2 12,29 1,07 0,10 0,21 2,06 73,31 9,06 0,40 0,31 0,48 0,14 M3 12,60 1,09 0,10 0,22 2,12 72,93 8,79 0,41 0,31 0,45 0,13 M4 12,32 1,06 0,10 0,22 2,10 73,22 8,83 0,41 0,31 0,46 0,14 M5 12,32 1,07 0,10 0,22 2,05 73,26 9,12 0,40 0,31 0,48 0,14 M6 12,37 1,07 0,10 0,21 2,09 73,19 8,98 0,41 0,31 0,47 0,14 M7 12,49 1,10 0,10 0,22 2,02 73,15 9,23 0,40 0,31 0,50 0,13 M8 12,47 1,08 0,10 0,22 2,02 73,25 9,10 0,40 0,31 0,49 0,14 M9 12,66 1,09 0,10 0,21 2,30 72,98 8,76 0,40 0,31 0,46 0,14 M10 12,61 1,08 0,10 0,22 2,21 73,09 8,90 0,40 0,31 0,48 0,13 X 12,45 1,08 0,10 0,22 2,11 73,15 8,97 0,40 0,31 0,47 0,14 DE 0,14 0,01 0,00 0,00 0,09 0,12 0,16 0,00 0,00 0,01 0,00 CV 1,11 1,04 1,94 1,85 4,16 0,17 1,74 0,83 0,88 2,86 3,07
56
ANEXO 4 Repetibilidad En la tabla 33 se muestran los datos de rea obtenidos en cada anlisis de las 10 muestras de aceite de oliva variedad arbequina, analizadas en distintos das, por el mismo analista y en el mismo equipo, con los cuales se elabor la tabla 34 que muestra el porcentaje (ster metlico), promedio, desviacin estndar y coeficiente de variacin de cada cido graso, parmetros con los cuales se evalu la repetibilidad para ellos.
57
TABLA 33. reas de cada ster metlico de los cidos grasos en las 10 repeticiones de la muestra de aceite de oliva variedad arbequina cido Graso
C16:0 C16:1 C17:0 C17:1 C18:0 C18:1 C18:2 C18:3 C20:0 C20:1 C22:0
M1
M2
M3
M4
M5
M6
M7
M8
M9
M10
2012573 2593842 3030786 1498130 1899213 1327606 1374582 1963211 1642686 1443481 2012573 2593842 3030786 1498130 1899213 1327606 1374582 1963211 1642686 1443481 16126 21124 24456 12001 14633 10517 10976 16345 12997 11596 34808 46111 50732 25500 32709 21515 22807 33503 27678 24955 341843 448636 478784 296136 311246 322217 269376 348418 315122 265253 376651 494747 529516 321636 343955 343732 292183 381921 342800 290208 1454939 1914712 2233285 971796 1324896 881477 909267 1362056 1167796 1020766 51288 67076 75835 33634 45699 36898 31607 46988 40738 34378 65806 85457 96612 45518 58429 42542 42294 62404 54126 46468 75431 103832 121369 49762 68529 44744 44156 69520 60693 53104 23617 29440 32177 15165 19759 12482 13489 21053 19283 15184
TABLA 34. Composicin en cidos grasos expresada como porcentaje de steres en las 10 muestras analizadas, promedio, desviacin estndar y coeficiente de variacin. cido Graso
C16:0 C16:1 C17:0 C17:1 C18:0 C18:1 C18:2 C18:3 C20:0 C20:1 C22:0
M1 M2 M3 M4 M5 M6 M7 M8 M9 M10 X DE CV 12,34 12,34 12,48 12,93 12,77 12,80 12,66 12,45 12,36 12,51 12,56 0,21 1,70 1,08 1,07 1,09 1,11 1,13 1,09 1,08 1,08 1,07 1,09 1,09 0,02 1,58 0,10 0,10 0,10 0,10 0,10 0,10 0,10 0,10 0,10 0,10 0,10 0,00 1,96 0,21 0,22 0,21 0,22 0,22 0,21 0,21 0,21 0,21 0,22 0,21 0,00 2,33 2,10 2,13 1,97 2,56 2,09 3,11 2,48 2,21 2,37 2,30 2,33 0,33 14,10 73,14 73,11 73,39 72,00 73,12 72,66 72,02 72,81 72,51 72,54 72,73 0,48 0,66 8,92 9,11 9,20 8,39 8,91 8,50 8,38 8,64 8,79 8,85 8,77 0,29 3,26 0,31 0,32 0,31 0,29 0,31 0,36 0,29 0,30 0,31 0,30 0,31 0,02 6,14 0,40 0,41 0,40 0,39 0,39 0,41 0,39 0,40 0,41 0,40 0,40 0,01 1,77 0,46 0,49 0,50 0,43 0,46 0,43 0,41 0,44 0,46 0,46 0,45 0,03 6,30 0,14 0,14 0,13 0,13 0,13 0,12 0,12 0,13 0,15 0,13 0,13 0,01 5,98
58
ANEXO 5 Recuperacin
Para la evaluacin de la recuperacin se inyect una muestra de aceite de oliva sin fortificar y una fortificada con una solucin estndar de los steres metlicos de los cidos palmtico, esterico, oleico y linoleico, de concentracin conocida, cada una de ellas se realiz en triplicado. En las tablas 35, 36, 37 y 38 se muestran los datos del rea del aceite de oliva natural y la muestra con estndar, el rea correspondiente a la fortificacin, la concentracin recuperada del estndar, el porcentaje de recuperacin, el promedio de la recuperacin de las tres muestras analizadas, indicndose adems la concentracin inicial del estndar.
TABLA 35. Datos obtenidos para el clculo de la recuperacin del cido palmtico C16:0
N Muestra rea muestra 213288 1449604 301332 1353641 404755 1596809 rea muestra fortificada - rea muestra sin fortificar 1236316 1052309 1192054 Concentracin recuperada estndar % de Recuperacin
1 1* 2 2* 3 3*
1,93 1,62 1,85 X= DE=
116,62 98,33 112,22 109,06 9,55
* muestra fortificada con estndar Concentracin verdadera estndar = 1,65 mg/mL
59
TABLA 36. Datos obtenidos para el clculo de la recuperacin del cido esterico C18:0
1 1* 2 2* 3 3*
0,32 0,27 0,34 X= DE=
79,20 66,17 84,30 76,56 9,35
TABLA 37. Datos obtenidos para el clculo de la recuperacin del cido oleico C18:1
1 1* 2 2* 3 3*
29,05 25,21 21,56 X= DE=
116,26 100,91 86,29 101,15 14,99
60
TABLA 38. Datos obtenidos para el clculo de la recuperacin del cido linoleico C18:2
1 1* 2 2* 3 3*
3,46 2,98 2,29 X= DE=
107,68 92,61 71,40 90,56 18,23
ANEXO 6 Muestras 6.1. Composicin en porcentaje de los cidos grasos de las muestras de aceite de oliva analizadas Se analizaron 26 muestras de aceite de oliva de las variedades picual (n=10), arbequina (n=10) y frantoio (n=6), el porcentaje, promedio y desviacin estndar de los cidos grasos de cada una de las muestras de las variedades se presentan en las tablas 38, 39 y 40.
61
TABLA 39. Composicin de cidos grasos expresado en porcentaje de steres metlicos, promedio y desviacin estndar de 10 muestras analizadas de aceite de oliva variedad picual
Ac. Graso MP1 MP2 MP3 MP4 MP5 MP6 MP7 MP8 MP9 MP10 PROM C16:0 12,00 12,28 11,49 11,45 11,43 9,52 10,37 10,44 11,50 11,23 11,17 C16:1 0,97 0,97 0,92 0,93 0,82 0,49 0,81 0,80 0,89 0,87 0,85 C17:0 0,05 0,05 0,05 0,04 0,03 0,00 0,05 0,04 0,06 0,05 0,04 C17:1 0,11 0,11 0,08 0,09 0,08 0,00 0,08 0,09 0,10 0,10 0,09 C18:0 2,43 2,49 2,89 2,67 2,96 3,47 2,98 3,01 2,81 2,75 2,85 C18:1 79,11 78,60 79,30 79,87 79,44 81,00 80,69 80,52 78,63 78,84 79,60 C18:2 3,17 3,09 3,23 3,29 3,42 3,63 3,14 3,09 4,12 4,02 3,42 C18:3 0,25 0,00 0,17 0,19 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,20 C20:0 0,36 0,35 0,36 0,35 0,38 0,45 0,39 0,39 0,38 0,38 0,38 C20:1 0,64 0,86 0,56 0,56 0,79 0,83 0,87 0,86 0,82 0,80 0,76 C22:0 0,12 0,11 0,10 0,10 0,11 0,00 0,12 0,11 0,00 0,13 0,09 DE 0,83 0,14 0,02 0,03 0,30 0,88 0,38 0,04 0,03 0,12 0,05
TABLA 40. Composicin de cidos grasos expresado en porcentaje de steres metlicos, promedio y desviacin estndar de 10 muestras analizadas de aceite de oliva variedad arbequina
Ac. Graso C16:0 C16:1 C17:0 C17:1 C18:0 C18:1 C18:2 C18:3 C20:0 C20:1 C22:0 MA1 MA2 MA3 MA4 MA5 MA6 MA7 MA8 MA9 MA10 12,95 12,18 9,78 11,67 13,30 13,52 12,88 12,55 12,72 13,34 1,12 0,89 0,58 0,95 1,00 1,37 0,96 1,11 1,12 1,10 0,11 0,12 0,14 0,05 0,15 0,11 0,15 0,09 0,09 0,12 0,18 0,28 0,21 0,09 0,29 0,25 0,27 0,20 0,19 0,25 2,74 2,03 2,91 2,57 2,83 2,43 2,37 2,22 2,37 2,50 73,43 75,35 78,81 79,04 72,35 71,50 73,46 74,41 73,76 74,42 7,12 7,22 6,08 4,02 6,49 8,02 8,11 7,32 7,01 6,24 0,27 0,34 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,39 0,42 0,50 0,36 0,42 0,40 0,42 0,38 0,39 0,39 0,57 0,60 0,27 0,77 0,66 0,82 0,86 0,78 0,75 0,67 0,14 0,15 0,19 0,10 0,15 0,12 0,00 0,13 0,13 0,14 PROM 12,49 1,02 0,11 0,22 2,50 74,65 6,76 0,31 0,41 0,67 0,13 DE 1,10 0,21 0,03 0,06 0,27 2,50 1,18 0,05 0,04 0,17 0,05
62
TABLA 41. Composicin de cidos grasos expresado en porcentaje de steres metlicos, promedio y desviacin estndar de 10 muestras analizadas de aceite de oliva variedad frantoio Ac. Graso MF1 MF2 MF3 MF4 MF5 MF6 PROM DE C16:0 11,30 12,09 11,09 10,90 11,90 10,70 11,33 0,56 C16:1 0,93 0,92 0,76 0,73 0,84 0,90 0,85 0,09 C17:0 0,08 0,05 0,05 0,05 0,05 0,05 0,06 0,01 C17:1 0,04 0,12 0,09 0,09 0,10 0,12 0,09 0,03 C18:0 2,53 1,92 2,94 2,76 2,51 2,39 2,51 0,35 C18:1 77,94 76,13 75,72 75,92 75,73 77,79 76,54 1,04 C18:2 5,18 6,71 6,94 6,87 6,72 6,26 6,45 0,67 C18:3 0,27 0,33 0,00 0,00 0,00 0,00 0,30 0,04 C20:0 0,41 0,36 0,41 0,00 0,41 0,34 0,39 0,03 C20:1 0,62 0,66 0,86 0,80 0,85 0,76 0,76 0,10 C22:0 0,14 0,12 0,15 0,15 0,14 0,00 0,12 0,06
63
6.2. Anlisis estadstico ANOVA
6.2.1. Anlisis ANOVA para el cido palmtico (C16:0) Analysis of Variance ----------------------------------------------------------------------------Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value ----------------------------------------------------------------------------Between groups 9,83947 2 4,91973 6,05 0,0077 Within groups 18,6924 23 0,812712 ----------------------------------------------------------------------------Total (Corr.) 28,5318 25 Multiple Range Tests for C16:0 by Muestras -------------------------------------------------------------------------------Method: 95,0 percent LSD Muestras Count Mean Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------2 10 11,171 X 3 6 11,33 X 1 10 12,489 X -------------------------------------------------------------------------------Contrast Difference +/- Limits -------------------------------------------------------------------------------1-2 *1,318 0,834013 1-3 *1,159 0,963035 2-3 -0,159 0,963035 ------------------------------------------------------------------------------- denotes a statistically significant difference.
64
6.2. 2. Anlisis ANOVA para el cido palmitoleico (C16:1 ) Analysis of Variance ----------------------------------------------------------------------------Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value ----------------------------------------------------------------------------Between groups 0,184445 2 0,0922226 3,60 0,0437 Within groups 0,589343 23 0,0256236 ----------------------------------------------------------------------------Total (Corr.) 0,773788 25 Multiple Range Tests for C16:1 by Muestras -------------------------------------------------------------------------------Method: 95,0 percent LSD Muestras Count Mean Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------3 6 0,846667 X 2 10 0,847 X 1 10 1,02 X -------------------------------------------------------------------------------Contrast Difference +/- Limits -------------------------------------------------------------------------------1-2 *0,173 0,14809 1-3 *0,173333 0,170999 2-3 0,000333333 0,170999 ------------------------------------------------------------------------------- denotes a statistically significant difference.
65
6.2.3. Anlisis ANOVA para el cido heptadecanoico (C17:0) Analysis of Variance ----------------------------------------------------------------------------Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio ----------------------------------------------------------------------------Between groups 0,0275415 2 0,0137708 26,57 Within groups 0,01192 23 0,000518261 ----------------------------------------------------------------------------Total (Corr.) 0,0394615 25 Multiple Range Tests for C17:0 by Muestras -------------------------------------------------------------------------------Method: 95,0 percent LSD Muestras Count Mean Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------2 10 0,042 X 3 6 0,055 X 1 10 0,113 X -------------------------------------------------------------------------------Contrast Difference +/- Limits -------------------------------------------------------------------------------1-2 *0,071 0,021061 1-3 *0,058 0,0243191 2-3 -0,013 0,0243191 ------------------------------------------------------------------------------- denotes a statistically significant difference.
P-Value 0,0000
66
6.2. 4. Anlisis ANOVA para el cido heptadecenoico (C17:1) Analysis of Variance ----------------------------------------------------------------------------Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value ----------------------------------------------------------------------------Between groups 0,110002 2 0,055001 27,46 0,0000 Within groups 0,0460633 23 0,00200275 ----------------------------------------------------------------------------Total (Corr.) 0,156065 25
Multiple Range Tests for C17:1 by Muestras -------------------------------------------------------------------------------Method: 95,0 percent LSD Muestras Count Mean Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------2 10 0,084 X 3 6 0,0933333 X 1 10 0,221 X -------------------------------------------------------------------------------Contrast Difference +/- Limits -------------------------------------------------------------------------------1-2 *0,137 0,0414017 1-3 *0,127667 0,0478066 2-3 -0,00933333 0,0478066 ------------------------------------------------------------------------------- denotes a statistically significant difference.
67
6.2.5. Anlisis ANOVA para el cido esterico (C18:0) Analysis of Variance ----------------------------------------------------------------------------Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value ----------------------------------------------------------------------------Between groups 0,731882 2 0,365941 4,05 0,0311 Within groups 2,07813 23 0,0903536 ----------------------------------------------------------------------------Total (Corr.) 2,81002 25
Multiple Range Tests for C18:0 by Muestras -------------------------------------------------------------------------------Method: 95,0 percent LSD Muestras Count Mean Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------1 10 2,497 X 3 6 2,50833 X 2 10 2,846 X -------------------------------------------------------------------------------Contrast Difference +/- Limits -------------------------------------------------------------------------------1-2 *-0,349 0,278085 1-3 -0,0113333 0,321105 2-3 *0,337667 0,321105 ------------------------------------------------------------------------------- denotes a statistically significant difference.
68
6.2.6. Anlisis ANOVA para el cido oleico (C18:1) Analysis of Variance ----------------------------------------------------------------------------Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value ----------------------------------------------------------------------------Between groups 126,314 2 63,1569 22,52 0,0000 Within groups 64,5003 23 2,80436 ----------------------------------------------------------------------------Total (Corr.) 190,814 25 Multiple Range Tests for C18:1 by Muestras -------------------------------------------------------------------------------Method: 95,0 percent LSD Muestras Count Mean Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------1 10 74,603 X 3 6 76,5383 X 2 10 79,6 X -------------------------------------------------------------------------------Contrast Difference +/- Limits -------------------------------------------------------------------------------1-2 *-4,997 1,54925 1-3 *-1,93533 1,78892 2-3 *3,06167 1,78892 ------------------------------------------------------------------------------- denotes a statistically significant difference.
69
6.2.7. Anlisis ANOVA para el cido linoleico (C18:2) Analysis of Variance ----------------------------------------------------------------------------Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value ----------------------------------------------------------------------------Between groups 64,3543 2 32,1771 46,39 0,0000 Within groups 15,9523 23 0,69358 ----------------------------------------------------------------------------Total (Corr.) 80,3066 25
Multiple Range Tests for C18:2 by Muestras -------------------------------------------------------------------------------Method: 95,0 percent LSD Muestras Count Mean Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------2 10 3,42 X 3 6 6,44667 X 1 10 6,763 X -------------------------------------------------------------------------------Contrast Difference +/- Limits -------------------------------------------------------------------------------1-2 *3,343 0,770465 1-3 0,316333 0,889656 2-3 *-3,02667 0,889656 ------------------------------------------------------------------------------- denotes a statistically significant difference.
70
6.2.8. Anlisis ANOVA para el cido linolnico (C18:3) Analysis of Variance ----------------------------------------------------------------------------Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value ----------------------------------------------------------------------------Between groups 0,459902 2 0,229951 5,56 0,0107 Within groups 0,951713 23 0,0413788 ----------------------------------------------------------------------------Total (Corr.) 1,41162 25
Multiple Range Tests for C18:3 by Muestras -------------------------------------------------------------------------------Method: 95,0 percent LSD Muestras Count Mean Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------2 10 0,061 X 1 10 0,061 X 3 6 0,376667 X -------------------------------------------------------------------------------Contrast Difference +/- Limits -------------------------------------------------------------------------------1-2 0,0 0,188189 1-3 *-0,315667 0,217302 2-3 *-0,315667 0,217302 ------------------------------------------------------------------------------- denotes a statistically significant difference.
71
6.2.9. Anlisis ANOVA para el cido araqudico (20:0) Analysis of Variance ----------------------------------------------------------------------------Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio ----------------------------------------------------------------------------Between groups 0,00396154 2 0,00198077 1,77 Within groups 0,0257 23 0,00111739 ----------------------------------------------------------------------------Total (Corr.) 0,0296615 25
P-Value 0,1923
Multiple Range Tests for C20:0 by Muestras -------------------------------------------------------------------------------Method: 95,0 percent LSD Muestras Count Mean Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------2 10 0,379 X 3 6 0,39 X 1 10 0,407 X -------------------------------------------------------------------------------Contrast Difference +/- Limits -------------------------------------------------------------------------------1-2 0,028 0,0309248 1-3 0,017 0,0357089 2-3 -0,011 0,0357089 ------------------------------------------------------------------------------- denotes a statistically significant difference.
72
6.2.10. Anlisis ANOVA para el cido eicosenoico (C20:1) Analysis of Variance ----------------------------------------------------------------------------Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value ----------------------------------------------------------------------------Between groups 0,288728 2 0,144364 2,35 0,1177 Within groups 1,41173 23 0,0613797 ----------------------------------------------------------------------------Total (Corr.) 1,70046 25
Multiple Range Tests for C20:1 by Muestras -------------------------------------------------------------------------------Method: 95,0 percent LSD Muestras Count Mean Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------3 6 0,481667 X 1 10 0,648 XX 2 10 0,759 X -------------------------------------------------------------------------------Contrast Difference +/- Limits -------------------------------------------------------------------------------1-2 -0,111 0,229201 1-3 0,166333 0,264659 2-3 *0,277333 0,264659 ------------------------------------------------------------------------------- denotes a statistically significant difference.
73
6.2.11. Anlisis ANOVA para el cido behnico (C22:0) Analysis of Variance -------------------------------------------------------------------------------------------------Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value --------------------------------------------------------------------------------------------------Between groups 0,00651282 2 0,00325641 1,24 0,3068 Within groups 0,0601833 23 0,00261667 ----------------------------------------------------------------------------Total (Corr.) 0,0666962 25
Multiple Range Tests for C22:0 by Muestras -------------------------------------------------------------------------------Method: 95,0 percent LSD Muestras Count Mean Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------2 10 0,09 X 3 6 0,116667 X 1 10 0,125 X -------------------------------------------------------------------------------Contrast Difference +/- Limits -------------------------------------------------------------------------------1-2 0,035 0,0473237 1-3 0,00833333 0,0546447 2-3 -0,0266667 0,0546447 -------------------------------------------------------------------------------* denotes a statistically significant difference.
74

Cromatografia de Gases

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UNIVERSIDAD DE CHILE FACULTAD DE CIENCIAS QUMICAS Y FARMACUTICAS DEPARTAMENTO DE CIENCIA DE LOS ALIMENTOS Y TECNOLOGA QUMICA LABORATORIO DE QUMICA DE ALIMENTOS

MEMORIA PARA OPTAR AL TTULO DE QUIMICO FARMACUTICO

VIVIANA ROSARIO JOFRE REBOLLEDO

Director: Q. Dr. Paz Robert Co- Director: QF. Nalda Romero

SANTIAGO, CHILE ENERO DE 2009

FINANCIAMIENTO DEL PROYECTO INNOVA-CORFO FORTALECIMIENTO DE LA INDUSTRIA OLIVINICOLA NACIONAL (07CN13IAM-10).

Nmero de plantaciones por variedad de olivo.

linoleico (C18:3), araqudico (C20:0), eicosenoico (C20:1), behnico (C22:0).

Lmites de deteccin y cuantificacin del mtodo (mg/mL)

Cantidades pesadas [mg] y concentracin [mg/mL] de cada cido graso

Valores de yi e yi obtenidos mediante la curva de calibracin del cido palmitoleico.

Valores de yi e yi obtenidos mediante la curva de calibracin del cido linolnico.

Valores de yi e yi obtenidos mediante la curva de calibracin del cido araqudico.

Valores de yi e yi obtenidos mediante la curva de calibracin del cido eicosenoico

Valores de yi e yi obtenidos mediante la curva de calibracin del cido behnico.

Valores de y/x obtenido para cada cido graso.

Datos obtenidos para el clculo de la recuperacin del cido palmtico C16:0

Datos obtenidos para el clculo de la recuperacin del cido esterico C18:0

Datos obtenidos para el clculo de la recuperacin del cido oleico C18:1

Datos obtenidos para el clculo de la recuperacin del cido linoleico C18:2

Participacin de las distintas regiones en el rea plantada con olivos

Variedades de olivos ms plantadas expresadas en porcentaje.

Curva de calibracin para el cido palmtico (C16:0)

Curva de calibracin para el cido esterico (C18:0)

Curva de calibracin para el cido oleico (C18:1)

Curva de calibracin para el cido linoleico (C18:2)

Curva de calibracin para el cido palmitoleico (C16:1)

Curva de calibracin para el cido linolnico (C18:3)

Curva de calibracin para el cido araqudico (C20:0)

Curva de calibracin para el cido eicosenoico (C20:1)

Curva de calibracin para el cido behnico (C22:0)

1.1. Antecedentes generales

1.2. Distribucin de Olivos en Chile

1.2.1. Norte Grande

1.2.2. Norte Chico

1.2.3. Zona Central

FIGURA 1. Participacin de las distintas regiones en el rea plantada con olivos.

1.3. Variedades de Olivos en Chile

Arbequina Frantoio Leccino Picual Coratina

1.4. Variedades de Aceite de Oliva

Dichos aceites son objeto de la clasificacin y de las denominaciones siguientes:

1.4.2. Aceite de oliva refinado:

1.4.4. Aceite de orujo de oliva crudo:

1.4.5. Aceite de orujo de oliva refinado:

1.4.6. Aceite de orujo de oliva:

1.5. Cualidades del aceite de oliva

1.6. Legislacin vigente para el aceite de oliva

1.7. Validacin de mtodos analticos

Existen dos tipos de validacin: prospectiva y retrospectiva.

2.1. Objetivo general

2.2. Objetivos especificos

III. MATERIALES Y METODOS

arbequina, 10 muestras de variedad picual y 6 muestras de variedad frantoio, obtenidas de Chile-Oliva.

Stndares de steres metlicos: cido palmtico (C16:0), cido

3.1.3 Material de Laboratorio

3.2.1.1. Preparacin de la muestra

3.2.1.2. Anlisis Cromatogrfico

3.2.2.1 Intervalo de linealidad y sensibilidad del mtodo.

(yi - yi)2 (n-2)

Los lmites de deteccin y cuantificacin se calcularon a travs de las ecuaciones 3 y 4.

Lmite de deteccin (LD) es:

Lmite de cuantificacin (LC) es:

3.2.2.3 Medidas de precisin