KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI

I.

TUJUAN PERCOBAAN Setelah melakukan percobaan ini, mahasiswa diharapkan dapat :

1. Menjelaskan teori kromatografi cair kinerja tinggi 2. Mengoperasikan alat kromatografi cair dengan baik dam benar 3. Menganalisis suatu senyawa kimia baik secara kualitatif maupun kuantitatif dengan menggunakan alat kromatigrafi cair tekanan tinggi

II.

ALAT DAN BAHAN YANG DIGUNAKAN

Alat yang digunakan 1. Seperangkat alat KCKT/HPLC yang dilengkapi dengan injector dan pencetak kromatogram 2. Kolom Lichosphere C-18 3. Syringe 4. Penyaring milipore 5. Neraca analitik 6. Labu takar 100mL dan 1000mL 7. Pipet volum 2 mL, 5mL, 10mL 8. Corong gelas 9. Gelas kimia/gelas piala 100mL,250mL

Bahan yang digunakan Untuk penetapan kadar benzoate/sorbat dalam makanan

1. Larutan asam benzoat

2. Larutan asam sorbat

3. Fanta

4. Coca-Cola

III.

TEORI SINGKAT

Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) adalah metode pemisahan komponen dalam larutan berdasarkan ukuran dan polaritas molekulnya. Bila ditinjau dari sistim peralatannya maka KCKT termasuk kromatografi kolm karena fase diam yang dipakai diisikan ke dalam kolom, sedangkan bila ditinjau dari proses pemisahannya KCKT dapat digolongkan sebagai kromatografi adsorpsi atau kromatografi partisi.

Proses pemisahannya berdasarkan afinitas, filtrasi gel dan ion yang berpasangan, Akan tetapi proses pemisahannya tetap dilaksanakan di dalam kolom disertai pemakaian pelarut pengembang dengan tekanan tinggi. Sistim KCKT memiliki dua kegunaan yaitu pemisahan dan pendeteksian.

Keuntungan KCKT Dapat dilakukan pada suhu kamar Detektor KCKT dapat divariasi

Pelarut pengembang dapat dipakai berulangkali, demikian juga dengan kolomnya Ketepatan dan ketelitiannya relatif tinggi di jajaran teknik analisis fisika kimia

Teknik pemisahan pada KCKT

Sistim Isokratik

Teknik pemisahan denagn komposisi fase gerak tidak berubah selama analisis berlangsung. Hal ini berarti sistim fase gerak tetap selama pemisahan berlangsung sehingga pemisahan contoh yang mengandung komponen komponen dengan polaritas bervariasi adalah memberikan hasil yang kurang memuaskan.

Sistem Gradien

Teknik pemisahan dengan komposisi fase gerak berubah secara periodik selama analisis berlangsung. Hal ini berarti selama analisis, polaritas fase gerak bervariasi atau berubah ubah. Sistim ini digunakan untuk pemisahan contih yang mengandung komponen komponen dengan polaritas bervariasi sehingga akan memberikan hasil pemisahan yang baik.

1. Reservoir fase gerak, adalah tempat penampungan fase gerak yang di gunakan selama sistim digunakan 2. Poimpa, digunakan sebagai pendorong fase gerak yang digunakan

3. Filter adalah penyaring fase gerak yang digunakan sesuai dengan fase gerak yang digunakan 4. Pulsa damper, berfungsi untuk mengatur tekanan fase gerak yang digunakan 5. Pemasukan contoh, menggunakan injector 6. Kolm berisi fase diam 7. Detector untuk mengetahui pemisahan apa yang telah terjadi dan berguna sebagai alat untuk memberika data dan mengevaluasi hasil pemisahan tersebut secara kualitatif dan kuantitatif

Berbagai jenis detector yang telah dikembangkan untuk kromatografi cairan yaitu :

Detector Indeks Refraksi Detector UV/VIS Detector Fluoresence Detector Hantaran

8. Pengolah data, ini berbentuk computer yang berfungsi mengolah data yang dihasilkan menjadi bentuk kromatogram

IV.

PROSEDUR PERCOBAAN

a. Persiapan penetapan Vitamin C dalam minuman

Pembuatan Larutan

1. Larutan Standar Induk Asam Askorbat 500mg/L Timbang dengan teliti 50,0 mg asam askorbat, masukan dalam labu takar 100 ml, Larutkan dan tera hingga tanda garis denagn asam methaposfat 2%, kocok hingga homogeny 2. Larutkan Asam Metaphospat 2% (pelarut) Timbang lebih kurang 20 gram asam metaphospat dalampiala gelas 500 ml larutka dengan aquades, aduk hingga larut. Masukkan ke dalam labu takar 1 liter, impitkan hingga tanda tera, kemudian koocok hingga homogeny

3. Asam Fosfat 0,1% (v/v) pH 2,2 (fase gerak) Masukkan 0,5 mL asam phosfat pekat ke dalam labu takar 500mL yang berisi aquades, kemudian impitkan hingga tanda tera dengan aquades, kocok hingaa homogen.

Persiapan Contoh

Timbang dengan teliti 2 gram contoh ke dalam piala gelas 25 mL Tambahkan 10 mL asam methapospat 2% aduk hingga larut, Masukan ke dalam labu takar 50 mL, impikan hingga tanda tera denagan asam methaposfat 2%, kocok hingga homogeny, Saring larutan dengan kertas Whatman No. 42, Saring kembali larutan dengan penyaring milipore, Larutan sipa diinjeksikan pada alat HPLC pada panjang gelombang 280 nm, kecepatan alir 0,75 ml/min dan volume injeksi 10 uL.

b. Persiapan penetapan kadar bezoat dan sorbat dalam makanan

Pembuatan Larutan 1. Fase Gerak Buffer fosfat ( 0,03 m, pH 6,5) dalam Methanol (95 + 5) Timbang 1,9 gr K2HPO4 dan 2,5 gr KH2PO4 Masukan dalam labu takar 100mL, larutkan dengan 950 mL air suling, kemudian tambahkan 50 mL methanol, kocok larutan hingga homogen Sring larutan dengan penyaring 0,45 um. Siapkan fase gerak dan degas setiap akan diguanakan. 2. Larutan Standar Baku 500 mg/liter Timbang dengan teliti masing masing 0,050 gr Asam Benzoat dan 0,050 gr Asam Sorbat Masukkan dalam labu takar 100 mL, tambahkan 20 mL Methanol kemudian encerkan dengan air suling hingga 100 mL, kocok larutan hingga homogen dala

Persiapan Contoh

Timbang dengan teliti 5 10 gr contoh yang sudah dihaluskan Tambahkan 10 mL Methanol, kemudian aduk dengan baik dan masukkan dalam labu ukur 50 mL Tambahkan air suling dan tera hingga tanda garis

Kocok larutan, kemudian saring dengan kertas saring whatman No. 42 Hasil saringan disaring kembali dengan penyaring catridge C 18 Arutan siap untuk di injeksikan pada HPLC Periksa Base Line dengan menginjeksikan larutan blanko Injeksikan larutan Standar Injeksikan larutan contoh

Benzoat dan sorbat dalam contoh dipisahkan dalam matriksnya berdasarkan perbedaan partisi dan cairan. Pemisahan dilakukan secara isokartik pada panjang gelombang 227 nm, kecepatan alir 1,0 ml/min da volume injeksi 20 uL. c. Persiapan Alat HPLC Persiapan Alat HPLC Agilent 1100 1. Nyalakan computer : CPU dan monitor 2. Nyalakan Isocratic Pump dan Detektor (dengan cara tekan tombol power) 3. Tunggu beberapa saat sampai muncul IP addres di bootp muncul, lalu panggil software Hp-Chem dengan cara klik 2x icon Instrument On-line . Maka window software Hp-chem akan tampak. 4. Klik tombol ON di sebelah kanan untuk mengaktifk Isocratic pump dan detector , tunggu beberapa saat sampai instrument ready dengan indicator lambang Isocratic pump dan detector berwarna hijau

SETTING METODE
1. Pilih Instrument lalu klik, pilih set-up pump lalu klik atau dengan cara

klik lambang Isocratic pump lalu pilih set-up pump 2. Ketik nilai flow secara bertahap dengan kenaikan 0,25 mL/menit Ketik nilai stop time , contoh 5 menit , lalu klik Ok

3. Pilih Instrument klik set-up detector atau dengan cara klik lambang detector klik set-up detector 4. Ketik panjang gelombang yang diinginkan missal 254 nm, lalu klik ok 5. Pilih metode klik save as , ketik nama metode yang diinginkan lalu klik ok

RUNNING SAMPEL

1. Pilih Run Control lalu klik 2. Pilih sampel info lalu klik isi parameter parameter yang ada : operator

name, data file, direktori menyimpan file, sampel name , klik Ok Tunggu sampai baseline stabil dan lurus, lalu ketik balance

INJECTION SAMPEL

1. Load syringe dengan sampel/standar yang akan dianalisis

2. Set posisi manual injector pada posisi load position

3. Masukan syringe pada manual injector lalu tekan dorong plunger syringe sampai berhenti
4. Putar manual injector searah jarum jam menuju posisi inject. Maka

proses running sampel akan berlangsung. Langkah A s/d dilakukan pada window Methode & Run Control Setelah Running sampel diperoleh data.

INTERGRATION (Menampilkan peak yang diinginkan dan membuang peak yang tidak diharapkan)

1. Pilih View lalu klik, pilih Data analysis lalu klik 2. Pilih File lalu klik, pilih load signal, lalu klik 3. Pilih data file yang akan ditampilkan lalu klik ok

(akan tampil grafik sampel yang dipanggil)

4. Pilih Integration lalu klik integration event lalu klik akan tampil table

integration berisi : area reject, slope sensitivity, height reject dan sebagainya, caranya : ketik nilai height reject yang diharapkan missal 100, lalu pilih integration klik, plih integrate (lambang integrate) lalu klik. Nilai height reject akan berubah
5. Setelah

mendapatkan peak yang diharapkan, keluar dari table integration event dengan cara pilih tanda Checklist di pojok kiri atas table integration atu pilih integration lalu klik, pilh save & exit lalu klik

Maka nilai integration akan disimpan pada metoda yang sedang aktif.

Menbuat Kurva Kalibrasi

1. Pilih View lalu klik, pilih Data Analysis 2. Pilih file lalu klik, pilih Load Signal lalu klik

Maka data file berupa grafik akan tampil

3. Pilih Calibration lalu klik, pilih New Calibration Table

Akan muncul window komunikasi klik ok 4. Selanjutnya muncul table calibration , isi parameter dengan nama compound dan konsentarsi (ug/mL) 5. Setelah diisi , klik di salah satu kolom maka kurva kalibrasi akan terbentuk , lalu klik ok dengan demikian kurva kalibrasi telah disimpan di dalam metode yang aktif.

SETTING REPORT

1. Pilih View lalu klik, Data analysis lalu klik 2. Pilih Report lalu klik, pilih specify report lalu klik Akan muncul parameter parameter, bias dipilih langsung, selanjutnya Klik ok
3. Pilih file lalu klik, pilih load signal lalu klik

Pilih data file yang akan diprint 4. Pilih print preview lalu klik, maka report akan tampil di layar 5. Pilih print lalu klik data akan diprint

MEMATIKAN INSTRUMENT HPLC 1100

1. Pilih View , pilih Methode & Run Control lalu klik 2. Pilh set-up pump, turunkan nilai flow sampai Nol secara bertahap dengan pengurangan 0.25 L/menit

3. Pilih tombol Off yang ada di sebelah kanan bawah diagram instrument

lalu klik, maka Isocratic pump dan detector akan mati

4. Tutup Software Hp-Chem dengan Pilih File lalu klik, pilih Exit ,

selanjutnya ikuti perintah Software ( tinggal pilih Yes saja ) 5. Setelah Software ditutup, matikan Instrument HPLC 1100 dengan cara Menekan kembali Tombol Power

PURGING

1. Buat nilai flow 0.25 mL/menit , buka purge valve dengan berlawanan arah jarum jam , Maka solvent atau fase gerak akan mengalir dari pompa langsung ke pembuangan 2. Naikkan flow secara bertahap sampai 1.5 mL/menit range maksimum flow 4 mL/menit 3. Setelah udara tidak ada lagi dalam selang, turunkan flow secara bertahap sampai 0.25 mL/menit lalu tutup purge valve dengan memutar setelah jarum jam, maka solvent atau fase gerak akan mengalir ke kolom dan detecktor. Naikkan kembali sampai nilai yang V. DATA PENGAMATAN

1 . Tabel Luas Area Benzoat Dan Sorbat

KOMPONEN STANDART MIZONE SEGAR SARI

SORBAT 3650.65283 2438.99634 2454.95094

BENZOAT 3.2710 . 104 2.10128 . 104 5648.09570

2. Tabel Kadar Benzoat dan Sorbat Dalam Minuman Kaleng

SAMPEL

KADAR SORBAT(ppm)

KADAR BENZOAT(ppm)

MIZONE SEGAR SARI

45.8499
42,0072

44.0861 10.7863

Keterangan : gambar kromatogram terlampir

VI.

PERHITUNGAN

A. penentuan kadar sorbet dan benzoate pada minuman mizone

Diketahui : A sorbat mizone : 2438.99634 ; A benzoate mizone: 2.10128 . 104 ; C st : 500mg/l A standar sorbat : 3650.65283 ; A standar benzoate : 3.2710 . 10 ; W sp : 7.2857 gr
4

Ditanya : a. C sorbat mizone = ..? b. C benzoat mizone =..? Penyelesaian:

a. C sorbat mizone

Csc = 2438.99634/3650.65283 . 500 ppm 7.2857 Csc = 45.8499

b. C benzoate mizone

Cbc = 2.10128 . 10 / 3.2710 . 10 . 500 ppm 7.2857

Cbc = 44.0861

B. penentuan kadar sorbet dan benzoate pada minuman Segar Sari

Diketahui : A sorbat Segar Sari : 2454.95094 ; 5648.09570 ; C st : 500 mg/l A benzoate Segar Sari :

A standar sorbat : 3650.65283 ; A standar benzoate : 3.2710 . 10 ;

4

W sp : 8.0042 gram

Ditanya : a. C sorbet Segar Sari = ..? b. C benzoat Segar Sari =..? Penyelesaian:
a. C sorbat Segar Sari

Csc = 2454.95094

/3650.65283

. 500 ppm

8.0042 Csc = 42,0072

b. C benzoate Segar Sari

Cbc = 5648.09570 / 3.2710 . 10 . 500 ppm 8.0042 Cbc = 10.7863

VII.

ANALISA PERCOBAAN

Dari percobaan yang di lakukan terjadi :

HPLC adalah kromatografi yang fase geraknya menggunakan zat cair bukan gas seperti pada Gc dan kapiler pada HPLC lebih kecil sehingga zat yang akan di analisa harus bebas dari partikel yang dapat menyumbat dan di saring dengan milipore.

Sebelum menganalisis sample, terlebih dahulu melakukan standardisasi dengan larutan standar, yaitu larutan sorbat dan benzoate. Hal ini dilakukan untuk melakukan pembanding pada saat menganalisis kandungan zat tersebut dalam suatu sample makanan dan minuman. Untuk melakukan standardisasi diharapkan alat injeksi tidak kotor sehingga tidak mempengaruhi kualitas dari kurva, maka dari itu alat injeksi dicuci dengan menggunakan etanol. Pada percobaan kali ini kami melakukan percobaan penentuan kadar benzoate dan kadar sorbat pada minuman kaleng yaitu merk Mizone dan Segar Sari. Pada penentuan kadar sorbat dan benzoate pada Mizone diketahui bahwa kadar yang terkandung dalam mizone lebih besar daripada segar sari. Dari hasil kurfa yang didapat dari analisis minuman mizone adalah tidak terlalu jauh dengan kurfa larutan standar, namun pada hasil kurfa yang didapat dari analisis minuman segar sari adalah terjadi perbedaan yang jauh dengan kurfa larutan standar. Pada kurfa minuman segar sari didapatkan 4 puncak yang dihasilkan, dimana yang seharusnya hanya ada 2 puncak. Ini berarti 2 puncak lainnya adalah zat-zat lainnya yang terkandung didalam minuman tersebut,dimana kami tidak mengetahuinya karena tidak didapatkannya standar dalri zat tersebut.

VIII. KESIMPULAN Dari percobaan yang di lakukan dapat disimpulkan bahwa:

Mizone memiliki kadar sorbat dan benzoate lebih besar di bandingkan Segar sari

Benzoate memiliki puncak gelombang dan waktu retensi yang lebih tinggi dan besar di bandingkan sorbat.

Dan di dapatkan kadar benzoate dan sorbat pada minuman tersebut adalah sebagai berikut:

SAMPEL Mizone Segar Sari

KADAR SORBAT(ppm) 45.8499

42,0072

KADAR BENZOAT(ppm)
44.0861 10.7863

IX. SUMBER PUSTAKA Rusdianasari .2010. Petunjuk Praktikum Kimia Analitik Instrument.Polsri. Palembang

BUI & COOPER, RPLC Determination of Benzoic and Sorbic acids in Foods. J.A.O.A.C Vol 70 No 5 1987 p.892

Journal official Methods of Analysis ( AOAC) Synder, L.R., 1999. Introductoin to Modern Liquid Chromatography. Second Edition. Wiley Interscience.