PROCESNA I INSTRUMENTALNA ANALIZA

Dr. sc. Dragana Mutavdi Pavlovi, doc.

Zavod za analitiku kemiju Fakultet kemijskog inenjerstva i tehnologije Sveuilita u Zagrebu Ak. g. 2011./2012.

KROMATOGRAFSKI SUSTAV

Kromatografski sustav ine analizirani uzorak te pokretna i nepokretna faza Kromatografija normalnih faza - nepokretna je faza polarna (silikagel, aluminijev oksid), a pokretna nepolarna Kromatografija obrnutih faza - nepokretna faza nepolarna (C18-modificirani silikagel), a pokretna polarna
kromatografsko razdvajanje normalnih faza

pokretna faza

nepokretna faza

kromatografsko razdvajanje obrnutih faza

pokretna faza

nepokretna faza

Redoslijed opadanja polarnosti komponenti uta Crvena plava

NEPOKRETNA FAZA

Nepokretna faza je vrsta tvar ili kapljevina na inertnom nosau. Obzirom na kemijsku strukturu i polarnost, sorbensi se dijele na:

polarne anorganske (hidrofilne) sorbense, iji su predstavnici silikagel, aluminijev oksid i magnezijev silikat nepolarne anorganske sorbense, kao to su aktivni ugljen i grafit polarne vezane faze, npr. aminopropil, cijanopropil, diol nepolarne vezane faze poput alkana, C8 i C18 ugljikovodika i polarne organske sorbense koje predstavljaju celuloza, hitin, poliamid

Izbor nepokretne faze uvjetovan je prirodom ispitivanog spoja, prirodom ravnotee kromatografskog procesa i vrstom veze koja nastaje izmeu ispitivanog spoja i kromatografske podloge. Stoga je izbor sorbensa jedan od najvanijih imbenika u kromatografskom procesu.

silikagel je jedan od najvie upotrebljavanih nepokretnih faza opa mu je formula SiO2xH2O, a strukturno predstavlja nepravilnu prostornu reetku SiO4-tetraedra

Kemijski vezane faze dobivaju se uvoenjem pogodnih funkcionalnih skupina

na povrinu polarnog silikagela, ime se moe bitno utjecati na promjenu njegovih adsorpcijskih svojstava. Svojstva kemijski vezanih faza ovise o:

vrsti i duljini vezanih lanaca ugljikovodika,

pokrivenosti povrine vezanom skupinom,

vrsti intermolekularnih interakcija organskog otapala i funkcionalne skupine na povrini adsorbensa

Shematski prikaz modificiranih silikagelnih podloga

Povrina silikagela modificira se djelomino zamjenom hidroksilnih skupina polarnim funkcionalnim skupinama (cijanopropil, diol, aminopropil) ili nepolarnim (C8-C18). Kemijskim vezanjem zamjenjuje se najvie do 50% silanolnih skupina. Uvoenjem nepolarnih skupina smanjuje se broj aktivnih mjesta na povrini silikagela, ime se uvelike smanjuje njegova polarnost, a uvedene polarne skupine i same postaju sorpcijski centri.

Fizikalno impregnirani slojevi U tankoslojnoj se kromatografiji silikagelni sloj moe impregnirati razliitim dodacima sa svrhom poboljanja njegovih svojstava za eljenu separaciju. To se provodi prilikom priprave sloja, a moe se obaviti i naknadno uranjanjem ili prskanjem ve pripremljenog sloja sredstvom za impregniranje. Izbor sredstva ovisi o cilju kromatografskog razdvajanja i mora voditi poboljanju postojeeg kromatografskog sustava. Dodaci koji utjeu na kromatografski proces mogu se klasificirati na: Tvari koje mijenjaju pH-vrijednost kromatografskog sustava Tvari koje mijenjaju ravnoteno stanje kromatografskog sustava Tvari koje pojaaju selektivnu adsorpciju Specifini dodaci kromatografskoj podlozi

POKRETNA FAZA

da bi se s obzirom na izbor nepokretne faze omoguio optimalan kromatografski sustav za razdvajanje eljene smjese treba izabrati pogodan

sustav otapala koji ini pokretnu fazu

priroda veze koja se ostvaruje izmeu ispitivanog spoja te nepokretne i pokretne faze vaan je imbenik realnog kromatografskog procesa

intermolekularne interakcije van der Waalsovim silama, veze dipol-inducirani

dipol, dipol-dipol te vodikova veza najee su u kromatografiji normalnih i

obratnih faza

izbor pogodnog otapala, odnosno smjese otapala, provodi se s obzirom na sposobnost otapala da stvaraju vodikove veze (odjeljivanje hidrofilnih, odnosno

hidrofobnih spojeva)

otapala moraju biti kromatografski ista, to znai da ne sadravaju nikakvu neistou koja bi mogla smetati tijekom kromatografskog odreivanja

S obzirom na sposobnost tvorbe vodikove veze otapala su podijeljena u pet skupina: 1. tekuine kojima su molekule meusobno povezane viestrukim vodikovim vezama (voda, glicerin, aminoalkoholi, etilenglikol i sl.) 2. tekuine kojima su molekule povezane vodikovom vezom i koje mogu tvoriti vodikovu vezu s molekulama ispitivanog spoja (alkoholi, fenoli, amini) 3. tekuine kojima molekule sadre atome kisika, koji mogu imati udjela u vodikovoj vezi, ali ne sadre atome vodika (ketoni, eteri, esteri, aldehidi) 4. tekuine kojima molekule sadre atom vodika, koji moe tvoriti vodikovu vezu, ali ne sadre odgovarajue atome koji bi mogli imati udjela u vezi (kloroform, diklormetan) 5. ostale tekuine kojima molekule mogu tvoriti vodikovu vezu

Jakost otapala u kromatografiji normalnih faza poveava se s porastom polarnosti pokretne faze, a u kromatografiji obrnutih faza se smanjuje s njezinom polarnou

Snyderov trokut selektivnosti

Na temelju indeksa polarnosti, P, te parametara selektivnosti (Xe, Xd, Xn) otapala, Snyder ih je podijelio u osam skupina to je grafiki prikazao Snyderovim trokutom selektivnosti. Parametri selektivnosti ovise o proton-donorskim (Xd) , proton-akceptorskim (Xe) i dipolnim (Xn) svojstvima molekula otapala.

1. alifatski eteri, trialkil amini, tetrametil gvanidin, heksametil amidi fosforne kiseline 2. alifatski alkoholi 3. derivati piridina, tetrahidrofuran, amidi (osim formamida), glikol eteri, sulfoksidi 4. glikoli, benzilalkohol, octena kiselina, formamid 5. metilen klorid, etilen klorid 6. (A) trikrezil fosfat, alifatski ketoni i esteri, polieteri, dioksan, (B) sulfoni, nitrili, propilen karbonat 7. aromatski ugljikovodici, halogen supstituirani aromatski ugljikovodici, nitro spojevi, aromatski eteri 8. fluoralkani, m-krezol, voda, kloroform

najjednostavniji nain odjeljivanja tekuinskom kromatografijom je izokratno eluiranje pri kojoj analit kroz kolonu nosi jedno otapalo odnosno ne mijenja se sastav pokretne faze tijekom cijele analize ipak esto bolje razdvajanje se postie (vea djelotvornost) primjenom gradijentnog eluiranja uz upotrebu dvaju ili vie sustava otapala znatno razliitih polarnosti pri gradijentnoj eluciji sastav pokretne faze se mijenja tijekom analize kontinuirano ili skokovito

primjer gradijentnog eluiranja

Optimizacija polarnosti pokretne pokretne faze utjee na odjeljivanje

faze

promjena

sastava

TEKUINSKA KROMATOGRAFIJA VISOKE DJELOTVORNOSTI Pokretna faza: Nepokretna faza: Tlak: tekuina punila vrlo finih zrna nekoliko MPa (do 4 x 107 Pa = 400 bara)

Podjela HPLC (High Performance Liquid Chromatography): (1) Razdjelna kromatografija (2) Adsorpcijska kromatografija

(3) Ionsko-izmjenjivaka kromatografija

(4) Kromatografija iskljuenjem na osnovi veliine estica Doseg HPLC: najvei u separacijskim tehnikama, proizvodnja > mld USD godinje

Prednosti HPLC: osjetljivost, prilagodljivost, analiza neisparljivih i termiki osjetljivih spojeva, iroki spektar uzoraka (industrija, znanost: aminokiseline, nukleinske kiseline, eeri, lijekovi, pesticidi, organometalni spojevi, anorganske tvari i dr.)

Shema tekuinskog kromatografa visoke djelotvornosti

Kromatografska analiza: 1. Unoenje (injektiranje) analita unoenje uzorka u pokretnu fazu

2. Razdvajanje analita u koloni sastojci iz analita razdvajaju se u koloni na temelju razliite raspodjele izmeu dviju faza 3. Eluacija (ispiranje) komponenti iz kolone razliiti sastojci izlaze iz kolone u razliitim vremenima 4. Detekcija eluirane komponente obino se analiziraju mjerenjem neke od fizikalnih svojstava komponente (indeks refrakcije, UV apsorpcija, elektrina vodljivost )

osnovni dijelovi spremnik (jedan ili vie) crpke (pumpe) injektor ili sustav za unoenje uzorka kolona termostat detektor

uloga izvor protoka pokretne faze za pokretanje pokretne faze za precizno odmjeravanje i unoenje uzorka u kolonu za razdvajanje komponenata smjese za odravanje konstantne temperature detektira komponente smjese istim redoslijedom kako one naputaju kolonu za dobivanje trajnog dokumenta o pojavljivanju svake komponenti iz ispitivane smjese

sustav za registriranje signala iz detektora

SPREMNIK POKRETNE FAZE

stakleni ili elini spremnik

esto se u sklopu tog sustava nalazi i oprema za uklanjanje plinova i vrstih estica iz tekuine otplinjavanje je postupak kojime se otopljeni plinovi uklanjaju iz otapala noeni mjehuriima inertnog, netopljivog plina plinovi, zbog stvorenih kromatografske zone mjehuria, mogu prouzroiti irenje

mjehurii i estice mogu ometati rad detektora

PUMPE ILI CRPKE

pumpa je jedan od najvanijih dijelova kromatografskog sustava tekuinske kromatografije visoke djelotvornosti pumpa odrava kontinuirano konstantan protok pokretne faze kroz HPLC injektor, kolonu i detektor pumpe se moe podijeliti na pumpe s konstantnim tlakom i pumpe s konstantnim protokom pumpe s konstantnim tlakom se koriste kod punjenja kolona sorbensom, tj. punilima pumpe s konstantnim protokom su kolone koje se uobiajeno koriste u HPLC sustavima za primjenu u tekuinskoj kromatografiji pogodne su dvije vrste mehanikih pumpi: pumpe s vijanim pogonom i reciprona pumpa pumpe s vijanim pogonom imaju mali kapacitet ( 250 mL) i nepogodne su za promjenu otapala reciprone pumpe puno se vie upotrebljavaju jer su pogodne za rad s gradijentom i daju konstantne protoke. Nedostatak im je taj to su skupe Mijeanje otapala kod visokog tlaka zahtjevi kojima moraju udovoljiti pumpe vrlo su strogi: A i B otapala; SC-nadzorni sustav; PA i PB- pumpa za otapala A i pumpa za tlakovi do 40 MPa otapalo B, izlaz bez pulsiranja tlaka M-komora za mijeanje otapala brzine protoka od 0,01 do 10 mL/min reproducibilnost protoka od 99,5% ili bolja otpornost na koroziju izazvanu razliitim otapalima
Shematski prikaz reciprone pumpe a- motor; b- regulator brzine; c- brtva; d- klip; e- ulaz otopine; f- ventili; g- izlaz otopine Mijeanje otapala kod niskog tlaka A i B - otapala; SC-nadzorni sustav; P - pumpa, SV solenoidni ventil M - komora za mijeanje otapala

Protok je vrlo bitan za kromatografski proces Vei protok kroz kolonu uzrokuje jae irenje kromatografskih zona slabije (loije) razdvajanje pojedinih sastojaka uzorka krae vrijeme analize Manji protok kroz kolonu manje irenje kromatografskih zona bolje razdvajanje pojedinih sastojaka uzorka dulje vrijeme analize

SUSTAV ZA UNOENJE UZORKA

uzorak se najee unosi kroz elastinu membranu, tzv. septum taj nain nije osobito reproducibilan pa je ogranien na tlakove nie od 10 MPa pri unoenju uzorka uz zaustavljanje protoka makne se matica na poetku kolone, a uzorak se injekcijskom trcaljkom unese na poetak punila najee se unosi putem plinskog ventila u sustavu za unoenje uzorka nalazi se i vie izmjenjivih petlji kojima se u kolonu mogu unositi koliine uzorka od 5 do 500 L

a)

b)

Sustav za runo (a) i automatsko unoenje uzorka Varian ProStar 410 (b) te shematski prikazi petlje kojima se unose uzorci u kolonu

KOLONE

od nehrajueg elika ili od stakla (samo za niske tlakove <4MPa) punjene granulama nepokretne faze punilo najee silikagel povijesni razvoj poveanja separacijske uinkovitosti HPLC kolona

duljina kolone najee 5 25 cm (danas postoje na tritu i one od 3-7,5 cm) unutarnjeg promjera: 2; 4,6 mm promjer zrna punila: 2; 4; 5; 10 m

DETEKTORI

HPLC detektori mogu se podijeliti u dvije kategorije: nespecifini (ili univerzalni) mjeri se refrakcijski indeks (RI) ili dielektrina konstanta uzorka specifini fizikalna ili kemijska svojstva se mjere pod idealnim uvjetima, npr. UV apsorpcija, spektrometrija masa (MS) HPLC detektori: = Refrakcijski detektor (RI) za mjerenje refrakcijskog indeksa = UV/Vid detektori: -s fiksnom valnom duljinom -s promjenjivom valnom duljinom -s nizom dioda (DAD) = Fluorescentni detektor (FLD) = Konduktometrijski detektor = Spektrometar masa (MS). Treba naglasiti neke bitne parametre koje mora zadovoljavati jedan detektor: mali pomak i um kod snimanja bazne linije (izuzetno bitno kod analize u tragovima) visoka osjetljivost brzi odziv iroko linearno dinamiko podruje rada (jer to pojednostavljuje kvantifikaciju) mali mrtvi volumen (to znai minimalno irenje kromatografske krivulje) dizajn protonih elija detektora koje e sprjeavati ponovno mijeanje razdvojenih analita neosjetljivost na promjenu vrste otapala, protoka i temperature da se njima jednostavno i pouzdano rukuje podesivi tako da se mogu optimirati za razliite spojeve nedestruktivni obzirom na uzorak

Refrakcijski detektor (RI)

a)

univerzalni HPLC detektor, a princip mu se temelji na mjerenju refrakcijskih indeksa otopina koje prolaze kroz eliju to je vea razlika refrakcijskog indeksa izmeu pokretne faze i uzorka, tim je vea osjetljivost detektora. problem nastaje kod vrlo sloenih uzoraka jer se esto deava da neki od analita imaju isti indeks refrakcije kao i pokretna faza, pa te komponente postaju nevidljive za detektor kod ovih detektora predstavlja veliki problem rad s gradijentom pokretne faze, jer svaka promjena u sastavu pokretne faze zahtjeva ponovno uravnoteenje detektora danas postoje dvije vrste RI detektora, i obje vrste zahtijevaju dvostruke elije, gdje kroz jednu prolazi uzorak, a kroz drugu konstantno za usporedbu prolazi pokretna faza bez uzorka. jedna vrsta RI detektora se naziva deflekcijskim detektorima (slika a), kojima ne smetaju neistoe i zrak u uzorku i pokretnoj fazi i mogu pokriti cijelo refrakcijsko podruje od 1.000 do 1.750 s jednom elijom, no imaju malu osjetljivost druga vrsta RI detektora (slika b) su reflektivni detektori koji se temelje na Frensel principu i u pravilu su vrlo rijetko u uporabi iako imaju visoku osjetljivost i kod viih koncentracija uzoraka, te dobro rade i kod vrlo malih protoka pokretne faze. Glavni nedostatak im je esta promjena prizmi. openito RI detektori osjetljivi su na promjene koncentracije od 1 ppm, a na pomak bazne linije znaajno utjee promjena sastava pokretne faze, nepravilno mijeanje, kao i promjena temperature i tlaka preporua se termostatiranje detektora b)

a) b)

Deflekcijski RI detektor Refleksijski Fresnelov RI detektor

UV/VIS-apsorpcijski detektori

svojstva: univerzalnost, jednostavnost, selektivnost, osjetljivost vrlo su raireni naelo: apsorpcija elektromagnetskog zraenja u UV-(170 - 400 nm) i VIS-podruju (400 - 750 nm) Lambert-Beerov zakon (za kvantitativnu primjenu): A=bc

tipini UV/VIS-detektor: volumen 1-10 l, duljina 2-10 mm, tlak < 40 bar (potrebni reduktori)

s fiksnom valnom duljinom

s promjenjivom valnom duljinom

Detektori s filterima Izvor zraenja: Hg-lunica iz koje filtar izdvaja = 254 nm (odnosno 250, 313, 334 nm) - primjena ograniena Izvor zraenja: deuterijeva (D2) ili volframova (W) lampa s vie filtera (rotirajui) - za serijske analize uzoraka poznata sastava Detektori s monokromatorima Prizme ili optike reetke razdvajaju polikromatsko svjetlo na komponente odreenih valnih duljina koje se potom djelovanjem pukotine odaberu prema uzorku da bi se snimio cijeli kromatogram

Alternativa: za svaku komponentu uzorka (ako su dovoljne razlike tR) odabire se najpogodnija , uz moguu kompjutorsku podrku izvor D2-lunica (190-800 nm), uz izdvajanje putem reetke snopova irokih 2-4 nm (starije naprave 20-40 nm)

Detektor s nizom dioda Naelo: osvjetljivanje uzorka polikromatskim svjetlom (bijelim) D2lunice, a potom disperzija optikom reetkom na snopove 2 nm koji istodobno padaju na niz od cca 316 dioda cijeli snimak (scan): 0,1 sekunda (u praksi nekoliko sekundi) uz odlinu reproducibilnost dobiva se i pohranjuje cijeli spektar svake komponente

Fluorescencijski detektori fluorescencija neke tvari apsorbiraju elektromagnetsko zraenje i pri relaksaciji (prelazak iz pobuenog u osnovno stanje) emitiraju zraenje vie valne duljine (esto u vidljivom dijelu spektra, VIS) ogranieno na fluorescirajue spojeve (farmacija, prirodni i kliniki spojevi,naftni derivati); mogua je pretvorba nefluorescirajuih u fluorescirajue spojeve! izvori elektromagnetskog zraenja: (1) Hg-lunica (emitirano svjetlo izolira se s filtera) (2) Xe-izvor (monokromatori su optike reetke) emitirana svjetlost iri se u svim smjerovima pa je fotoelektrini detektor pod 900 prema upadne zrake

Elektrokemijski detektori npr. polarografski- komponente koje se mogu oksidirati ili reducirati; potencijal DME se dovodi na vrijednost granine id svih komponenata i registrira se I=f(t)

konduktometrijski komponente koje elektrinu provodnost pokretne faze

se analiziraju

mijenjaju

Detektori spektrometra masa

podjela prema nainu ionizacije uzorka: ionizacija elektrorasprenjem (ESI)1, kemijska ionizacija pri atmosferskom tlaku (APCI)2, fotoionizacija pri atmosferskom tlaku (APPI)3 kod LC/MS sustava kao analizatori masa mogu se koristiti: kvadrupolni analizator koji se sastoji od etiri tapa pod elektromagnetskim poljem (Q)4, analizator koji zarobi ion u upljini ili ionska klopka (IT) ili linearna ionska klopka (LIT) 5, analizatori koji mjere vrijeme preleta iona kroz cijev nakon pobude elektrostatskom silom (TOF)6 analizatori gdje ioni ulaze u ciklotron te nakon elektromagnetske pobude ovisno o masi izlaze iz komore do detektora (FT-ICR)7 te njihove kombinacije (hibridni sustavi razliiti analizatori masa vezani u seriju) koje se mogu vezati jedna na drugu (ESI-MS/MS, Q-TOF, TOF-MS, IT-MS/MS, LIT-FT-ICR) ioni nakon analizatora masa dolaze na detektor, a u LC/MS sustavu kao detektori se koriste elektronsko pojaalo i mikrokanalna ploa

1 engl. Electrospray Ionization (ESI) 2 engl. Atmospheric Pressure Chemical Ionizatio (APCI) 3 engl. Atmospheric Pressure PhotoIonization (APPI) 4 engl. Quadrupole (Q) 5 engl. Ion Trap (IT) 6 engl. Time-of-Flight (TOF) 7 engl. Fourier Transform-Ion Cyclotron Resonance (FT-ICR)

Vrste razliitih LC/MS ionizacijskih tehnika i njihova primjena Primjena LC/MS ionizacijska tehnika ESI -za odreivanje molekularne mase i strukture spojeva velikih ionskih molekula kao to su proteini, peptidi i oligonukleotidi, no moe se primjeniti i za manje molekule -ionizacija moe dati i pozitivne i negativne ione [ESI(+) i (-)]

APCI -za odreivanje molekularne mase i strukture molekula <2000, spojevi mogu biti i polarni i nepolarni -ionizacija moe dati i pozitivne i negativne ione [APCI(+) i (-)]

APPI -za odreivanje molekularne mase manje polarnih spojeva -ionizacija moe dati i pozitivne i negativne ione [APPI(+) i (-)]

Maseni analizatori Q

Maseni analizatori u LC/MS sustavima Karakteristike analizatora -lagan za rukovanje -niske cijene -visoke osjetljivosti kod analize izabranog iona (SIM mode) -izvrstan za kvantifikaciju -nedostatak mu je to se ne mogu dobiti tone mase -manje brzine skeniranja ili snimanja od TOF

IT

-mogunost brzog skeniranja -dobra rezolucija -dobro definirani putovi fragmentacije iona uz detaljnu interpretaciju -nema informaciju o tonoj masi -vee osjetljivosti od QQQ, ali manje fragmentacije od QQQ

TOF -dobiva se tona informacija o masi iona -visoke rezolucije -brzo skeniranje i dobra osjetljivost skeniranja -nema mogunosti vezanja u MS/MS sustav bez uporabe CID moda

FT-ICR -moe se vezati u vie stupnjeva kao MS/MS bez dodatnog masenog analizatora, kao i IT -pokriva irok spektar masa uz izvrsnu rezoluciju -najskuplji je od svih masenih analizatora

Detektor UV/Vid

Izbor LC detektora prema njihovim karakteristikama Osjetljivost Selektivnost Prednosti + Niski trokovi univerzalan

Primjena
Organske kiseline, masnoe nakon derivatizacije, anorganski ioni Antioksidansi, konzervansi, mirisi, boje, antiparazitici, lijekovi, mikotoksini, pesticidi, vitamini, amini nakon derivatizacije Umjetna sladila, mikotoksini, vitamini, karbamati, glifosati Vitamini, anorganski ioni Karbamati, lipidi Pesticidi, proteini Ugljikohidrati, nearomatske kiseline

UV/DAD

Mogunost odreivanja istoe kromatografske krivulje

FLD Elektrokemijski MS scan MS SIM RI

++ ++ ++ -

+ + ++ ++ -

Visoka osjetljivost Visoka osjetljivost Odreivanje spojeva strukture

Visoka osjetljivost Univerzalan

IONSKA KROMATOGRAFIJA (IONO-IZMJENJIVAKA KROMATOGRAFIJA

omoguuje kvalitativno i kvantitativno odreivanje kationa i aniona odnosno iona ili nabijenih molekula primjenom razliitih ionsko izmjenjivakih smola i eluensa ioni se razliito rasporeuju na ionsko izmjenjivakoj smoli, a separacijskom elucijom dolazi do odvojenog eluiranja ispitivanih iona separacija se uglavnom temelji na razlici u afinitetu sastojaka uzorka prema ionskoj izmjeni nepokretna faza ima ionske funkcionalne grupe koje reagiraju s ionima iz analizirane smjese suprotnog naboja na osnovu toga metoda se dijeli na: kromatografiju kationske izmjene nepokretna faza ima negativno nabijene funkcionalne grupe kromatografiju anionske izmjene nepokretna faza ima pozitivno nabijene funkcionalne grupe najee konduktometrijskom detekcijom mjerena vodljivost omoguuje i kvantifikaciju pojedinih eluiranih iona

Funkcionalne skupine u ionskoj kromatografiji

Anionski izmjenjiva Dietilaminoetil (DEAE) Kvaterni amonij (Q) Kationski izmjenjiva

Funkcionalna skupina -O-CH2-CH2-N+H(CH2CH3)2 -O-CH2-CHOH-CH2-O-CH2-CHOH-CH2-N+(CH3)3

Kvaterni aminoetil (QAE) -O-CH2-CH2-N+(C2H5)2-CH2-CHOH-CH3

Karboksimetil (CM) Sulfopropil (SP)

Metilsulfonat (S)

-O-CH2-COO-O-CH2-CHOH-CH2-O-CH2-CH2-CH2SO3-O-CH2-CHOH-CH2-O-CH2-CHOH-CH2SO3-

nepokretna faza neki ionski izmjenjiva (umreeni sintetski polimeri koji mogu izmjenjivati ione) sastojci smjese moraju takoer biti sposobni da izmjenjuju ione, odvajaju se na temelju svog razliitog afiniteta prema ionskoizmjenjivakoj nepokretnoj fazi za svaki ion, proces je karakteriziran odgovarajuom ionskoizmjenjivakom ravnoteom, koja odreuje raspodjelu izmeu pokretne i nepokretne faze za npr. anion A E-nepok + A-pok A-nepok + E-pok
AK nepok A Apok x Enepok x Epok

pokretna faza je puferska otopina kojoj se sastav moe kontinuirano mijenjati (gradijentna analiza) prikladna za spojeve s ioniziranim grupama (aminokiseline, nukleinska kiselina)

KROMATOGRAFIJA NA GELU ILI KROMATOGRAFIJA ISKLJUENJEM

kao nepokretna faza slui mikroporozni neionski prirodni ili sintetski polimer u njegove pore mogu potpuno ili djelomino ui samo molekule manje od neke odreene veliine dok se vee molekule ne zadravaju sastojci se redom eluiraju iz kolone ve prema veliini svojih molekula pokretna faza je umreeni polimer primjena u ienju i izolaciji supstancija iz prirodnih tvari, odreivanje raspodjele relativnih molekulskih teina prirodnih i sintetskih polimera izraz kromatografija iskljuenjem po veliini takoer se moe koristiti kada je odvajanje temeljeno na veliini molekula izrazi gel-filtracijska i gel-propusna kromatografija (GPC) su koriteni za opis procesa kada je nepokretna faza nabubreni gel izraz kromatografija iskljuenjem molekula specifino se koristi za odvajanje iona u vodenoj fazi

KOLONSKA KROMATOGRAFIJA Tiselius zaetnik kolonske kromatografije 1952. a) punjene kolone materijal: elik, staklo, teflon duljina: 2-3 m, unutarnji promjer: 2-4 mm punjenje: vrsti nosa (obino dijatomejska zemlja) na kojem je nanesen tanki sloj nepokretne (tekue) faze b) kapilarne kolone materijal: danas uglavnom kvarcno staklo duljina: 10-100 m, unutarnji promjer: 0.1 - 0.5 mm punjenje: unutarnje stjenke prevuene samo slojem tekue nepokretne faze ili nosaem na kojem se nalazi adsorbirana nepokretna faza

PAPIRNA KROMATOGRAFIJA

plona kromatografska metoda za njeno razvijanje zasluni Martin i R.L.M. Synge nepokretna faza list ili traka kromatografskog papira, a pokretna faza je tekuina uzorak se stavlja na papir u blizini njegova ruba i taj se rub papira uroni u tekuinu (pokretnu fazu) prolaskom tekuine kroz papir putuju zbog kapilarnih sila i razdvajaju se i sastojci ispitivanog uzorka prednosti: jednostavnost izvoenja, jednostavna i jeftina aparatura, velika mo razdvajanja, laka detekcija i mala koliina uzorka potrebna za analizu nedostatak: manje pogodna za kvantitativna odreivanja i za preparativne svrhe kromatografski papir skoro je ista celuloza s vrlo malo neistoa i mora: imati odreenu debljinu i poroznost i plonu masu (g/m2) biti jednoline strukture i debljine omoguavati kapilarno irenje tekuine odreenom brzinom kao pokretna faza upotrebljavaju se razliita organska otapala esto u smjesi s vodom, kiselinom ili luinom, moraju biti vrlo ista (pro chromatographia) prolaskom pokretne faze kroz podruje papira na kojem se nalazi ispitivana tvar raspodijelit e se ta tvar izmeu dviju faza tj. izmeu otapala i papira kao aparatura slue stakleni cilindri ili komore razliitih izvedbi koje se mogu hermetiki zatvoriti

Primjena papirne kromatografije: identifikacija supstancija ispitivanje istoe tvari

Osobine papirne kromatografije:

relativno brza metoda potrebna mala koliina materijala

TANKOSLOJNA KROMATOGRAFIJA

plona kromatografska metoda, vrlo slina papirnoj nepokretna faza tanki sloj finozrnatog (prakastog) materijala koji ima svojstvo sorpcije prednosti isti kao kod papirne, no tu je i vrijeme razvijanja krae, razdvajanje otrije, vea je mogunost detekcije, a zbog mogunosti upotrebe razliitih materijala za tanki sloj postoji vei izbor povoljnih uvjeta za razdvajanje razliitih vrsta spojeva kao tanki slojevi primjenjuju se razliiti sorbensi anorganski ( silikagel, aluminijev-oksid, dijatomejska zemlja ) organski ( celuloza, poliamidi, smole za izmjenu iona) sorbensi su karakterizirani svojom strukturom, veliinom estica, stupnjem vrstoe i prisutnim vezivom mehanizam je najee adsorpcijski, no moe biti i razdjelnim ionskoizmjenjivaki ili mehanizam na principu molekularnih sila prilikom priprave tankog sloja treba najprije pripraviti suspenziju sorbensa u vodi ili nekom organskom otapalu suspenzija homogenizirana mukanjem nanosi se na ploe koje slue kao nosioci (podloge) sloja sorbensa, ploe su staklene potpuno iste danas se najee kupuju gotove kromatografske podloge

kapilarnost - kapilarni protok fenomen je koji se javlja uglavnom u plonoj kromatografiji kao glavna vuna sila neeljena posljedica kapilarnoga protoka je smanjenje brzine pokretne faze s poveanjem puta otapala, to utjee na vrijeme separacije i smanjenje razluivosti

Za praktinu izvedbu kromatografskoga postupka potrebna je sljedea oprema:

kromatografske ploe, ureaj za nanoenje uzorka na kromatografsku podlogu, UV-lampa za tankoslojnu kromatografiju, komore za razvijanje kromatograma, prskalice za vizualizaciju kromatograma, suilo, termostatirani suionik ili topla ploa s regulatorom temperature, instrument za kvantifikaciju.

nanoenje uzorka na tanki sloj moe biti u obliku toke ili u obliku linije (vrpce)

Otapalo za uzorak: uzorak mora biti dobro topljiv male viskoznosti lako hlapljivo nakon nanaanja treba imati mo prodiranja u sloj sorbensa (zbog boljeg rasporeivanja uzorka) ne bi smjelo biti kromatografski pogodno za taj uzorak (RF < 0,1)

Oprema za tankoslojnu kromatografiju

nepokretna faza

pokretna faza

pojedinani uzorci

smjesa

43

prva je detekcija obino vizualna: promatranje kromatograma uz obino svjetlo ili pod UV-lampom pored vizualnog detektiranja mrlje se na kromatogramu mogu detektirati i instrumentima neki od naina vizualizacije: djelovanjem reagensa na razdvojeni spoj u mrlji pojavljuje se novi, obojeni spoj ili spoj koji fluorescira djelovanjem UV-zraenja

primjenom indikatora koji mijenja boju u prisutnosti ispitivanog spoja, odnosno postaje fluorescentan ili gubi fluorescenciju djelovanjem topline ili svjetla razdvojeni spoj daje karakteristino obojenje ili fluorescira pod UV-zraenjem

PLINSKA KROMATOGRAFIJA

primjenjuje se za analizu viekomponentnih plinskih i organskih smjesa pokretna faza je u plinovitom stanju, a nepokretna u vrstom ili tekuem ako se odjeljivanje provodi pomou krutog adsorbensa postupak se naziva plinska adsorpcijska kromatografija ako se primjeni tekui adsorbens govori se o plinsko-tekuinskoj razdjelnoj kromatografiji plinsku kromatografiju moemo primijeniti za odjeljivanje i analizu svake smjese u kojoj pojedine komponente smjese imaju kod radne temperature od -70oC do +400oC napon para vei od 133,322 Pa mogu se analizirati i vrste tvari koje se razgrauju pa se ispitivanje njihovih hlapivih produkata provodi tako da ona slui kao nepokretna faza, taj tip kromatografije se naziva obratna kromatografija

Pokretna faza: inertni plin koji eluira komponente smjese u koloni napunjenoj nepokretnom fazom za razliku od tekuinske kromatografije u plinskoj kromatografiji analit ne reagira s pokretnom fazom te zbog toga njegova brzina kretanja kroz kolonu ne ovisi o kemijskoj strukturi pokretne faze Nepokretna faza:

za odjeljivanje komponenti male molekulske mase: stacionarna faza je vrsta tvar velike specifine povrine na koju se adsorbiraju analizirane komponente = plinska adsorpcijska kromatografija za odjeljivanje komponenti velike molekulske mase: stacionarna faza je tekua faza nanesena na povrinu vrstog nosaa adsorpcijom ili kemijskim vezanjem = plinsko-tekuinskoj razdjelnoj kromatografiji

Nekoliko uobiajenih nepokretnih faza za plinsko-tekuinsku kromatografiju

Nepokretna faza max temp., C primjena Nepolarna faza openite namjene: ugljikovodici, polinuklearni aromati Metilni esteri masnih kiselina; alkaloidi, droge; halogeni spojevi Droge; steroidi; pesticidi; glikoli Klorirani aromati; nitroaromati; alkilsupstituirani benzeni Slobodne kiseline; alkoholi; eteri; esencijalna ulja; glikoli Nezasiene masne kiseline; kisele smole; slobodne kiseline; alkoholi

polidimetilsiloksan

350

5% fenilpolidimetilsiloksan

350

50% fenilpolidimetilsiloksan 50% trifluoropropilpolidimetilsiloksan

250 200

polietilenglikol

250

50% cijanpropilpolidimetilsiloksan

240

razdvajanje smjese koja mora biti u plinovitom stanju izvodi se u kromatografskoj koloni razliitom adsorpcijom pojedinih sastojaka na krutom adsorbensu ili selektivnim otapanjem u tekuini pri postupku eluiranja odreena koliina ispitivane smjese se unosi strujom inertnog plina (plin nosioc) u kromatografsku kolonu prolaenjem kroz kolonu smjesa se razdvaja izmeu nepokretne faze i struje plina nosioca sastojci smjese po izlasku iz kolone pomijeani su samo s plinom nosiocem ako je razlika u adsorpciji pojedinih komponenata dovoljno velika onda je i brzina putovanja toliko razliita da se u koloni stvaraju odvojeni slojevi sastojaka (odvojeni istim plinom nosiocem) ili vrpce odijeljeni sastojci smjese nakon izlaska iz kolone odreuju se u ureaju koji registrira prisutnost izeluiranog sastojka u struji plina nosioca kao funkciju vremena (detektor) odziv detektora registrira se kao kromatogram primjena metode unutarnjeg standarda!

Shema plinskog kromatografa

uzorak regulator protoka plina nosioca sustav za utrcavanje uzorka

signal procesor

detektor

termostat

kromatografska kolona boca s plinom nosiocem

osnovni dijelovi

uloga

boca za komprimirane plinove

sustav za utrcavanje uzorka

izvor plina nosioca

za unoenje uzorka u kolonu

kromatografska kolona termostat detektor

za razdvajanje komponenata ispitivane smjese za odravanje konstantne temperature (sobne < T < 400C) detektira komponente smjese istim redoslijedom kako one naputaju kolonu
za dobivanje trajnog dokumenta o pojavljivanju svake komponenti iz ispitivane smjese

pisa ili kompjuter

PLIN NOSILAC

mora biti inertan prema punilu u koloni i prema analiziranom uzorku viskoznost plina ne smije biti prevelika zbog poveanog tlaka u koloni i poveane molekulske difuzije izbor plina ovisi o nainu detekcije ako je detektor na osnovu plinske vodljivosti, plin mora imati razliitu toplinsku vodljivost od sastojaka; koriste se H2 ili He za ostale naine detekcije sastojaka koriste se N2 , Ar , CO2

SUSTAV ZA UTRCAVANJE UZORKA

treba brzo unijeti malu koliinu uzorka (do 20 L), kako bi se smanjilo irenje zone eluiranog sastojka tekui uzorci se unose najee kroz gumenu ili silikonsku membranu (septum) u zagrijani dio ureaja smjeten na vrhu kolone pomou mikrolitarske trcaljke mjesto unosa uzorka uglavnom je zagrijano 50C iznad temperature vrelita najmanje hlapljivog sastojka kako bi uzorak tijekom unoenja trenutno ispario plinoviti uzorci se unose pomou plinskih (dozirnih) ventila vrste uzorke unosimo nakon otapanja

KOLONE kapilarne ili punjenje

u obliku spirale, kruga, ili slova U punjene kolone su duljine 2-3 m, unutarnjeg promjera 2-4 nm; savijene u svitak promjera cca 15 cm punjene su metalne, staklene ili teflonske cijevi ispunjene odgovarajuim selektivnim adsorbensom (silikagel, zeolit, Al-oksid, aktivni ugljen, ) ili vrstim nosaem (diatomejska zemlja) na koji je nanesen tanki sloj nepokretne tekue faze kapilarne kolone mogu biti duljine i do 2000 m, unutarnjeg promjera do 0,3 mm (svjetski rekord za duljinu kapilarne kolone 1987.godine) kapilarne kolone su u poetku bile isto od metala ili teflona, ali danas se preferiraju one od izvuenog kvarca razdvajanje ovisi o duini i irini kolone (to je kolona dua to je razdvajanje bolje) kolona je uvijek termostatirana jer temperatura u njoj mora biti stalna i dovoljno visoka kako bi odjeljivane komponenate imale potreban napon para Kod plinske kromatografije vrlo je bitna temperatura te temperaturno programiranje koje ovisi o ispitivanoj smjesi

DETEKTORI

ureaji za indikaciju i mjerenje odvojenih frakcija u kromatografu moe sluiti svaki ureaj koji na osnovu nekog fizikalnog ili svojstva analita registrira njegovu prisutnost u plinu nosiocu komponente analiziranog uzorka odreuju se odmah po kolone, mjeri se promjena koncentracije komponenata u funkcija vremena eluiranja poeljna svojstva detektora:

plinskom kemijskog izlasku iz plinu kao

treba biti to osjetljiviji na sve plinove i pare stabilan prema promjenama p, T i protoka plina nosioca mora imati brz odziv jednolik odziv za mnoge kemijske spojeve ili bar predvidljiv i selektivan odziv za jednu vrstu ili vie spojeva linearno reagirati na promjenu koncentracije sastojaka u plinu nosiocu

stabilnost detektora se oituje na osnovnoj liniji (signal dobiven u prisutnosti istog plina nosioca) koja ne smije pokazivati porast ili oscilacije uz konstantne uvjete rada moemo ih podijeliti s obzirom na selektivnost prema odreenom tipu spojeva na univerzalne ili neselektivne i selektivne

detektor toplinske vodljivosti (katarometar)

neselektivan, izdrljiv u radu, jednostavne izvedbe i niske cijene temelji se na promjenama toplinske vodljivosti struje plina nosioca koja nastaje zbog prisutnosti analita osjetljivost ovisi o razlici toplinske vodljivosti analita i plina nosioca sastoje se od dva arena iana otpornika, niti (platina ili volfram) pod strujom stalne jakosti smjetene u elijama kroz koje protjee plin konstantnog protoka niti elije spojene su u Wheatstoneov most

kroz dvije elije, smjetene u mostu dijagonalno, protjee isti plin nosioc (referentna elija), a kroz druge dvije plin iz kromatografske kolone (mjerna elija) kada kroz sve etiri elije prolazi samo plin nosioc, most je u ravnotei; ulaskom jednog od analita u eliju ravnotea se poremeti = dobiveni signal se registrira temperatura i otpor uarene ice ovise o toplinskoj vodljivosti okolnog plina osjetljivost 10-8 g/mL osjetljivost detektora na toplinsku vodljivost moe se poveati upotrebom poluvodia

plameno-ionizacijski detektor
stabilan

prema promjenama protoka i temperaturi 10-15 g/mL

osjetljivost veliko

podruje linearnosti odziva se sastoji od malog plamenika u kojem izgara vodik

detektor radi

na principu ionizacije u vodikovom plamenu

s kolone mijea se s vodikom i zrakom i spaljuje

efluent

sastojci sagorijevaju u plamenu stvarajui ione i elektrone koji mogu provoditi elektricitet kroz plamen
organski

vrh plamenika dovodi se visoki elektrini potencijal, a iznad plamena postavljena je kolektorska elektroda
na mjeri

se elektrina struja izazvana pirolizom organskih sastojaka detektor osjetljiv je samo na

plameno-ionizacijski

spojeve koji imaju organski vezani C, dok na ostale spojeve nije osjetljiv
zato

se smatra selektivnim detektorom (osjetljiv je

toga se moe izravno koristiti za odreivanje

samo na odreenu vrstu spojeva)

zbog

oneienja zraka organskim tvarima

detektor apsorpcije elektrona

plin prelazi preko beta emitera (radioaktivni spoj koji emitira elektrone) kao to je 63Ni ili tricij adsorbiran na platinskoj ili titanovoj foliji emitirani elektroni ioniziraju plin nosioc (esto N2), ime nastaje snop elektrona kad u plinu nosiocu nisu prisutni organski spojevi, izmeu elektroda se pojavljuje stalna struja koja rezultira iz spomenute ionizacije odziv detektora apsorpcije elektrona selektivan je i osjetljiv na elektronegativne funkcionalne skupine kao to su halogeni, peroksidi, kinoni i nitro skupine neosjetljiv je na amine, alkohole i ugljikovodike pogodan je za detekciju i kvantitativno odreivanje kloriranih pesticida ne razara uzorak (za razliku od plamenoionizacijskog detektora)

Preporuena literatura
1. M. Katelan-Macan, Kemijska analiza u sustavu kvalitete, kolska knjiga, Zagreb 2003. 2. M. Katelan-Macan, M. Medi-ari, S. Turina, Plona kromatografija, Farmaceutsko-biokemijski fakultet Sveuilita u Zagrebu, Zagreb, 2006. 3. D. Skoog, D. A. West, F. J. Holler, Osnove analitike kemije, kolska knjiga, Zagreb 1999.