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UNIVERSIDAD NACIONAL DE SAN LUIS Facultad de Qumica Bioqumica y Farmacia

Trabajo Prctico de Laboratorio N7 Determinacin de la actividad y comportamiento cintico de la polifenoloxidasa de frutas Objetivo: Estudiar la influencia de la concentracin en la velocidad de reaccin de la oxidacin del catecol a quinona por la polifenoloxidasa y determinar el KM y la actividad de esta enzima presente en las frutas. Fundamento Terico: Las reacciones qumicas que ocurren en los sistemas vivientes son tan variadas como complejas. La mayora de las reacciones que ocurren en los sistemas vivos son catalizadas por protenas conocidas con el nombre de enzimas. Los mecanismos de reaccin de las enzimas son muy complejos, implicando un nmero de etapas elementales cada una de las cuales puede incluir interacciones complejas entre varios grupos de las molculas de la enzima y el sustrato. En las reacciones catalizadas por enzimas las velocidades de reaccin, as como los mecanismos se ven afectados por cambios en la concentracin, el pH y la temperatura. Las velocidades de las reacciones catalizadas por enzimas son en general proporcionales a la primera potencia de la concentracin de la enzima (son de primer orden respecto a la enzima). Sin embargo, es frecuente encontrar una dependencia de la concentracin del sustrato (sobre el que acta la enzima). La velocidad vara linealmente con la concentracin de sustrato a concentraciones bajas (primer orden respecto al sustrato) y se hace independiente de la concentracin de ste (orden cero) a concentraciones elevadas. Este tipo de comportamiento fue explicado por Michaelis y Menten en funcin del mecanismo siguiente: 1. Interaccin de la enzima con el substrato (reactivo), para formar un complejo intermediario k1 E+S k-1 ES

2. Descomposicin del complejo intermediario para dar los productos y regenerar la enzima k2 ES E + P

E es la enzima, S el sustrato, ES un complejo y P es el producto. Aplicando el tratamiento cintico denominado del estado estacionario, en el que se asume que la concentracin del complejo intermediario es constante obtenemos k1[E] S k-1 [ES] - k2[ES] = 0 I

Ctedra: Fisicoqumica Aplicada- Carrera: Ing. en Alimentos Trabajos Prcticos de Laboratorio

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Si la concentracin total de la enzima [E]o es igual a la suma de la concentracin en enzima libre [E], ms la concentracin de enzima que forma el complejo [ES]: [E]o = [E] + [ES] II

Introduciendo [E] de la ecuacin II en la ecuacin I, tenemos: K1 ([E]o - [ES]) [S] - (K-1 + K2) [ES] = 0 de donde podemos obtener la concentracin de enzima que est formando el complejo III

Se asume que la etapa determinante de la reaccin es la descomposicin del complejo, entonces la velocidad de la reaccin es v=k2 [ES] en donde se substituye [ES]

que reordenando nos da:

Donde Km =

se denomina constante de Michaelis.

De la ecuacin III se deduce que cuando [S] es suficientemente pequea,

lo que indica primer orden respecto a la concentracin de sustrato. Por el contrario, cuando [S] es mucho mayor que Km, v = k2 [Eo] y la cintica es orden cero respecto al sustrato. En ambos casos el orden es b>1 para la concentracin de enzima.

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Figura. Dependencia tpica de la velocidad de una reaccin enzimtica como funcin del sustrato S. Se define la unidad de actividad enzimtica (U) como la cantidad de enzima que cataliza la conversin de 1 mol de sustrato en un minuto. La actividad especfica es el nmero de unidades de enzima por miligramo de protena (U/mg prot) o por mililitro de disolucin (U/ml). Las enzimas tienen muchas aplicaciones en diversos tipos de industrias, entre las que se destaca la alimenticia. En algunos casos, como la obtencin de yogur, o la produccin de cerveza o de vino, el proceso de fermentacin se debe a las enzimas presentes en los microorganismos que intervienen en el proceso de produccin. Sin embargo, otros procesos de produccin de alimentos, pueden realizarse mediante la accin de las enzimas aisladas, sin incluir a los microorganismos que las producen. Desarrollo Experimental: En un matraz aforado de 50 ml se coloca un volumen de 1.7 ml del extracto que contiene la enzima y se lo lleva a volumen con la solucin buffer fosfato (pH= 7.2). En 8 tubos de ensayo se colocan volmenes crecientes (0.1; 0.15; 0.2; 0.25; 0.3; 0.35; 0.4; 0.45) de la solucin de catecol ya preparada y se adicionan 5 ml de la solucin Enz. + Buffer, simultneamente se comienza a tomar el tiempo. Rpidamente se coloca parte de la mezcla en una celda de vidrio y se mide la absorbancia (=420 nm) de la misma cada 30 seg. durante 10 minutos. Con los datos obtenidos se realiza una grfica de absorbancia vs tiempo para cada corrida y de la pendiente de las rectas se obtienen las velocidades iniciales (V0) de la enzima para cada concentracin de sustrato. Conociendo la concentracin inicial de sustrato y el volumen inicial y final se puede calcular la concentracin final de sustrato en la mezcla con la siguiente expresin: Ci*Vi = Cf*Vf. A partir de los datos de velocidad inicial y concentracin de sustrato se grafica V0-1 vs [S]-1. De la expresin de esta recta se obtienen los valores de Vmax y la constante de Michaelis (KM) para la polifenoloxidasa. Adems con los datos de velocidad inicial se puede calcular la actividad de la enzima para cada concentracin a partir de la expresin: A= V0 * 60 seg * 1000 / ml E * 1 min

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Datos obtenidos: Tabla 1: absorbancia vs. tiempo Tiempo (min.) 0:30 1 1:30 2 2:30 3 3:30 4 4:30 5 5:30 6 6:30 7 7:30 8 8:30 9 9:30 10 Corrida 1 0.018 0.018 0.018 0.018 0.018 0.018 0.018 0.018 0.018 0.019 0.019 0.020 0.021 0.022 0.023 0.024 0.026 0.027 0.028 0.029 Corrida 2 0.021 0.020 0.020 0.020 0.020 0.020 0.021 0.021 0.022 0.023 0.025 0.026 0.028 0.029 0.031 0.032 0.034 0.035 0.037 0.038 Corrida 3 0.034 0.034 0.034 0.034 0.034 0.035 0.036 0.037 0.039 0.041 0.043 0.045 0.047 0.048 0.050 0.052 0.053 0.055 0.056 0.057 Corrida 4 0.016 0.016 0.017 0.017 0.018 0.019 0.021 0.023 0.025 0.027 0.030 0.032 0.034 0.036 0.037 0.039 0.041 0.042 0.043 0.044 Corrida 5 0.030 0.030 0.030 0.031 0.033 0.034 0.036 0.038 0.041 0.043 0.046 0.048 0.050 0.051 0.053 0.056 0.056 0.057 0.058 0.059 Corrida 6 0.013 0.014 0.015 0.015 0.017 0.019 0.021 0.024 0.026 0.029 0.031 0.033 0.035 0.037 0.038 0.040 0.041 0.042 0.043 0.044 Corrida 7 0.036 0.036 0.036 0.038 0.039 0.042 0.043 0.046 0.048 0.051 0.053 0.055 0.057 0.058 0.059 0.061 0.062 0.062 0.063 0.064 Corrida 8 0.029 0.029 0.030 0.032 0.035 0.036 0.038 0.041 0.043 0.045 0.048 0.049 0.051 0.052 0.053 0.054 0.055 0.056 0.056 0.057

Tabla 2: velocidad inicial-1 vs. [S]-1 Corrida 1 V0 (mol/L min) [S] (mol/L) V0-1 (L min/mol) [S]-1 (L/mol) Actividad (UA/ml min) 0.0023 7.84E-4 434,782 1275 0.8117 Corrida 2 0.0028 1.17E-3 357,142 858.33 0.9882 Corrida 3 0.0034 1.54E-3 294.11 650 1.2 Corrida 4 0.0037 1.9E-3 270.27 525 1.3058 Corrida 5 0.0037 2.2E-3 270.27 441.66 1.3058 Corrida 6 0.0037 2.6E-3 270.27 382.14 1.3058 Corrida 7 0.0034 2.9E-3 294.11 337.5 1.2 Corrida 8 0.0032 3.3E-3 312,5 302.77 1.1294

Clculos y Grficas:

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Corrida 1
0,035 0,03
0,04 0,035

Corrida 2

Absorbancia

Absorbancia

0,025 0,02 0,015 0,01 0,005 0 0 5 10 15 Tiempo (min) y = 0,0023x + 0,0061 R2 = 0,994

0,03 0,025 0,02 0,01 5 0,01 0,005 0 0 2 4 6 8 1 0 1 2 y= 0,0028x + 0,0097 R2 = 0,991 4

Tiempo (min)

Corrida 3
0,07 0,06 Absorbancia 0,05 0,04 0,03 0,02 0,01 0 0 5 10 15 Tiempo (min) y = 0,0034x + 0,0244 R2 = 0,9949

Corrida 4
0,05 Absorbancia 0,04 0,03 0,02 0,01 0 0 5 10 15 Tiempo (min) y = 0,0037x + 0,0087 R2 = 0,9899

Corrida 5
0,07 Absorbancia 0,06 Absorbancia 0,05 0,04 0,03 0,02 0,01 0 0 5 10 15 T ie m po (m in) y = 0,0037x + 0,0241 R2 = 0,9788
0,05 0,045 0,04 0,035 0,03 0,025 0,02 0,01 5 0,01 0,005 0 0 2

Corrida 6

y= 0,0037x+ 0,0093 R2 = 0,9774

1 0

1 2

Tiempo (min)

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Corrida 7
0,08 Absorbancia 0,07 0,06 Absorbancia 0,05 0,04 0,03 0,02 0,01 0 0 5 10 15 T ie m p o (m in) y = 0,0034x + 0,0324 R2 = 0,9678
0,07 0,06 0,05 0,04 0,03

Corrida 8

y= 0,0032x+ 0,028 0,02 0,01 0 0 2 4 6 8 1 0 1 2 R2 = 0,9584

Tiempo (min)

V0-1 vs S-1
500 450 400 350 300 250 200 150 100 50 0 0 200 400 600 1/S 800

1/Vo

y = 0,2108x + 167,22 R2 = 0,9829

1000

1200

1400

Vmax: 0.00598015 UA/min ml KM: 0.00126061 Conclusiones: Las graficas de absorbancia vs tiempo muestran que para pequeas concentraciones de sustrato la enzima demora en actuar sobre el catecol porque hay poco sustrato para distribuirse entre las enzimas, pero al ir aumentando aquel aumenta la velocidad de reaccin hasta un valor mximo y luego comienza a decrecer ya que hay mucho sustrato para la misma cantidad de enzima. Por ltimo, aunque se debieron quitar algunos puntos de la grfica de V0-1 vs S-1 que no se ajustaban a la recta se pudieron obtener valores coherentes de Vmax y KM.

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