Les -thalassmies, tmoins des migrations prhistoriques dans le bassin mditerranen

PERRIN Pascale

Action Origine de lHomme, du Langage et des Langues

A. FICHE ADMINISTRATIVE Titre du projet :
Les -thalassmies, tmoins des migrations prhistoriques dans le bassin mditerranen

Mots-cls :
Archologie/Anthropologie biologique (Homo sapiens)/ADN moderne/ ADN ancien/Gntique des populations/ Evolution/ Bases de donnes/Linguistique

Rsum du projet (10 lignes maximum) :

Lanalyse de marqueurs gntiques peut contribuer de faon importante clairer lhistoire de nos origines. Le marqueur gntique utilis ici est une mutation thalassmique, touchant le gne de globine (IVS-I-110). Cette mutation trs frquente dans le bassin mditerranen y prsente un gradient est-ouest. Lanalyse des haplotypes en amont du gne de -globine permet de retracer lorigine et la diffusion de cette mutation. Les donnes actuelles conduisent proposer son origine dans la rgion anatolienne. Lidentification de cette mutation sur des ADN anciens savre donc un excellent marqueur de populations lorigine du processus de pr-nolithisation et de nolithisation de lEurope. Afin de prciser lorigine gographique et chronologique de cette mutation, des chantillons seront prlevs sur les restes humains dune srie de sites de lAnatolie et du levant nord. La confrontation des donnes archo-anthropologiques, gntiques et linguistiques aboutiront une meilleure connaissance des premires socits de chasseurscueilleurs du Palolithique suprieur puis des populations du nolithique.

1. Responsable scientifique du projet

Nom PERRIN.......................... Prnom..Pascale............................... Grade......Matre de Confrences...............................................................
Discipline du responsable scientifique: ..Biologie molculaire, bioinformatique, volution

tablissement de rattachement .......Universit Claude Bernard Lyon I -.

Adresse professionnelle : N, rue , BP .. Centre de Gntique Molculaire et Cellulaire UMR 5534 43, Boulevard du 11 Novembre 1918

Code postal 69622 Commune .Villeurbanne cedex Tl 04.72.43.29.48 Fax 04.72.44.05.55

E-Mail : pperrin@cismsun.univ-lyon1.fr

2. Laboratoire ou organisme de rattachement de lquipe de recherche

Intitul Centre de Gntique Molculaire et Cellulaire

Type de formation (cocher la case utile) - Units CNRS : unit propre du CNRS X unit associe ou mixte du CNRS

Prciser le code unit UMR 5534. Prciser la dlgation rgionale : .....Rhne-Alpes....... - Units hors CNRS : unit universitaire (Prciser luniversit) .......................................................................................... Autre (Prciser : EPST, Association, quipe trangre...)

Nom du directeur de lorganisme : ......Dr Pierre COUBLE...... Adresse : N , rue , BP Code postal 69622 Tl 04.72.43.13.26 43, boulevard du 11 Novembre 1918 Commune ...Villeurbanne cedex....................................... Fax 04.72.44.05.55

3. Autre(s) laboratoires ou organisme(s) partenaires

Cette section est reproduire autant de fois que ncessaire. Intitul Maison de lOrient mditerranen Jean POUILLOUX Universit Lyon 2 CNRS UPR 7537 Discipline(s) couverte(s) par lquipe : ...Archologie, paloarchologie, mthodes informatiques appliques larchologie
Nom du directeur de lquipe Dr Danile STORDEUR

Membre(s) partenaire(s) : et cf figure rcapitulative des membres participants Nom : LE MORT Prnom : Franoise Grade : Charge de recherche CNRSE-Mail : flm@mom.fr
Adresse : N , rue , BP...7, rue Raulin.

Code postal 69365 Commune .Lyon 07.................................................. Tl 04.72.71.58.75 Fax 04.72.72.08.65

3. Autre(s) laboratoires ou organisme(s) partenaires

Cette section est reproduire autant de fois que ncessaire. Intitul ....Evolution Molculaire et ADN fossile Discipline(s) couverte(s) par lquipe : Biologie molculaire, ADN ancien
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Nom du directeur de lquipe :..Catherine HNNI Membre(s) partenaire(s) : et Cf figure rcapitulative des membres participants Nom : HNNI..Prnom : Catherine Grade : Charge de recherche CNRSE-Mail : hanni@cismsun.univ-lyon1.fr Adresse : N , rue , BP Universit Claude Bernard Lyon I Code postal 69622 Commune ..Villeurbanne cedex Tl 04.72.43.29.50 Fax 04.72.44.05.55

3. Autre(s) laboratoires ou organisme(s) partenaires

Cette section est reproduire autant de fois que ncessaire. Intitul Dpartement dArchologie, Facult des Lettres et Sciences Sociales

Discipline(s) couverte(s) par lquipe : Histoire, linguistique Membre(s) partenaire(s) : Nom : NACACHE..Prnom : Albert Grade : Professeur E-Mail : anaccash@nidal. com. Adresse : N , rue , BP......BP 113 6328 Beyrouth, Liban Tl 00.961.1.365.284 Fax 00.961.1.363.306

B. PROJET SCIENTIFIQUE
(10 pages maximum, bibliographie comprise insrer ici)

Introduction
Parmi les grands tournants de l'histoire de l'homme moderne, l'mergence d'un langage complexe et la nolithisation constituent les deux lments les plus dterminants. C'est, en effet, dans ces deux innovations fondamentales que s'enracine l'tat prsent de l'espce humaine, non seulement dans le domaine de l'exploitation du milieu mais aussi dans ceux de la culture et des structures mentales. Or c'est au Proche Orient que les phnomnes de nolithisation ont commenc se dvelopper vers 11 000 B.P. (Cauvin 1997, Aurenche et Kozlowski 1999). L'analyse du spectre gntique des populations europennes rvle que le Proche-Orient a bien particip au peuplement de l'Europe suivant un processus dont les effets sur la composition gntique des populations d' prsent vont en s'attnuant mesure que l'on s'loigne du point de dpart. C'est plutt l'Anatolie qui est dsigne comme zone de dpart de cette diffusion linguistique ; la nolithisation de l'Europe, qui se serait effectue partir de l'Anatolie, est considre comme ayant diffus les langues proto-indo-europennes, partir de 8 000 B.P. (Renfrew 1993).

Le complexe de gnes de globines fait partie des loci humains les plus tudis, en raison du nombre de mutations affectant ses gnes. Certaines sont lorigine des thalassmies, une des maladies gntiques les plus frquentes dans le monde (Weatherall et Clegg 1996). En effet, selon lOrganisation Mondiale pour la Sant, plus de 150 millions de personnes sont considrs comme porteurs de -thalassmie, essentiellement dans les rgions du monde o svit la malaria: le bassin mditerranen, le centre Est africain, lInde et lAsie du Sud. Ces personnes, en gnral,
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assymptomatiques, prsentent une microcytose et une anmie lgre ou modre; les htrozygotes sont protgs contre Plasmodium falciparum, lagent infectieux de la malaria. Ainsi, dans certaines rgions impaludes, une -thalassmie peut prsenter une forte prvalence, mais a contrario, dans d'autres rgions tout aussi impaludes, elle sera prsente une faible frquence. Ce remarquable degr d'htrognit ne peut donc tre la consquence exlcusive de la slection par la malaria. Lanalyse molculaire des chromosomes -thalassmiques a dmontr une grande htrognit des mutations responsables de ces maladies (plus de 180). Parmi elles, deux mutations sont trs frquentes dans le bassin mditerranen: le stop codon 39 (C T) (introduction dun codon stop au niveau du codon 39) et lIVS-I-110 (G A) (mutation G-A au nuclotide 110 de lintron 1). En effet, la mutation stop codon 39 prsente un gradient d'Ouest (96 % des -thalassmies en Sardaigne (Rosatelli et al. 1992)) en Est (40 50% au Liban ( Chehab et al. 1987) et en Turquie (Tadmouri et al. 1998)). La rpartition de la mutation IVS-I-110 est diffrente: elle reprsente environ 80 % des -thalassmies Chypre (Baysal et al. 1992), 50 % au Liban (Chehab et al. 1987), 40 % en Turquie (Tadmouri et al. 1998), avec une diminution des frquences vers les pays de louest mditerranen. Le fait que ces mutations soient prdominantes dans lEst de lEurope pour lIVS-I-110 et dans lOuest de lEurope pour le Stop Cd 39, suggre quelles sont les plus anciennes dans ces deux rgions. Lanalyse des spectres de distribution des frquences de ces mutations savre donc essentielle pour retracer lorigine et la diffusion des thalassmies dans le bassin mditerranen.

Rgion analyse
Depuis quelques annes (Trabuchet et al. 1991 a et b, Bouhass, Perrin et Trabuchet 1994, Perrin et al. 1998, Fullerton et al. 1994, 2000), lintrt sest port sur le polymorphisme de squence dune rgion intergnique situe en amont du gne de -globine, denviron 800 pb et comprenant 9 sites ponctuels polymorphes et un microsatellite composite (AT)xTy (Cf. Figure suivante). Nous avons mis au point diffrentes techniques pour l'analyse du polymorphisme et le cas chant lidentification de la mutation -thalassmique : ARMS-PCR (PCR alllespcifique), qui permet chez un sujet htrozygote dtablir indpendamment la structure de chacun de ses deux chromosomes (haplotype), double-ARMS et squenage direct sur fragments PCR bicatnaires. Pour cela nous disposons dune batterie damorces robustes (plus dune dizaine) dont les principales sont mentionnes dans la figure 1. Parmi les trs nombreuses mutations responsables de thalassmies nous nous focaliserons essentiellement sur la mutation IVS-I-110. Elle est en effet, particulirement intressante compte tenu de sa frquence plus leve en mditerrane orientale et qui va dcroissant vers les pays riverains de la Mditerrane occidentale (figure 2) :

RESULTATS
Cette mutation apparat dans 7 contextes haplotypiques diffrents mais seul lun de ces haplotypes lui est trs fortement associ. Cest en Turquie que la diversit haplotypique est de loin la plus grande (figure 3). Cette diversit haplotypique pourrait alors sexpliquer par une occurrence multiple de la mutation sur des chromosomes diffrents. Cette hypothse est cependant peu probable. Le site est, en effet, conserv dans les gnes de globine de diffrents primates (chimpanz, gorille, bonobo) ce qui exclut la possibilit dun point chaud de mutation. Dautre part, cette mutation est trouve quasi exclusivement dans le bassin mditerranen et non en Asie. Lorigine unicentrique semble donc la plus plausible et la diversit observe serait engendre par des vnements de recombinaisons ou de conversions gniques aussi bien dans la partie 5 que dans la partie 3 du gne de globine. Pour que la mutation soit transfre dun haplotype un
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autre, il faut que le chromosome porteur de la mutation IVS-I-110 recombine avec un chromosome de structure diffrente prsent dans la population normale. Or, les donnes que nous avons obtenues sur les chromosomes normaux sont cohrentes. La mutation serait alors probablement apparue aprs la sparation des lignes caucasienne et indienne, il y a environ 10 30 000 ans B.P. (Cavalli-Sforza, Menozzi, Piazza, 1994) dans le corridor levantin ou le plateau anatolien. Sa diffusion serait intervenue ds les temps prhistoriques puis lors des vnements de migrations historiques de faon plus rcentes. La prsence de cette mutation dans certaines rgions peut tre en effet la rsultante dvnements de colonisation ou doccupation.
A

OBJECTIFS SCIENTIFIQUES
Le polymorphisme et les mutations du gne -globine au niveau des ADN modernes et anciens

Notre trs bonne connaissance du contexte gntique des -thalassmies dans les populations mditerranennes actuelles nous permet de disposer dun corpus de donnes tout fait exceptionnel puisqu ce jour nous disposons de lhaplotype de plus de 500 chromosomes A, -thalassmiques ou drpanocytaires. Dans ce contexte, lexploitation et lenrichissement de nos donnes prliminaires sur les ADNs modernes puis le passage sur les ADNs anciens savre essentiel. Cette approche sinscrit directement dans cette nouvelle discipline quest la palopathologie molculaire. Pour la premire fois, et ceci constitue une approche tout fait originale, nous pourrons tester des scnarios construits sur les donnes actuelles, par des analyses au niveau des ADN extraits partir d'ossements anciens. Afin de situer prcisment l'origine gographique et chronologique de cette mutation, des chantillons seront prlevs sur les restes humains d'une srie de sites pipalolithiques et nolithiques de l'Anatolie et du Levant nord. Ceci sera facilit par le fait que des caractristiques particulires du squelette accompagnent souvent les maladies de type thalassmie. Des modifications ostologiques svres sont, en effet, frquemment trouves sur les crnes ainsi que les os longs ou les dents des sujets malades (Ortner et Putschar 1985; Hershkovitz et al. 1997). Des modifications osseuses pouvant tre en rapport avec des maladies de type thalassmie (hyperostose poreuse svre notamment) ont t signales dans de nombreux sites prhistoriques de la rgion considre (zbek 1989, 1998, 1999, inter alia). Ces seules constatations macroscopiques ne permettent cependant pas de poser un diagnostic sr, car l'hyperostose poreuse semble pouvoir tre lie aussi bien aux anmies ferriprives qu'aux anmies gntiques (Stuart Macadam 1987, 1991). Ce seul critre nest donc pas suffisant pour diagnostiquer avec certitude une thalassmie mais il peut constituer un bon indicateur. La plupart des analyses sur lADN ont t menes jusqu prsent sur lADN mitochondrial (Pbo et al. 1988, Krings et al. 1997, Hnni et al. 1994 a,b) mais des travaux rcents ont dmontr la faisabilit sur lADN nuclaire (Greenwood et al. 1999) et notamment dans la cadre des pathologies bactriennes (Drancourt et al. 1998) ou gntiques (Filon et al. 1995). Nos amorces ont dailleurs t testes en vrai grandeur sur des chantillons dADN ancien vieux de 8000 12000 ans originaires du Maroc (Braud-Colomb et al. 1995) et permettent d'analyser des fragments dADN courts (100 300 pb, tailles raisonnables sur des ADN dgrads), et chevauchants, ce qui permettra l'analyse dune rgion assez informative.

Les sites archologiques et lchantillonnage

Les fouilles effectues dans la rgion Anatolie-Levant Nord, qui est fondamentale pour la comprhension de l'origine et des dveloppements de la sdentarisation dans le bassin mditerranen, ont amen la mise au jour de trs nombreux restes humains nolithiques (environ 600 individus ont, par exemple, t dcouverts ayn) et de quelques ossements pipalolithiques. Les tudes anthropologiques sont cependant rares et une grande partie du matriel est reste indite ou n'a fait l'objet que de brefs rapports prliminaires. Les populations pipalolithiques et nolithiques de cette rgion sont trs mal connues, tant du point de vue des pratiques funraires que de celui de la morphologie, de la dmographie ou de la pathologie. La slection des sites s'est effectue l'issue d'un inventaire pralable des gisements ayant livr des restes humains. Les restes humains pipalolithiques sont trs rares. Les gisements de Sarkli Magara (Turquie) et Saaid (Liban), o quelques ossements ont t trouvs, ont t retenus. Pour le Nolithique prcramique, les sites choisis se rpartissent sur l'ensemble de la rgion (figure 4). La rpartition chronologique et gographique des sites choisis permettra de cerner l'origine de la mutation et de suivre sa diffusion dans l'espace et dans le temps, ce qui devrait conduire la mise
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en vidence de mouvements de populations dans la rgion considre. Cette approche palogntique devrait donc apporter des donnes permettant de confirmer ou d'infirmer les diffrentes hypothses archologiques concernant la nolithisation de l'Anatolie et sa diffusion vers les Balkans et l'ensemble du bassin mditerranen et de tester lhypothse de lorigine de la mutation IVS-I-110. Les processus qui ont conduit la nolithisation de l'ensemble de l'Anatolie n'apparaissent pas encore clairement mais ils pourraient tre galement lis des mouvements de populations vers l'ouest, mouvements qui aboutiraient l'introduction de l'agriculture et de l'levage au cours du Nolithique cramique en Grce et dans les Balkans . Ces recherches contribueront galement une meilleure connaissance des populations nolithiques d'Anatolie et du Levant Nord, notamment de leur tat sanitaire. Donnes linguistiques :

Les donnes disponibles concernant le Proche-orient ont lavantage dtre abondantes et serres donc plus faciles connecter. Ainsi, il sera plus ais dlaborer des scnarios descriptifs de la prhistoire linguistique du Procheorient, rfltant les processus de formation et de diffrenciation des communauts linguistiques Afro-asiatiques. En parallle, les donnes archologiques proche-orientales nombreuses, relatives la priode 12000-2000 av. J.C. (Naccache A. 1996, 1999) permettent de reconstituer une trajectoire sociale presque complte reliant les socits de chasseurs-cueilleurs du Palolithique suprieur aux socits complexes de lAge du bronze (urbaines, rurales, pastorales). La convergence qui se fait jour entre les domaines archologique, linguistique et gntique savre donc extrmement prometteur quant la richesse des informations que nous pourrons tirer sur les premires socits de chasseurs-cueilleurs du Palolithique suprieur, puis des populations sdentarises au pr-nolithique et au nolithique.

4. Cration dune base de donnes Enfin, les donnes archo-anthropologiques rassembles l'occasion de la slection des sites et du prlvement des chantillons serviront, tout comme les donnes gntiques, la construction d'une banque de donnes sur les populations actuelles et anciennes de la rgion Anatolie - Levant Nord. Aux donnes archologiques et gntiques, il sera particulirement intressant de confronter les donnes linguistiques connues dans la rgion du Proche-Orient. Bibliographie :
* Angel (1966) Science 153 : 760-763. * Aurenche O., Kozlowski S.K. (1999) La naissance du nolithique au proche-Orient. Paris Errance. * Braud-Colomb et al. (1995) Am. J. Hum. Gen. 57: 1267-1274. * R. Bouhass, Perrin P. and Trabuchet G. (1994) Hemoglobin 18: 211-219. * Cauvin J. (1997) Naissance des divinits, naissance de lagriculture. Paris CNRS Eds. * Cavalli-Sforza L.L., Menozzi P., Piazza A. (1996) The History and Geography of Human Genes. Princeton University press, New York USA. * Chehab F.F., Der Kaloustian V., Khouri F.P., Deeb S.S., and Kan Y.W. (1987). Blood. 69: 1141-1145. *Drancourt et al. (1998) PNAS 95: 12637-12640. * Filon et al. (1995) Nature Genetics 9,365-368. *Fullerton S.M., Harding R.M., Boyce A.J., Clegg J.B. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 : 1805-1809. * Fullerton S.M., Bond, J., Schneider J.A., Hamilton B., Harding R.M., Boyce A.J., Clegg J.B. (2000) Mol. Biol. Evol. 17 : 179-188. * Greenwood A.D. et al. (1999) Mol. Biol. Evol. 16: 1466-1473 * Hnni et al. (1994)a Genomics 22/ 487-489. * Hnni et al. (1994)b PNAS 91: 12336-12340. * Hershkovitz et al. (1997) Am. J. Phys. Anthr. 104 : 213-226. * Krings et al. (1998) Cell 90: 19-30. * Maggio A., Giambona A., Cai S.P., Wall J., Kan Y.W., and Chehab F.F. (1993). Blood. 81: 239-242 * Naccache A. (1996) Proceed. Of the Seminar for Arabian studies 26 . * Naccache A. (1999) History and Theory 38 : 4. * Ortner and Putschar (1985) Identification of Pathological Conditions in Human SkeletalRemains. Smithsonian Contributions to Anthropology 28,Washington and London, Smithsonian Institution Press. * zbek (1989) V. Arkeometri SonulariToplants : 161-172. 7

* zbek (1998) In Arsebk, Mellink and Schirmer (eds) : Light on Top of theBlack Hill. Studies presented to Halet ambel, Istanbul, EgeYaynlar : 567-579. * zbek M. (1999) Aeikli (Aksaray) Neolitik Caerkeinde Demir Eksikliinden KaynaklananRahatsizlik. Belleten C, LXII, 26 : 391-402. Pbo et al. (1988) Nucl. Acids Res. 16:9775-9787. * P. Perrin, Bouhass R., Mselli L., Garguier N., Nigon M., Bennani C., Labie D. and G. Trabuchet (1998) Gene 213 : 169-177. * Renfrew C. (1993) The Roots of ethnicity, Archaelogy, Genetics and the Origins of Europe. Roma : Unione internazionale degli Istiti di Archeologia Storia e Storia dellArte in Roma. * Rosatelli M.C., Dozy A., Fa V., Meloni A., Sordu R., Saba L., Kan Y.W., and Cao A. (1992) Am. J. Hum. Genet. 50: 422-426. * Stuart-Macadam (1987) Am. J. Phys. Anthr. 74 : 521-526. Stuart-Macadam (1991) InOrtner and Aufderheide (eds) : Human Paleopathology. CurrentSyntheses and Future Options, Washington and London,Smithsonian Institution Press : 36-39. * Tadmouri GO, Tzmen S, Ozelik H, Ozer A, Baig SM, Senga EB, and Basak AN (1998) American Journal of Hematology 57 : 215-220. * Tadmouri GO, Garguier N, Demont J, Perrin P, and Basak AN, soumis. * Trabuchet G., Elion J., Baudot G., Pagnier J., Bouhass R., Nigon V.M., Labie D., Krishnamoorthy R. (1991 a). Hum. Biol. 63: 241-252. * Trabuchet G., Elion J., Dunda O., Lapoumeroulie C., Ducrocq R., Nadifi S., Zohoun I., Chaventre A., Carnevale P., Nagel R., Krishnamoorthy R., Labie D.(1991 b). Human Genetics. 87: 597-601. * Weatherall D.J. and Clegg J.B. (1996) Nature Medecine. 2: 847-849.

Gntique des populations et thalassmies o Pascale PERRIN MCF , Biologie molculaire, bioinformatique
e-mail : pperrin@cismsun.univ-Lyon1.fr

Linguistique o Albert NACACHE, Historien, linguiste

o Guy TRABUCHET, MCF Biologie Molculaire

Centre de Gntique Molculaire et Cellulaire. UMR 5534 Universit Lyon I 43, Boulevard du 11 Novembre 1918 69622 Villerubanne cedex

e-mail : anaccash@nidal.com
Dpartment darchologie Facult des lettres et sciences sociales Universit libanaise Beyrouth

Archologie o Franoise LE MORT CNRS , CR Paloanthropologie

e-mail : flm@mom.fr

ADN ancien o Catherine HNNI CR CNRS , Biologie Molculaire, ADN ancien

e-mail: hanni@cismsun.univ-lyon1.fr

Anatolie Levant nord

o Christine CHATAIGNIER CNRS , IR Archologie, mthodes informatiques appliques larchologie o Gassia ARTINE Doctorante, archologue
CNRS UPR 7537 Maison de lOrient Mditerranen Universit Lyon 2 7, rue Raulin 69365 Lyon 07

o Jocelyne DEMONT, TC CNRS Biologie Molculaire

Evolution molculaire et ADN fossile UMR 5534 - CNRS Universit Lyon I 43, Boulevard du 11 Novembre 1918 69622 Villeurbanne cedex

Collaborations
TURQUIE o Ghazi O. TADMOURI, Post-Doc Biologiste Molculaire
Financ pour 10 mois par le rseau des MSH

LIBAN o Lala ZAHED, Ass. Prof. Gnticienne

Department of pathology and medicine American University of Beirut Beirut

o Hadi OZBAL, Prof. Anthropologue

Department of chemistry Bogazii University 80815 Bebek - Istanbul

o Nazli BASAK, Prof. Biologiste Molculaire

Department of Molecular Biology and Genetics School of Arts and Sciences Bogazii University 80815 Bebek - Istanbul -

o Metin ZBEK, Prof. Anthropologue

Dir. Departement danthropologie Edebiyat FaKltesi Hacettepe niversitesi Beytepe - Ankara -

Atlantique BULGARIE ESPAGNE SARDAIGNE

Mer caspienne

24 40
CHYPRE

Mer noire

8,5
ALGERIE

0,5
TUNI SIE

TURQUIE LIBAN 48,5

ISRAEL

SYRIE

25

14

Mer mditerrane

80

44
JORDA NIE

21,5
Figure 2 : Frquence de la mutation IVS-I-110 dans le bassin mditerranen.

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Atlanttique

BULGARIE Mer caspienne SARDAIGNE Mer noire TURQUIE LIBAN ALGERIE TUNISI E

ESPAGNE

SYRIE

Mer mditerrane

CHYPR E

JORDANI E

Hap 1

Hap 2

Hap 3

Hap 5

Hap 6

Hap 9

Hap 10

Figure 3 : Frquence des haplotypes de squences associs la mutation IVS-I-110

Figure 4 : Sites du Nolithique prcramique.

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