Introduccin Un microscopio simple (de un lente o varios lentes), es un instrumento que amplifica una imagen y permite la observacin de mayores

detalles de los posibles a simple vista. El microscopio ms simple es una lente de aumento o un par de anteojos. El poder de resolucin del ojo humano es de 0,2 mm es decir que para ver dos objetos separados estos deben estar como mnimo a esa distancia. El microscopio aumenta la imagen hasta el nivel de la retina, para captar la informacin. La resolucin depende de la longitud de onda de la fuente luminosa, el espesor del espcimen, la calidad de la fijacin y la intensidad de la coloracin. Tericamente la mxima resolucin que se puede alcanzar es de 0,2 um dada por una luz con longitud de onda de 540 nm, la cual pasa por un filtro verde (muy sensible por el ojo humano) y con objetos condensadores adecuados. El ocular aumenta la imagen producida por el objetivo, pero no puede aumentar la resolucin. Existen distintos microscopios pticos generales y de investigacin que se diferencian en factores tales como la longitud de onda de la iluminacin del espcimen, la alteracin fsica de la luz que incide en la muestra y procesos analticos que se aplican a la imagen final. Tipos de microscopios Microscopio de campo claro Es descendiente de los disponibles a partir de 1800. Compuestos por: Fuente luminosa que ilumina la muestra Condensador que enfoca los rayos de luz sobre la muestra Platina sobre la cual se coloca la muestra Objetivo que recibe la luz que atraves la muestra Ocular que recibe directamente la imagen formada por el objetivo La muestra a observar debe ser fina para que pueda ser atravesada por la luz. Con este tipo de microscopio se deben utilizar mtodos de tincin porque el campo claro de este no produce un nivel til de contraste. Microscopio de contraste de fase Permite observar clulas sin colorear y resulta especialmente til para clulas vivas. Este aprovecha las pequeas diferencias de los ndices de refraccin en las distintas partes de una clula y en distintas partes de una muestra de tejido. La luz que pasa por regiones de mayor ndice de refraccin experimenta una deflexin y queda fuera de fase con respecto al haz principal de ondas de luz que pasaron la muestra. Aparea otras longitudes de onda fuera de fase por medio de una serie de anillos pticos del objetivo y del condensador, anula la amplitud de la porcin fuera de fase inicial del haz de luz y produce un contraste til sobre la imagen. Las partes oscuras de la imagen corresponden a las porciones densas del espcimen; las partes claras de la imagen corresponden a porciones menos densas. Por lo tanto estos microscopios se utilizan para observar clulas vivas, tejidos vivos y cortes semifinos no coloreados. Dos modificaciones del microscopio de fase son el microscopio de interferencia y el microscopio de interferencia diferencial. Microscopio de campo oscuro El objetivo recibe la luz dispersa o refractada por las estructuras del espcimen. Para lograrlo, el microscopio de campo oscuro est equipado con un condensador especial que ilumina la muestra con luz fuerte indirecta. En

consecuencia el campo visual se observa como un fondo oscuro sobre el cual aparecen pequeas partculas brillantes de la muestra que reflejan parte de la luz hacia el objetivo. El efecto es similar a las partculas de polvo que se ven en el haz de luz emanado de un proyector de diapositivas en una habitacin oscura. La luz reflejada por las partculas de polvo llegan hasta la retina del ojo y las hacen visibles. La resolucin de este microscopio no puede ser mejor que la del microscopio de campo oscuro porque emplea la misma fuente de longitud de onda, sin embargo puede detectar partculas individuales ms pequeas en las imgenes de campo oscuro, debido al contraste creado. Es til para observar autorradiografas, cristales en la orina y para detectar espiroquetas en particular el Treponema pallidum microorganismo causante de la sfilis. Microscopio de fluorescencia Una molcula que fluorece emite luz de longitud de onda que se encuentra dentro del espectro visible, cuando es expuesta a una fuente de luz ultravioleta. Se usa para revelar molculas fluorescentes naturales, como la vitamina A y algunos neurotransmisores. Al ser escasas las molculas autofluorecentes su aplicacin ms difundida es para revelar una fluorescencia agregada, como en la deteccin de antgenos o anticuerpos en procedimientos de coloracin inmunocitoqumica. Tambin se puede inyectar molculas fluorescentes especficas en un animal o directamente en clulas y usarlas como marcadores. Estos mtodos sirvieron para estudiar uniones intercelulares, trayectorias de las fibras nerviosas en neurobiologa y en deteccin de marcadores del crecimiento fluorescentes en tejidos mineralizados. Se insertan distintos filtros entre la fuente de luz ultravioleta y la muestra para producir luz monocromtica o casi monocromtica, o entre el espcimen y el objetivo permitiendo que la estrecha banda de longitudes de onda de fluorescencia llegue hasta el ojo o incida en una emulacin fotogrfica u otro procedimiento analtico. Microscopio de barrido confocal Se usa para estudiar la estructura de los materiales biolgicos. Emplea un sistema de iluminacin con rayo lser que es muy convergente y, en consecuencia produce un punto de barrido muy poco profundo. La luz que emerge del punto es dirigida a un tubo fotomultiplicador, donde es analizada. Se utiliza un sistema de espejos para mover el rayo lser a travs del espcimen, iluminando un solo punto por vez. Se registran los datos de cada punto de la muestra recorrida con este rayo mvil y se guardan en una computadora. Luego se puede llevar la imagen a un monitor de alta resolucin. Este mtodo tiene la ventaja de que se pueden tomar imgenes de la muestra en cortes muy finos. Las regiones fuera de foco se restan de la imagen mediante un programa para dar una definicin mxima a la imagen. Es posible tambin crear imgenes mltiples a diferentes profundidades dentro del espcimen y realizar reconstrucciones tridimensionales. Microscopio de luz ultravioleta La imagen en el microscopio de luz ultravioleta depende de la absorcin de esa luz por las molculas de la muestra. La fuente de luz ultravioleta tiene una longitud de onda de 200 nm, por lo tanto puede alcanzar una resolucin de 0,1 um. La microscopia ultravioleta no es muy diferente del funcionamiento de un espectrofotmetro pero sus resultados son registrados en fotografas. La muestra no se puede observar directamente a travs del ocular porque la luz ultravioleta puede daar la retina. El mtodo sirve para detectar cidos nucleicos, protenas que contienen determinados aminocidos. Mediante longitudes de ondas especficas para la iluminacin se puede obtener mediciones espectrofotomtricas para cuntificar el DNA y el RNA de cada clula. Microscopio de polarizacin Este microscopio es una simple modificacin del microscopio ptico, contiene un filtro polarizante llamado polarizador entre la fuente de

luz y la muestra y se ubica un segundo polarizador, denominado analizador entre el objetivo y el observador. Se puede rotar el polarizador y el analizador; la diferencia entre sus ngulos de rotacin se usa para determinar el grado en que una estructura afecta el haz de luz polarizada. La capacidad que tiene un cristal o estructura cristalina de rotar el plano de la luz polarizada se denomina birrefringencia. Exhiben birrefringencia el msculo estriado o esqueltico y las inclusiones cristaloides de las clulas intersticiales testiculares. Microscopia electrnica Dentro de los microscopios electrnico tenemos el de barrido y el de transmisin. La ventaja de los microscopios electrnicos frente a los pticos esta en que la longitud de onda del haz de luz es aproximadamente 1/200, lo cual aumenta la resolucin. Microscopio electrnico de transmisin La ptica es muy similar al ptico pero se diferencia en que usa un haz de electrones en vez de un haz de luz visible. Este microscopio se basa en los siguientes principios: - Una fuente, un filamento de tungsteno calentado que emite electrones (ctodo) Un nodo, hacia el cual son atrados los electrones Una diferencia de potencial entre el ctodo y el nodo imparte un voltaje de aceleracin entre 20.000 y 200.000 voltios a los electrones, que crea la haz El haz pasa por una serie de electroimanes que tienen las mismas funciones que las lentes de vidrio de un microscopio ptico El condensador forma el haz y modifica el dimetro del haz que incide en el plano del espcimen. El haz que atraviesa la muestra se coloca en foco y se aumenta por medio de un objetivo y se aumenta aun ms con una o ms lentes proyectoras. La imagen final se visualiza sobre una planilla cubierta por fsforo. Las porciones de la muestra que han sido atravesadas por los electrones aparecen brillantes, las porciones que absorvieron o esparcieron los electrones por su densidad inherente o debido al agregado de metales pesados durante la preparacin del espcimen aparecen oscuras. Se coloca una placa fotogrfica o un detector de video por encima o por debajo de la pantalla del visor, con la finalidad de obtener un registro permanente de la imagen sobre la pantalla. Las muestras se preparan sobre la misma base que la del microscopio ptico pero requieren mtodos ms finos. Los preparados la restriccin que tienen es que en cada paso se trabaja con especimenes de magnitud 3-4 rdenes menores o ms finos que los utilizados para el microscopio ptico. Debido a la gran resolucin de estos microscopios electrnicos la calidad de la fijacin, es decir el grado de preservacin de la estructura subcelular debe ser la mejor posible. La preparacin de rutina de los especimenes para la microscopia electrnica de transmisin comienza con la fijacin con glutaraldehdo, seguida de un lavado con un buffer y de una fijacin con tetrxido de osmio. Por lo general, se fijan para el microscopio electrnico de transmisin piezas de tejido no mayores de 1 mm3 El proceso de deshidratacin es idntico al empleado en la microscopia ptica El tejido incluido en material plstico se secciona por medio de micrtomos especialmente diseados, que usan cuchillas de diamante. Debido al limitado poder de penetracin de los electrones, el espesor de los cortes preparados para el microscopio electrnico de transmisin varia entre 50 nm y 150 nm. Estos cortes son demasiado finos para poder ser manipulados; se los hace flotar desde el filo de la cuchilla en la superficie de una bandeja llena de lquido, se recuperan y se colocan en rejillas de malla de cobre recubiertas por plstico. Estas rejillas tienen 50-400

orificios por pulgada o hendiduras especiales para observar cortes seriados. Por lo general, la coloracin de los cortes para microscopio electrnico de transmisin se realiza por medio del agregado a la muestra de materiales de elevada densidad, tales como iones de metales pesados. Estos iones de metales pesados se unen a los tejidos durante la fijacin o la deshidratacin o al sumergir las muestras en soluciones de tales iones despus del corte. El terxido de osmio que se emplea de rutina en el fijador se une a los componentes fosfolipdicos de las membranas, lo cual agraga densidad a la membrana. A menudo se agrega nitrato de uranilo a las soluciones alcohlicas usadas en la deshidratacin, con el fin de agregar densidad a los componentes de las uniones celulares y a otros sitios. La inmersin secuencial en soluciones de acetato de uranilo y citrato de plomo se usa rutinariamente para teir los cortes antes de observarlos con microscopio electrnico de transmisin. La congelacin-fractura es un mtodo especial de preparacin de la muestra para microscopia electrnica de transmisin, de gran importancia en el estudio de membranas. El material a examinar puede estar fijado o no; en el primer caso se elimina el fijador del tejido por medio de lavados, antes de procesarlo. Se infiltra el tejido con un crioprotector, como el glicerol y se congela rpidamente a unos 160 grados centgrados. Microscopio electrnico de barrido Se asemeja ms que al microscopio electrnico de transmisin a los tubos de televisin de donde deriva la microscopia electrnica. Para analizar la mayora de los tejidos se deja la muestra, se deshidrata por desecacin de punto crtico, se cubre con una pelcula evaporada de oro-carbn, se monta en un taco de aluminio y se coloca en la cmara de muestras del microscopio. En los tejidos mineralizados es posible eliminar todos los tejidos blandos con una leja y analizar las caractersticas estructurales del mineral. Se logra el barrido con el mismo tipo de rastreo que explora el haz de electrones a travs de la superficie un tubo de televisin. Los electrones reflejados desde la superficie y los electrones forzados hacia el exterior de la superficie son captados por uno o ms detectores y reprocesados para formar una imagen tridimensional en un televisin. Se pueden tomar fotografas para registrar los datos o la imagen en una cinta de video. Se pueden usar otros detectores para medir los rayos X emitidos desde la superficie, la catodoluminiscencia de las molculas del tejido por debajo de la superficie y los electrones de Auger emitidos en la superficie. Muchos microscopios combinan las caractersticas de un microscopio electrnico de transmisin y de barrido, el cual permite microanlisis por rayos X con sonda electrnica. Se pueden adosar detectores al microscopio para reunir los rayos X emitidos cuando el haz de bombardea el corte histolgico, y mediante analizadores apropiados se construye un mapa que muestra la distribucin en los cortes de los elementos que tienen nmero atmico mayor de 12, en concentracin suficiente para producir rayos X en cantidad tal que se pueda analizar.

El microscopio

Microscopio, cualquiera de los distintos tipos de instrumentos que se utilizan para obtener una imagen aumentada de objetos minsculos o detalles muy pequeos de los mismos. Microscopio ptico El tipo de microscopio ms utilizado es el microscopio ptico, que se sirve de la luz visible para crear una imagen aumentada del objeto. El microscopio ptico ms simple es la lente convexa doble con una distancia focal corta. Estas lentes pueden aumentar un objeto hasta 15 veces. Por lo general se utilizan microscopios compuestos, que disponen de varias lentes con las que se consiguen aumentos mayores. Algunos microscopios pticos pueden aumentar un objeto por encima de las 2.000 veces. El microscopio compuesto consiste en dos sistemas de lentes, el objetivo y el ocular, montados en extremos opuestos de un tubo cerrado. El objetivo est compuesto de varias lentes que crean una imagen real aumentada del objeto examinado. Las lentes de los microscopios estn dispuestas de forma que el objetivo se encuentre en el punto focal del ocular. Cuando se mira a travs del ocular se ve una imagen virtual aumentada de la imagen real. El aumento total del microscopio depende de las longitudes focales de los dos sistemas de lentes. El equipamiento adicional de un microscopio consta de un armazn con un soporte que sostiene el material examinado y de un mecanismo que permite acercar y alejar el tubo para enfocar la muestra. Los especmenes o muestras que se examinan con un microscopio son transparentes y se observan con una luz que los atraviesa, y se suelen colocar sobre un rectngulo fino de vidrio. El soporte tiene un orificio por el que pasa la luz. Bajo el soporte se encuentra un espejo que refleja la luz para que atraviese el espcimen. El microscopio puede contar con una fuente de luz elctrica que dirige la luz a travs de la muestra. La fotomicrografa, que consiste en fotografiar objetos a travs de un microscopio, utiliza una cmara montada por encima del ocular del microscopio. La cmara suele carecer de objetivo, ya que el microscopio acta como tal. El trmino microfotografa, utilizado a veces en lugar de fotomicrografa, se refiere a una tcnica de duplicacin y reduccin de fotografas y documentos a un tamao minsculo para guardarlos en un archivo. Los microscopios que se utilizan en entornos cientficos cuentan con varias mejoras que permiten un estudio integral del espcimen. Dado que la imagen de la muestra est ampliada muchas veces e invertida, es difcil moverla de forma manual. Por ello los soportes de los microscopios cientficos de alta potencia estn montados en una plataforma que puede moverse con tornillos micromtricos. Algunos microscopios cuentan con soportes giratorios. Todos los microscopios de investigacin cuentan con tres o ms objetivos montados en un cabezal mvil que permite variar la potencia de aumento.

Microscopios pticos especiales Hay diversos microscopios pticos para funciones especiales. Uno de ellos es el microscopio estereoscpico, que no es sino un par de microscopios de baja potencia colocados de forma que convergen en el espcimen. Estos instrumentos producen una imagen tridimensional. El microscopio de luz ultravioleta utiliza el rango ultravioleta del espectro luminoso en lugar del rango visible, bien para aumentar la resolucin con una longitud de onda menor o para mejorar el detalle absorbiendo selectivamente distintas longitudes de onda de la banda ultravioleta. Dado que el vidrio no transmite las longitudes de onda ms cortas de la luz ultravioleta, los elementos pticos de estos microscopios estn hechos con cuarzo, fluorita o sistemas de espejos aluminizados. Adems, dado que la radiacin ultravioleta es invisible, la imagen se muestra con fosforescencia (vase Luminiscencia), en fotografa o con un escner electrnico. El microscopio de luz ultravioleta se utiliza en la investigacin cientfica. El microscopio petrogrfico o de polarizacin se utiliza para identificar y estimar cuantitativamente los componentes minerales de las rocas gneas y las rocas metamrficas. Cuenta con un prisma de Nicol u otro tipo de dispositivo para polarizar la luz que pasa a travs del espcimen examinado (vase ptica: Polarizacin de la luz). Otro prisma Nicol o analizador determina la polarizacin de la luz que ha pasado a travs del espcimen. El microscopio tiene un soporte giratorio que indica el cambio de polarizacin acusado por el espcimen. El microscopio en campo oscuro utiliza una luz muy intensa en forma de un cono hueco concentrado sobre el espcimen. El campo de visin del objetivo se encuentra en la zona hueca del cono de luz y slo recoge la luz que se refleja en el objeto. Por ello las porciones claras del espcimen aparecen como un fondo oscuro y los objetos minsculos que se estn analizando aparecen como una luz brillante sobre el fondo. Esta forma de iluminacin se utiliza para analizar elementos biolgicos transparentes y sin manchas, invisibles con iluminacin normal. El microscopio de fase ilumina el espcimen con un cono hueco de luz, como en el microscopio en campo oscuro. Sin embargo en el microscopio de fase el cono de luz es ms estrecho y entra en el campo de visin del objetivo, que contiene un dispositivo en forma de anillo que reduce la intensidad de la luz y provoca un cambio de fase de un cuarto de la longitud de onda. Este tipo de iluminacin provoca variaciones minsculas en el ndice de refraccin de un espcimen transparente, hacindolo visible. Este tipo de microscopio es muy til a la hora de examinar tejidos vivos, por lo que se utiliza con frecuencia en biologa y medicina. Entre los microscopios avanzados se encuentran el microscopio de campo cercano, con el que pueden verse detalles algo menores a la longitud de onda de la luz. Se hace pasar un haz de luz a travs de un orificio diminuto y se proyecta a travs del espcimen a una distancia equivalente a la mitad del dimetro del orificio, formando una imagen completa. Microscopio electrnico La potencia amplificadora de un microscopio ptico est limitada por la longitud de onda de la luz visible. El microscopio electrnico utiliza electrones para iluminar un objeto. Dado que los electrones tienen una longitud de onda mucho menor que la de la luz pueden mostrar estructuras mucho ms pequeas. La longitud de onda ms corta de la luz visible es de alrededor de 4.000 ngstroms (1 ngstrom es 0,0000000001 metros). La longitud de onda de los electrones que se utilizan en los microscopios electrnicos es de alrededor de 0,5 ngstroms.

Todos los microscopios electrnicos cuentan con varios elementos bsicos. Disponen de un can de electrones que emite los electrones que chocan contra el espcimen, creando una imagen aumentada. Se utilizan lentes magnticas para crear campos que dirigen y enfocan el haz de electrones, ya que las lentes convencionales utilizadas en los microscopios pticos no funcionan con los electrones. El sistema de vaco es una parte relevante del microscopio electrnico. Los electrones pueden ser desviados por las molculas del aire, de forma que tiene que hacerse un vaco casi total en el interior de un microscopio de estas caractersticas. Por ltimo, todos los microscopios electrnicos cuentan con un sistema que registra o muestra la imagen que producen los electrones. Hay dos tipos bsicos de microscopios electrnicos: el microscopio electrnico de transmisin (Transmission Electron Microscope, TEM) y el microscopio electrnico de barrido (Scanning Electron Microscope, SEM). Un TEM dirige el haz de electrones hacia el objeto que se desea aumentar. Una parte de los electrones rebotan o son absorbidos por el objeto y otros lo atraviesan formando una imagen aumentada del espcimen. Para utilizar un TEM debe cortarse la muestra en capas finas, no mayores de un par de miles de ngstroms. Se coloca una placa fotogrfica o una pantalla fluorescente detrs del objeto para registrar la imagen aumentada. Los microscopios electrnicos de transmisin pueden aumentar un objeto hasta un milln de veces. Un microscopio electrnico de barrido crea una imagen ampliada de la superficie de un objeto. No es necesario cortar el objeto en capas para observarlo con un SEM, sino que puede colocarse en el microscopio con muy pocos preparativos. El SEM explora la superficie de la imagen punto por punto, al contrario que el TEM, que examina una gran parte de la muestra cada vez. Su funcionamiento se basa en recorrer la muestra con un haz muy concentrado de electrones, de forma parecida al barrido de un haz de electrones por la pantalla de una televisin. Los electrones del haz pueden dispersarse de la muestra o provocar la aparicin de electrones secundarios. Los electrones perdidos y los secundarios son recogidos y contados por un dispositivo electrnico situado a los lados del espcimen. Cada punto ledo de la muestra corresponde a un pxel en un monitor de televisin. Cuanto mayor sea el nmero de electrones contados por el dispositivo, mayor ser el brillo del pxel en la pantalla. A medida que el haz de electrones barre la muestra, se presenta toda la imagen de la misma en el monitor. Los microscopios electrnicos de barrido pueden ampliar los objetos 100.000 veces o ms. Este tipo de microscopio es muy til porque, al contrario que los TEM o los microscopios pticos, produce imgenes tridimensionales realistas de la superficie del objeto. Se han desarrollado otros tipos de microscopios electrnicos. Un microscopio electrnico de barrido y transmisin (Scanning Trasnmission Electron Microscope, STEM) combina los elementos de un SEM y un TEM, y puede mostrar los tomos individuales de un objeto. El microanalizador de sonda de electrones, un microscopio electrnico que cuenta con un analizador de espectro de rayos X, puede analizar los rayos X de alta energa que produce el objeto al ser bombardeado con electrones. Dado que la identidad de los diferentes tomos y molculas de un material se puede conocer utilizando sus emisiones de rayos X, los analizadores de sonda de electrones no slo proporcionan una imagen ampliada de la muestra, como hace un microscopio electrnico, sino que suministra tambin informacin sobre la composicin qumica del material. Microscopio de sonda de barrido En los microscopios de sonda de barrido se utiliza una sonda que recorre la superficie de una muestra, proporcionando una imagen tridimensional de la red de tomos o molculas que la componen. La sonda es una afilada punta de metal que puede tener un grosor de un solo tomo en su extremo. Un tipo importante de microscopio de sonda de barrido es el microscopio de tnel de barrido (siglas en ingls de Scanning Tunelling Microscope,

STM) desarrollado en 1981. Este microscopio utiliza un fenmeno de la fsica cuntica, denominado efecto tnel, para proporcionar imgenes detalladas de sustancias conductoras de electricidad. La sonda se coloca a una distancia de pocos ngstroms de la superficie del material y se aplica un voltaje pequeo entre la superficie y la sonda. A causa de la poca distancia entre el material y la sonda algunos electrones se escapan a travs del hueco, generando una corriente. La magnitud de la corriente del efecto tnel depende de la distancia entre la superficie y la sonda. El flujo de corriente es mayor cuando la sonda se acerca al material y disminuye cuando se aleja. A medida que el mecanismo de barrido mueve la sonda por encima de la superficie, se ajusta de modo automtico la altura de la sonda para mantener constante la corriente del efecto tnel. Estos ajustes minsculos permiten dibujar las ondulaciones de la superficie. Despus de muchas pasadas hacia adelante y hacia atrs se utiliza una computadora para crear una representacin tridimensional del material. Otro tipo de microscopio de sonda de barrido es el microscopio de fuerza atmica (Atomic Force Microscope, AFM), que no emplea la corriente de efecto tnel y que por lo tanto puede utilizarse tambin en materiales no conductores. A medida que la sonda se mueve a lo largo de la superficie de la muestra los electrones de la sonda de metal son repelidos por las nubes electrnicas de los tomos de la misma. La altura de la sonda se ajusta de modo automtico para mantener constante la fuerza recibida. Un sensor registra el movimiento ascendente y descendente de la sonda y entrega la informacin a una computadora, que a su vez la utiliza para dibujar una imagen tridimensional de la superficie del espcimen. Ocular (Ocular): Qu el utilizador mira a travs para examinar el espcimen. La potencia del ocular multiplicada por la potencia objetiva iguala la ampliacin total (es decir 10X objetivo 10X del ocular X = 100X. El espcimen se ha agrandado 100 veces). CUERPO: El microscopio puede venir como un monocular, (un ocular y tubo), o binocular, (dos oculares y tubos). Si es un binocular generalmente solamente un tubo del ocular ser ajustable mientras que el otro es fijo. OBJETIVOS: El objetivo es la lente ms importante del microscopio para producir una imagen clara de la alta resolucin. El objetivo tiene varias funciones importantes. Debe recolectar la luz que viene de cada uno de las varias partes o puntas del espcimen. Debe tener la capacidad de reconstituir la luz que viene de las varias puntas del espcimen en las varias puntas correspondientes de la imagen. El objetivo se debe construir de modo que sea enfocado cerca bastante al espcimen para proyectar una imagen magnificada, verdadera para arriba en el tubo del cuerpo. ETAPA MECNICA: Un dispositivo para llevar a cabo diapositivas con seguridad con las perillas con estras separadas para mover la diapositiva desde frente a la parte posteriora (norte y al sur) o de lado a lado (este y al oeste). Estas perillas pueden estar en los ejes separados o en un eje coaxial. Pueden enderezar o zurdo. CONDENSADOR DEL SUB-STAGE: Se cabe debajo entre de la etapa del microscopio, la lmpara que ilumina y el espcimen. La abertura del condensador y el enfocarse apropiado del condensador son de importancia crtica en realizar la capacidad mxima de la lente objetiva en uso. Asimismo, el uso apropiado del diafragma ajustable del diafragma de la abertura (incorporado en el condensador) es tambin importante para asegurar la iluminacin apropiada y contraste. La apertura y el cierre del diafragma del diafragma controla el ngulo de los rayos de la

iluminacin que pasan a travs del condensador, a travs del espcimen y entonces en la lente objetiva. CONTROLES DEL FOCO DE FINE/COARSE: En ambas caras del soporte del microscopio hay dos conjuntos de perillas del ajuste. La perilla del ajuste aproximado para movimientos que se enfocan incrementales ms grandes y la perilla del ajuste fino para movimientos que se enfocan incrementales ms pequeos. Las perillas del ajuste sirven para traer el objetivo y el espcimen ms cercano juntas o para engendrar aparte. En la mayora de los microscopios las perillas del ajuste levantan o bajan la etapa; en algunos microscopios las perillas levantan o bajan el tubo el microscopio o el pedazo de la nariz. Iluminador (Estndar): Esta parte proporciona a la iluminacin requerida para realizar cualquier funcin con el microscopio. Es bsicamente una fuente de alimentacin electrnica que proporciona a electricidad a la fuente de la lmpara. Esta fuente de la lmpara poda ser una lmpara estndar del tungsteno o lmpara del halgeno. **time-out** ventaja halgeno tipo lmpara ser ms luz para publicar salida vatiaje y en bajo nivel iluminacin luz no tender para dar vuelta amarillo a medida que estndar tungsteno lmpara hacer. Cubierta Del Iluminador (Estndar): Aqu es adonde el elemento electrnico asociado al iluminador se pone. Algunos microscopios ms viejos tienen transformadores separados del control y el nico interior de la cubierta es la lmpara, ensamblaje del socket, condensador del campo y el diafragma del diafragma del campo. DIAFRAGMA DEL CAMPO CONDENSER/IRIS: Esta pieza del microscopio contiene la lente de condensador de la lmpara y el diafragma del diafragma del campo. Este diafragma controla el rea del crculo de la luz que ilumina el espcimen. Microscopio El microscopio es un instrumento que permite observar objetos que son demasiado pequeos para ser vistos a simple vista. El tipo ms comn de microscopio y el primero que se invent es el microscopio ptico. Se trata de un instrumento ptico que contiene una o varias lentes que permiten obtener una imagen aumentada del objeto y que funciona por refraccin. La ciencia que investiga los objetos pequeos utilizando este instrumento se llama microscopa. Historia Vase la cronologa del desarrollo del microscopio. Tipos de microscopios Microscopios pticos microscopio simple microscopio compuesto Microscopios pticos especiales microscopio de luz ultravioleta microscopio petrogrfico microscopio en campo oscuro microscopio de fase Microscopios electrnicos microscopio electrnico de transmisin microscopio electrnico de barrido

Microscopios de sonda de barrido microscopio de efecto tnel microscopio de fuerza atmica Otros microscopios microscopio virtual Instrumentos relacionados Telescopio Microscopio ptico Un microscopio ptico es un microscopio basado en lentes pticas. El desarrollo de este aparato suele asociarse con los trabajos de Anton van Leeuwenhoek. Microscopio simple Los microscopios de Leeuwenhoek constaban de una sola lente pequea y convexa montada sobre un plancha con un mecanismo para sujetar el material que se se iba a examinar (la muestra o especimen). Este uso de una nica lente convexa se conoce como microscopio simple, en el que se incluye la lupa, entre otros aparatos pticos. Microscopio compuesto El diagrama siguiente muestra un microscopio compuesto. En su forma ms simple, como la que utiliz Robert Hooke, tiene una sola lente de cristal de distancia focal corta para el objetivo, y otra nica lente de cristal para el ocular.

ocular revlver objetivo mecanismo de enfoque platina espejo condensador

Principales elementos de un microscopio bsico Los microscopios de este tipo suelen ser ms complejos, con varias lentes tanto en el objetivo como en el ocular. El objetivo de stas lentes es el de reducir las aberraciones, concretamente la aberracin cromtica y la aberracin esfrica. En los microscopios modernos, el espejo se sustituye por una lmpara que ofrece una iluminacin estable y controlable. Los microscopios compuestos se utilizan para estudiar especmenes delgados, puesto que su profundidad de campo es muy limitada. Por lo general, se utilizan para examinar cultivos, preparaciones trituradas o una lmina muy fina del material que sea. Normalmente depende de la luz que atraviese la muestra desde abajo y usualmente son necesarias tcnicas especiales para aumentar el contraste de la imagen.

La resolucin de los microscopios pticos est restringida por un fenmeno llamado difraccin que, dependiendo de la apertura numrica (AN o AN) del sistema ptico y la longitud de onda de la luz utilizada (), establece un lmite definido (d) a la resolucin ptica. Suponiendo que las aberraciones pticas fueran despreciables, la resolucin sera:

Normalmente, se supone una de 550 nm, correspondiente a la luz verde. Si el medio es el aire, la AN prctica mxima es de 0,95, y en el caso de aceite de hasta 1,5. Ello implica que, incluso el mejor microscopio ptico est limitado a una resolucin de unos 0,2 micrmetros. 0=Microscopio binocular=0 El diseo de este instrumento es distinto al del diagrama de ms arriba y su utilidad es ligeramente diferente. Utiliza dos oculares (a veces, dos microscopios) con la intencin de ofrecer ngulos de visin ligeramente diferentes a los ojos izquierdo y derecho. De esta forma se produce una visualizacin tridimensional (3D) de la muestra examinada. El microscopio binocular se utiliza para estudiar las superficies de especmenes slidos,comnmente Microscopio de luz ultravioleta Microscopio de Luz ultravioleta: La lente, que habitualmente es de vidrio es sustituida por lentes de cuarzo y la iluminacin se produce por unas lamparas de mercurio. no usa filtros y se observa en placas fotograficas. La variedad de fluorescencia, si usa filtros, y la observacion es directa. Microscopio petrogrfico

El microscopio petrogrfico o de polarizacin se utiliza para identificar y estimar cuantitativamente los componentes minerales de las rocas gneas y las rocas metamrficas. Cuenta con un prisma de Nicol u otro tipo de dispositivo para polarizar la luz que pasa a travs del espcimen examinado (vase ptica: Polarizacin de la luz). Otro prisma Nicol o analizador determina la polarizacin de la luz que ha pasado a travs del espcimen. El microscopio tiene un soporte giratorio que indica el cambio de polarizacin acusado por el espcimen. Microscopio de campo oscuro El microscopio de campo oscuro utiliza una luz muy intensa en forma de un cono hueco concentrado sobre el espcimen. El campo de visin del objetivo se encuentra en la zona hueca del cono de luz y slo recoge la luz que se refleja en el objeto. Por ello las porciones claras del espcimen aparecen como un fondo oscuro y los objetos minsculos que se estn analizando aparecen como una luz brillante sobre el fondo. Esta forma de iluminacin se utiliza para analizar elementos biolgicos transparentes y sin manchas, invisibles con iluminacin normal. El objetivo recibe la luz dispersa o refractada por las estructuras del espcimen. Para lograrlo, el microscopio de campo oscuro est equipado con un condensador especial que ilumina la muestra con luz fuerte indirecta. En consecuencia el campo visual se observa como un fondo oscuro sobre el cual aparecen pequeas partculas brillantes de la muestra que reflejan parte de la luz hacia el objetivo. El efecto es similar a las partculas de polvo que se ven en el haz de luz emanado de un proyector de diapositivas en una habitacin

oscura. La luz reflejada por las partculas de polvo llegan hasta la retina del ojo y las hacen visibles. Microscopio de fase, se utiliza cuando se necesitan ver objetos incoloros. Si la amplitud de la luz que incide apenas cambia, se obtiene un contraste muy malo. Se usa entonces una iluminacin por varios sitios y se miden diferencias de fase para poder "ver" el objeto. Microscopio electrnico Microscopio diseado por Ernst Ruska y Max Knoll entre 1925 y 1930. Se basaron en los estudios de Louis-Victor de Broglie acerca de las propiedades ondulatorias de los electrones. Microscopio electrnico de transmisin Microscopio electrnico de barrido Microscopio electrnico de transmisin Un microscopio electrnico de transmisin es un microscopio que utiliza un haz de electrones para visualizar un objeto debido a que la potencia amplificadora de un microscopio ptico est limitada por la longitud de onda de la luz visible. Debido a que los electrones tienen una longitud de onda mucho menor que la de la luz pueden mostrar estructuras mucho ms pequeas. Las partes principales de un microscopio electrnico son: Can de electrones, que emite los electrones que chocan contra el espcimen, creando una imagen aumentada. Lentes magnticas para crear campos que dirigen y enfocan el haz de electrones, ya que las lentes convencionales utilizadas en los microscopios pticos no funcionan con los electrones. Sistema de vaco es una parte muy importante del microscopio electrnico. Debido a que los electrones pueden ser desviados por las molculas del aire, se debe hacer un vaco casi total en el interior de un microscopio de estas caractersticas. Placa fotogrfica o pantalla fluorescente que se coloca detrs del objeto a visualizar para registrar la imagen aumentada. Sistema de registro que muestra la imagen que producen los electrones, que suele ser una computadora. El microscopio electrnico de transmisin emite un haz de electrones dirigido hacia el objeto que se desea aumentar. Una parte de los electrones rebotan o son absorbidos por el objeto y otros lo atraviesan formando una imagen aumentada de la muestra. Para utilizar un microscopio electrnico de transmisin debe cortarse la muestra en capas finas, no mayores de un par de miles de ngstroms. Los microscopios electrnicos de transmisin pueden aumentar un objeto hasta un milln de veces. El primer microscopio electrnico de transmisin fue desarrollado entre 1931 y 1933 por Ruska y sus colaboradores. La ptica bsica de ese primer microscopio electrnico se mantiene hasta nuestros das; los cambios en los microscopios modernos consisten en adicionar ms lentes para incrementar el mbito de aumentos y darle mayor versatilidad. El primer microscopio electrnico de transmisin comercial lo construy la Siemens (http://www.siemens.es/) en 1939.

Microscopio electrnico de barrido Microscopio Electrnico de Barrido:la muestra es recubierta con una capa de metal delgado, esta es barrida con electrones enviados desde un caon. Un detector medira la cantidad de electrones envidoslo que arroja la intensidad de la zona de muestra, siendo

capaz de mostrar figuras en 3 dimensiones, proyectados en una imagen de TV. Su resolucin esta entre 3 y 20 nm, dependiendo del microscopio. Microscopio de sonda de barrido Un microscopio de sonda de barrido es aquel que tiene transmisor en la parte exequimal del lente(Objetivo 4x),su uso en las investigaciones cientificas es la de regular la imagen mediante un barrido de electrones haciendo que la imagen aumente (10.000.000 nm ). Microscopio de fuerza atmica El Microscopio de Fuerza Atmica (AFM) es un instrumento mecano-ptico capaz de detectar fuerzas del orden de los nanonewton. Al analizar una muestra, es capaz de registrar continuamente la altura sobre la superficie de una sonda o punta cristalina de forma piramidal. La sonda va acoplada a un listn microscpico, muy sensible al efecto de las fuerzas, de slo unos 200 m de longitud. La fuerza atmica se puede detectar cuando la punta est muy prxima a la superficie de la muestra. Es posible entonces registrar la pequea flexin del listn mediante un haz laser reflejado en su parte posterior. Un sistema auxiliar piezoelctrico desplaza la muestra tridimensionalmente, mientras que la punta recorre ordenadamente la superficie. Todos los movimientos son controlados por una computadora. La resolucin del instrumento es de menos de 1 nm, y la pantalla de visualizacin permite distinguir detalles en la superficie de la muestra con una amplificacin de varios millones de veces.

MICROSCOPIACONFOCAL Enrique Soto Eguibar Centro de Ciencias Fisiolgicas Instituto de Ciencias Universidad Autnoma de Pue Desde la antigedad se conocan las propiedades de aumento de las lentes de cristal y, en el siglo XIII, la lupa era comnmente usada por relojeros, joyeros y mercaderes de tejidos. Las primeras lentes que fueron sistemticamente utilizadas para la observacin microscpica en biologa fueron las pulidas por Antony Van Leeuwenhoek (1632-1723), quien en el siglo XVII, desarroll una especial habilidad para pulir lentes de la mejor calidad. Leeuwenhoek estudi todo tipo de muestras, usando para sus observaciones lentes simples, pulidas en la forma que tienen actualmente las lupas y, montadas en

engarzaduras de oro y plata. Con estos instrumentos Leeuwenhoek descubri los glbulos de la sangre, diversos protozoarios y las bacterias. El microscopio compuesto, constituido por varias lentes que permiten corregir

aberraciones de tipo cromtico y esfrico, fue inventado unos aos antes (entre 1591 y 1608) por el holands Zacharias Jensen. Este microscopio estaba compuesto por una lente objetivo convexa y un ocular cncavo. Posteriormente Johannes Kepler dise un microscopio compuesto en que, ambos, el objetivo y el ocular, eran de tipo convexo. Este es el prototipo de los microscopios actuales (vanse las figuras 1 y 2). El uso del microscopio, ya fuera ste simple o compuesto, permiti que cientficos excepcionales como Robert Hooke (1635-1713), Marcello Malpighi (1628-1694) y Leeuwenhoek reconocieran y establecieran la importancia de estudiar la organizacin microscpica de los seres vivientes. Las consecuencias de este nuevo enfoque; el anlisis de la estructura de los seres vivientes, es an en la actualidad, un tema de intenso trabajo cientfico que est lejos de ser completamente resuelto.

Los avances posteriores en la construccin de microscopios se han basado en el perfeccionamiento de la ptica y la iluminacin, sin modificarse en su esencia los principios bsicos de operacin de este magnfico instrumento. Desafortunadamente, la observacin de seres vivientes ha estado limitada, porque stos tienen grosores variables y trasmiten y reflejan la luz de manera no uniforme. Las reas fuera del plano focal degradan la imagen hacindola borrosa, disminuyendo el contraste y la resolucin, dificultando as la observacin de las estructuras que componen un espcimen. Este efecto que aqu denominamos como de velo, o borrosidad, es especialmente notable en los especmenes vivientes, en los que no se tiene control sobre el grosor de la muestra. Desde el siglo pasado, este problema se ha resuelto fijando y cortando los tejidos en rebanadas muy delgadas (hasta de 0.5 micras). Esto elimina, en su mayora, la distorsin debida a las regiones que se encuentran fuera del plano focal del lente y, pueden obtenerse imgenes de muy alta resolucin. Sin embargo, este procedimiento de fijacin y corte implica a su vez la destruccin de los tejidos. El problema en general fue claramente descrito por el mismsimo Don Santiago Ramn y Cajal, quien refirindose a la calidad de las imgenes que obtena con la microfotografa escribi: "[...] no ha sido posible para nosotros contravenir las inexorables leyes de la ptica. Es bien conocido que cuando una seccin es gruesa (40 m o ms) y contiene clulas dispuestas en varios planos y orientadas de diversas maneras, poco se puede lograr tratando de enfocar un grupo de clulas; las imgenes de aquellas que se encuentran por arriba o por abajo y que estn fuera de foco, proyectan sombras que disturban la pureza y claridad de la imagen."

Para contrarrestar parte de las limitantes en la observacin de especmenes vivientes, en el ao 1935, Fritz Zernike desarroll el microscopio de contraste de fases; razn por la cual le fue otorgado el Premio Nobel de Fsica en 1953. Los detalles de un objeto en el microscopio ptico estndar se ven debido a que los objetos tienen partes de diferente densidad; por lo tanto, objetos completamente transparentes, como algunos seres vivos, son difcilmente distinguibles. El contraste de fases es especialmente til para observar especmenes transparentes, debido a que hace distinguibles detalles que no lo son con el microscopio estndar. El contraste de fases se basa en que los objetos transparentes tienen pequeas variaciones en su ndice de refraccin de un punto a otro; esto genera un espectro de difraccin por detrs del plano focal del objetivo. Las ondas difractadas por las irregularidades del objeto se encuentran fuera de fase respecto a las que no han sido refractadas; al introducir el microscopio un desplazamiento artificial de la fase de las ondas no difractadas se produce un efecto de interferencia y aumento en el contraste del campo. Sin embargo, al observar especmenes vivos de grosor variable, existen diversas porciones del objeto que quedan fuera del plano focal del objetivo y que degradan significativamente la calidad de la imagen que se puede observar. Posteriormente se han construido nuevos sistemas de iluminacin y pticos que ofrecen un alto contraste y resolucin en muestras biolgicas; stos son los microscopios con ptica de Nomarsky o de contraste diferencial interferencial y el de modulacin de contraste de Hoffman, ambos, como en el microscopio de contraste de fases, convierten la informacin de fases en un aumento en el contraste de la imagen. Como resultado de esto, la intensidad de cualquier punto de la imagen es proporcional a la diferencia de fase generada por el especimen, lo que determina un aumento notable de la definicin de las regiones que tienen diferentes grosores, o indices de refraccin; particularmente los

bordes de cualquier estructura (vase la figura 3). En la ltima dcada se han desarrollado procedimientos que permiten incrementar significativamente la resolucin del microscopio ptico. Minski, en 1961, propuso un nuevo tipo de microscopio para la observacin de especmenes vivos con un alto contraste y mejor resolucin, comparable nicamente a la que se obtena anteriormente con microscopios electrnicos de barrido a bajo aumento o luego de complejos procesos de anlisis digital de imgenes. Este nuevo tipo de microscopio se basa en eliminar el velo que, en una imagen de microscopa ptica normal, producen las regiones que se encuentran fuera del plano de foco. Para esto, se ha optado por pasar la luz que incide sobre la muestra por un pequeo agujero o ranura y enfocarla en el plano de la imagen de un objetivo de gran apertura

numrica (vase la figura 4). De esta manera, la luz que es reflejada por el punto que se encuentra en el plano focal del objetivo, regresa al mismo y es reenfocada y transmitida a su vez por un pequeo agujero o ranura sin ninguna prdida. En cambio, la luz dispersada o emitida por los puntos que se encuentran fuera del plano de la imagen es atenuada o bloqueada completamente. De esta manera, se obtiene una imagen de alto contraste y definicin de un punto en el plano focal, sin que haya una contribucin significativa de las regiones que se encuentran fuera de foco. Debido a que las aperturas tanto de la iluminacin como del retorno de la imagen tienen un foco comn, se ha denominado este tipo de microscopios como "microscopio confocal". Puede resumirse su funcin diciendo que la microscopa confocal se basa en mejorar la relacin entre la seal y el ruido de la imagen. En la figura 4 se muestra un esquema de un tipo particular de microscopio confocal: en el cual, la fuente de luz que se utiliza es un rayo lser. El haz de luz se hace pasar por una ranura (P1) e incidir en un espejo dicroico (que refleja totalmente la luz que incide con un ngulo de cerca de 45 grados), para posteriormente enfocarlo sobre la muestra usando el propio objetivo del microscopio. La luz emitida por la muestra es colectada por el mismo objetivo y, pasando a travs del espejo dicroico es enfocada en una ranura detectora (P2). La luz que penetra a menor o mayor profundidad en la muestra (planos fuera de foco), incide por delante o por detrs de la ranura detectora (haces de luz representados en lneas punteadas en la figura 4). Debido a que la cantidad de luz que incide sobre la muestra es sumamente pequea, es necesario usar fuentes de iluminacin muy poderosas como es el rayo lser.

El procedimiento descrito, nos da la imagen de un pequeo punto de la muestra, para obtener una imagen completa es necesario usar complejos procedimientos que permitan mover el punto de iluminacin en toda la muestra, e integrar esta imagen formada de puntos individuales en una imagen nica. Para esto, se usan sistemas que permiten desplazar la muestra o mover el punto de iluminacin, barriendo toda el rea que se desea observar. Por esto ltimo, se denomina a los microscopios como "microscopio confocal de barrido". Como resultar obvio, para construir una imagen es necesario recorrer toda la muestra de manera uniforme, adems de que el rayo de iluminacin y la va de retorno, debern estar perfectamente alineadas. Esto implica que la mayora de los instrumentos que hasta ahora se han desarrollado, se basen en complejos sistemas electromecnicos que resultan en un alto costo, ya que tienen que generarse pequeos desplazamientos perfectamente uniformes, e integrarse la imagen en un computador. Para eliminar el problema asociado con el diseo de sistemas que permitan barrer la imagen, se han ofrecido diversas alternativas, algunas de las cuales se encuentran ya en microscopios confocales comerciales. Uno de stos es el microscopio confocal en que el barrido lo hace el haz de luz. Para ello se utilizan espejos dicroicos que vibran rpidamente recorriendo todo el espcimen. Otra solucin al problema lo constituye el "microscopio confocal de barrido en cascada". En el cual, un pequeo anillo que se encuentra por detrs del objetivo tiene mltiples hoyos (de 20 a 60 micras de dimetro) en forma de espiral, al rotar este anillo, se genera una imagen completa de toda la preparacin, tomando simultneamente muestras de una gran cantidad de puntos no adyacentes. Este tipo de microscopio tiene la ventaja de que se obtienen imgenes en tiempo real, permitiendo la observacin directa en el microscopio.

Cualquiera que sea el procedimiento que se utilice para barrer la muestra, las imgenes del microscopio confocal son notablemente superiores a las que se obtienen con el microscopio ptico convencional, ya que las imgenes generadas contienen detalles volumtricos y de textura imposibles de alcanzar con este ltimo. Una ventaja adicional se obtiene en los casos en que se desea explorar especmenes con fluorescencia. En estos casos, el efecto deletreo que sobre la imagen tienen las reas fuera de foco es especialmente notable; adems, la iluminacin de la muestra hace que se pierda rpidamente la fluorescencia (vase la figura 5). Por estas razones, el microscopio confocal es especialmente ventajoso para observar especmenes fluorescentes, ya que adems de eliminar el efecto de las regiones fuera de foco, solamente se ilumina una pequesima regin de la muestra en cada momento, eliminndose con ello el efecto de "blanqueado" que, sobre la fluorescencia, induce la iluminacin continua. La microscopa confocal permite tambien estudiar los especimenes usando luz transmitida o reflejada, ello implica que se puedan estudiar muestras que, por su grosor o por sus

caractersticas, no son transparentes. Esto ha permitido que se desarrollen nuevas tcnicas de preparacin de los especimenes a observar, las cuales no implican el corte en rebanadas delgadas como se hacia anteriormente, ampliando as significativamente las posibilidades de estudiar las relaciones estructura-funcin, ya sea a nivel uni o multicelular. Se han desarrollado, adems de la microscopa confocal, otros mtodos que permiten mejorar significativamente la calidad de las imgenes que se obtienen con el microscopio ptico. Estos mtodos se basan en el procesamiento digital de imgenes, por medio de procedimientos matemticos que permiten calcular y eliminar el velo debido a las regiones que se encuentran fuera de foco (vase la figura 6). Otros mtodos, para mejorar la calidad de imgenes en la microscopa ptica, se basan en modificaciones en los ngulos de incidencia de la luz y, en el uso de varios haces de luz para iluminar las muestras.

La importancia de la microscopa confocal radica entonces en que constituye una nueva y poderosa herramienta para examinar las estructuras celulares y sus funciones. Podemos resumir sus ventajas diciendo que: 1) pueden observarse tejidos intactos as como secciones gruesas sin necesidad de hacer cortes histolgicos, 2) se obtiene un aumento notable en la resolucin, especialmente en muestras con fluorescencia, 3) reduce el blanqueado de la fluorescencia, 4) permite hacer reconstrucciones tridimensionales ms precisas de mejor calidad y en menor tiempo que por otros mtodos. Por todo lo anterior, es claro que en el corto plazo, el microscopo confocal pasar a formar parte del instrumental normal de trabajo, tanto en laboratorios de anlisis clnico-patolgico, como en los laboratorios de investigacin bsica, ya que se ha convertido en un auxiliar indispensable en los estudios de tipo funcional, en los cuales se pretende determinar los procesos que se llevan a cabo en tejidos vivos. Como resultado del desarrollo de la microscopa confocal, y de los mtodos digitales de anlisis de imgenes, es posible actualmente abordar cuestiones relativas a las relaciones estructura-funcin en los seres vivos, que anteriormente eran incontestables. Qu es el microscopio Electrnico? La potencia amplificadora de un microscopio ptico est limitada por la longitud de onda de la luz visible. El microscopio electrnico utiliza electrones para iluminar un objeto. Dado que los electrones tienen una longitud de onda mucho menor que la luz, pueden mostrar estructuras mucho ms pequeas. La longitud de onda ms corta de la luz visible es de alrededor de 4.000 ngstroms (1 ngstrom es 0,0000000001 metros). La longitud de onda de los electrones que se utilizan en los microscopios electrnicos es de alrededor de 0,5 ngstroms. Todos los microscopios electrnicos cuentan con varios elementos bsicos. Disponen de un can que emite los electrones que chocan contra el espcimen, creando una imagen

aumentada. Se utilizan lentes magnticas para crear campos que dirigen y enfocan el haz de electrones, ya que las lentes convencionales utilizadas en los microscopios pticos no funcionan con los mismos. El sistema de vaco es una parte relevante del microscopio electrnico. Los electrones pueden ser desviados por las molculas del aire, de forma que debe hacerse un vaco casi total en el interior de un microscopio de estas caractersticas. Por ltimo, todos los microscopios electrnicos cuentan con un sistema que registra, o muestra, la imagen que producen los electrones. Hay dos tipos bsicos de microscopios electrnicos: el microscopio electrnico de transmisin (Transmission Electron Microscope, TEM) y el microscopio electrnico de barrido (Scanning Electron Microscope, SEM). Un TEM dirige el haz de electrones hacia el objeto que se desea aumentar. Una parte de los electrones rebotan o son absorbidos por el objeto y otros lo atraviesan formando una imagen aumentada del espcimen. Para utilizar un TEM debe cortarse la muestra en capas finas, no mayores de un par de miles de ngstroms. Se coloca una placa fotogrfica o una pantalla fluorescente detrs del objeto para registrar la imagen aumentada. Los microscopios electrnicos de transmisin pueden aumentar un objeto hasta un milln de veces. Un microscopio electrnico de barrido crea una imagen ampliada de la superficie de un objeto. No es necesario cortar el objeto en capas para observarlo con un SEM, sino que puede colocarse en el microscopio con muy pocos preparativos. El SEM explora la superficie de la imagen punto por punto, al contrario del TEM, que examina una gran parte de la muestra cada vez. Su funcionamiento se basa en recorrer la muestra con un haz muy concentrado de electrones, de forma parecida al barrido de un haz de electrones por la pantalla de una televisin. Los electrones del haz pueden dispersarse de la muestra o provocar la aparicin de electrones secundarios. Los electrones perdidos y los secundarios son recogidos y contados por un dispositivo electrnico situado a los lados del espcimen. Cada punto ledo de la muestra corresponde a un pxel en un monitor de televisin. Cuanto mayor sea el nmero de electrones contados por el dispositivo, mayor ser el brillo del pxel en la pantalla. A medida que el haz de electrones barre la muestra, se presenta toda la imagen de la misma en el monitor. Los microscopios electrnicos de barrido pueden ampliar los objetos 100.000 veces o ms. Este tipo de microscopio es muy til porque, al contrario que los TEM o los microscopios pticos, produce imgenes tridimensionales realistas de la superficie del objeto. Se han desarrollado otros tipos de microscopios electrnicos. Un microscopio electrnico de barrido y transmisin (Scanning Trasnmission Electron Microscope, STEM) combina los elementos de un SEM y un TEM, y puede mostrar los tomos individuales de un objeto. El microanalizador de sonda de electrones, un microscopio electrnico que cuenta con un analizador de espectro de rayos X, puede analizar los rayos X de alta energa que produce el objeto al ser bombardeado con electrones. Dado que la identidad de los diferentes tomos y molculas de un material se puede conocer utilizando sus emisiones de rayos X, los analizadores de sonda de electrones no slo proporcionan una imagen ampliada de la muestra, como hace un microscopio electrnico, sino que suministra tambin informacin sobre la composicin qumica del material. Microscopio de sonda de barrido En los microscopios de sonda de barrido se utiliza una sonda que recorre la superficie de una muestra, proporcionando una imagen tridimensional de la red de tomos o molculas que la componen. La sonda es una afilada punta de metal que puede tener un grosor de un solo tomo en su extremo. Un tipo importante de microscopio de sonda de barrido es el microscopio de tnel de barrido (siglas en ingls de Scanning Tunelling Microscope, STM) desarrollado en 1981. Este microscopio utiliza un fenmeno de la fsica cuntica, denominado efecto tnel, para proporcionar imgenes detalladas de sustancias

conductoras de electricidad. La sonda se coloca a una distancia de pocos ngstroms de la superficie del material y se aplica un voltaje pequeo entre la superficie y la sonda. A causa de la poca distancia entre el material y la sonda algunos electrones se escapan a travs del hueco, generando una corriente. La magnitud de la corriente del efecto tnel depende de la distancia entre la superficie y la sonda. El flujo de corriente es mayor cuando la sonda se acerca al material y disminuye cuando se aleja. A medida que el mecanismo de barrido mueve la sonda por encima de la superficie, se ajusta de modo automtico la altura de la sonda para mantener constante la corriente del efecto tnel. Estos ajustes minsculos permiten dibujar las ondulaciones de la superficie. Despus de muchas pasadas hacia adelante y hacia atrs se utiliza una computadora para crear una representacin tridimensional del material. Otro tipo de microscopio de sonda de barrido es el microscopio de fuerza atmica (Atomic Force Microscope, AFM), que no emplea la corriente de efecto tnel y que por lo tanto puede utilizarse tambin en materiales no conductores. A medida que la sonda se mueve a lo largo de la superficie de la muestra los electrones de la sonda de metal son repelidos por las nubes electrnicas de los tomos de la misma. La altura de la sonda se ajusta de modo automtico para mantener constante la fuerza recibida. Un sensor registra el movimiento ascendente y descendente de la sonda y entrega la informacin a una computadora, que a su vez la utiliza para dibujar una imagen tridimensional de la superficie del espcimen.

Un tubo cilndrico aloja el sistema ptico ocular/objetivo. Una platina de original diseo permite observar las preparaciones, que son iluminadas por un espejo cncavo que concentra la luz sobre el objeto a estudiar. Una barra-gua, solidaria con un limbo dentado, permite que tubo, portaobjetos y espejo puedan deslizarse a lo largo de ella con el fin de facilitar los ajustes pticos necesarios. El enfoque se realiza desplazando el tubo mediante un mecanismo de cremallera. La inclinacin del microscopio se logra mediante un mecanismo de pin

Elementos principales CSIC (CETEF)

El microscopio dispone, para focalizar el haz de luz sobre la preparacin, de un espejo cncavo de 70 mm. de dimetro ajustable en altura y orientable en cualquier direccin.

Platina y espejo CSIC (MNCN)

El microscopio se invento, hacia 1610, por Galileo, segn los italianos, o por Jansen, en opinin de los holandeses. La palabra microscopio fue utilizada por primera vez por los componentes de la "Accademia dei Lincei" una sociedad cientfica a la que perteneca Galileo y que publicaron un trabajo sobre la observacin microscpica del aspecto de una abeja.

Sin embargo las primeras publicaciones importantes en el campo de la microscopia aparecen en 1660 y 1665 cuando Malpighi prueba la teora de Harvey sobre la circulacin sangunea al observar al microscopio los capilares sanguneos y Hooke publica su obra Micrographia.

A mediados del siglo XVII un comerciante holands, Leenwenhoek, utilizando microscopios simples de fabricacin propia describi por primera vez protozoos, bacterias, espermatozoides y glbulos rojos.

Durante el siglo XVIII el microscopio sufri diversos adelantos mecnicos que aumentaron su estabilidad y su facilidad de uso aunque no se desarrollaron mejoras pticas. Las mejoras mas importantes de la ptica surgieron en 1877 cuando Abbe publica su teora del microscopio y por encargo de Carl Zeiss mejora la microscopa de inmersin sustituyendo el agua por aceite de cedro lo que permite obtener aumentos de 2000A principios de los aos 30 se habia alcanzado el limite terico para los microscopios pticos no consiguiendo estos, aumentos superiores a 500X o 1000X sin embargo existia un deseo cientfico de observar los detalles de estructuras celulares ( ncleo, mitochondria... etc.).

El microscopio electrnico de transmisin (T.E.M.) fu el primer tipo de microscopio electrnico desarrollado este utiliza un haz de electrones en lugar de luz para enfocar la muestra consiguiendo aumentos de 100.000 X. Fue desarrollada por Max Knoll y Ernst Ruska en Alemania en 1931. Posteriormente, en 1942 se desarrolla el microscopio electrnico de barrido (SEM).

Oculares

Estn colocados en la parte superior del tubo. Se denominan as, porque estn muy cercanos al ojo. Su funcin es la de captar y ampliar la imagen formada en en los objetivos. En los modernos microscopios hay dos oculares (microscopios binoculares) que estn unidos mediante un mecanismo que permite ajustar la distancia interpupilar. En general los mas utilizados son los de 10X ( producen un aumento de 10 veces ). MICROSCOPIO MICROSCOPIO

MONOCULAR

BINOCULAR

Es una columna perpendicular al pie. Puede ser arqueado o vertical y une al pie con el tubo

Tubo

Es una cmara oscura unida al brazo mediante una cremallera. Tiene el revolver con los objetivos en su parte inferior y los oculares en el extremo superior

Brazo

Objetivos

Estn colocados en la parte inferior del tubo insertados en una pieza metlica, denominada revolver, que permite cambiarlos fcilmente. Generan una imagen real, invertida y aumentada. Los mas frecuentes son los de 4, 10, 40, y 100 aumentos. Este ltimo se llama de inmersin ya que para su utilizacin se necesita utilizar aceite de cedro sobre la preparacin. En la superficie de cada objetivo se indican sus caractersticas principales, aumento, apertura numrica, y llevan dibujado un anillo coloreado que indica el nmero de aumentos ( rojo 4X, amarillo 10X, azul 40X y blanco 100X )

Platina

Es una plataforma horizontal con un orificio central, sobre el que se coloca la preparacin, que permite el paso de los rayos procedentes de la fuente de iluminacin situada por debajo. Dos pinzas sirven para retener el portaobjetos sobre la platina y un sistema de cremallera guiado por dos tornillos de desplazamiento permite mover la preparacin de delante hacia atrs o de izquierda a derecha y viceversa. En la parte posterior de uno de los laterales se encuentra un nonius que permite fijar las coordenadas de cualquier campo ptico; de esta forma se puede acudir a el cuando interesa.

Condensador

El condensador es un sistema de lentes situadas bajo la platina su funcin es la de concentrar la luz generada por la fuente de iluminacin hacia la preparacin. En el interior del condensador existe un diafragma-iris cuya funcin es limitar el haz de rayos que atraviesa el sistema de lentes eliminando los rayos demasiado desviados

Fuente de iluminacin

Se trata de una lmpara halgena de intensidad graduable. Esta situada en el pie del microscopio. Se enciende y se apaga con un interruptor y en su superficie externa puede tener una especie de anillo para colocar filtros que facilitan la visualizacin.

Pie

Sirve como base del microscopio y tiene un peso suficiente para dar estabilidad al aparato. En los microscopios antiguos tena forma de herradura o de trpode pero en la actualidad suele ser una plataforma rectangular. En l se integra la fuente luminosa

Macromtrico y micromtrico

Son tornillos de enfoque, mueven la platina hacia arriba y hacia abajo. El macromtrico lo hace de forma rpida y el micromtrico de forma lenta. Llevan incorporado un mando de bloqueo que fija la platina a una determinada altura.