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Appendix

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ndice
Datos vlidos en la fecha de impresin y salvo error tipogrfco.
Descripcin Pagina
I. Informacin general para el laboratorio
. Abreviaturas, smbolos y unidades
1.1. Conversiones y unidades 63
1.1.1. Volumen y peso 63
1.1.2. Intervalos de tiempo 63
1.1.3. Unidades 63
1.2. Factores de conversin a unidades actuales 63
1.3. Prefjos mtricos 63
1.4. Alfabeto griego 63
. Elementos, reactivos, productos qumicos e istopos
2.1. Nmeros atmicos y pesos atmicos de los elementos 64
2.2. cidos y bases 65
2.3. Istopos propiedades fsico-qumicas de los istopos usados comunmente 65
3. Normas bsicas de la dispensacin
3.1. Principio de cmara de aire (desplazamiento de aire) 66
3.2. Principio de desplazamiento positivo 68
4. Tcnicas de dispensacin
4.1. Pipetas de cmara de aire 69
4.2. Manejo ptimo de pipetas manuales 70
4.3. Posibilidad y prevencin de la contaminacin 7
5. Calibracin
5.1. Procedimiento de ensayo gravimtrico 7
6. Pautas de aplicacin en la manipulacin de lquidos
6.1. Descontaminacin y limpieza de pipetas de cmara de aire 73
6.2. Posibles fuentes de error para el pipeteo con pipetas de cmara de aire 74
6.3. Conversin de diferentes unidades de presin 74
6.4. Datos fsicos de los lquidos (ejemplos relevantes) 75
6.5. Resistencia qumica de desechables 76
6.6. Lmites de error segn EN ISO 8655 77
6.7. Declaracin de conformidad 78
7. Recomendaciones para la centrifugacin
7.1. Tabla de conversin rpm/rcf (nomogramo) 79
7.2. Factores K y tiempos de centrifugacin 80
II. Practical information for Molecular Biology: data, facts, tips and tricks 8
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1. Abreviaturas, smbolos y unidades
.. Conversiones y unidades
... Volumen y peso
Volumen: Peso:
1 nl 1 g
1 l 1 mg
1 ml 1 g
1 l 1.000 g (1 kg)
.4. Alfabeto griego
a A Alfa
b B Beta
g G Gamma
d D Delta
e E psilon
z Z Zeta
h H Eta
J Q Theta
i I Iota
k K Kappa
l L Lambda
m M My
n N Ny
x X Xi
o O micron
p P Pi
r R Rho
s S Sigma
t T Tau
u U psilon
j F Phi
c C Ji
y Y Psi
w W Omega
... Intervalos de tiempo
Factores de conversin:
1 da = 1,44 x 10
3
min = 8,64 x 10
4
sec
1 ao = 5,26 x 10
5
min = 3,16 x 10
7
sec
..3. Unidades
Longitudes:
1 inch (in) = 2,54 cm
1 foot (ft) = 12 in = 30,48 cm
Volmenes (GB):
1 pint (pt) = 0,5679 litros
1 quart (qt) = 2 pints = 1,1359 litros
1 gallon (gal) = 4 quarts = 4,5435 litros
Volmenes (US):
1 pint (pt) = 0,4729 litros
1 quart (qt) = 2 pints = 0,9458 litros
1 gallon (gal) = 4 quarts = 3,7832 litros
Temperatura:
1 Kelvin (K) = C + 273,15
1 Fahrenheit (F) = [(C - 32) x 10] 18
.. Factores de conversin a unidades actuales
Tamao: Unidad antigua: Unidad actual:
Presin 1 at 0,980665 bar
1 Atm (=760 Torr) 1,01325 bar
1 Torr 1,3332 mbar
1 mWS 0,0980665 bar
1 mmWS 0,0980665 mbar
Energa 1 mkp 9,80665 J
1 kcal 4,1868 kJ
1 erg 10
-7
J
Unidad
radioactividad
1 dpm 60 Bq
1 Ci = 2,22 x 10
12
dpm 3,7 x 10
10
Bq
1 mCi = 2,22 x 10
9
dpm 3,7 x 10
7
Bq
1 Ci = 2,22 x 10
6
dpm 4,7 x 10
4
Bq
E-Mail: eppendorf@eppendorf.com Internet: www.eppendorf.es
.3. Prefjos mtricos
E = exa = 10
18
P = peta = 10
15
T = terra = 10
12
G = giga = 10
9
M = mega = 10
6

k = kilo = 10
3
h = hecto = 10
2
da = deca = 10
1
d = deci = 10
-1
c = centi = 10
-2
m = milli = 10
-3
= micro = 10
-6
n = nano = 10
-9
p = pico = 10
-12
f = femto = 10
-15
a = atto = 10
-18
z = zepto = 10
-21
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2. Elementos, reactivos, productos qumicos e istopos
Datos vlidos en la fecha de impresin y salvo error tipogrfco.
.. Nmeros atmicos y pesos atmicos de los elementos
Elemento Smbolo Nmero atmico Peso atmico
Actinio Ac 89 227,03
Aluminio Al 13 26,98
Americio Am 95 243,06
Antimonio Sb 51 121,75
Argn Ar 18 39,95
Arsnico As 33 74,92
Astato At 85 210,99
Azufre S 16 32,06
Bario Ba 56 137,34
Berilio Be 4 9,01
Berquelio Bk 97 247,07
Bismuto Bi 83 208,98
Boro B 5 10,81
Bromo Br 35 79,9
Cadmio Cd 48 112,4
Calcio Ca 20 40,08
Californio Cf 98 249,07
Carbono C 6 12,01
Cerio Ce 58 140,12
Cesio Cs 55 132,91
Cinc Zn 30 65,37
Circonio Zr 40 91,22
Cloro Cl 17 35,45
Cobalto Co 27 58,93
Cobre Cu 29 63,55
Criptn Kr 36 83,8
Cromo Cr 24 52
Curio Cm 96 245,07
Disprosio Dy 66 162,5
Einstenio Es 99 254,09
Erbio Er 68 167,26
Escandio Sc 21 44,96
Estao Sn 50 118,69
Estroncio Sr 38 87,62
Europio Eu 63 151,96
Fermio Fm 100 252,08
Fluor F 9 18,99
Fsforo P 15 30,97
Francio Fr 87 223,02
Gadolinio Gd 64 157,25
Galio Ga 31 69,72
Germanio Ge 32 72,59
Hafnio Hf 72 178,49
Helio He 2 4
Hidrgeno H 1 1,01
Hierro Fe 26 55,58
Holmio Ho 67 164,93
Indio In 49 114,82
Iridio Ir 77 192,22
Iterbio Yb 70 173,04
Itrio Y 39 88,91
Khurchatovio Kh 104 260
.. Nmeros atmicos y pesos atmicos de los elementos
Elemento Smbolo Nmero atmico Peso atmico
Lantano La 57 138,91
Laurencio Lr 103 256
Litio Li 3 6,94
Lutecio Lu 71 174,97
Magnesio Mg 12 24,31
Manganeso Mn 25 54,94
Mendelevio Md 101 255,09
Mercurio Hg 80 200,59
Molibdeno Mo 42 95,94
Neodimio Nd 60 20,183
Nen Ne 10 20,18
Neptunio Np 93 237,05
Niobio Nb 41 92,91
Niquel Ni 28 58,71
Nitrgeno N 7 14,01
Nobelio No 102 255
Oro Au 79 196,97
Osmio Os 76 190,2
Oxgeno O 8 16
Paladio Pd 46 106,4
Plata Ag 47 107,87
Platino Pt 78 195,09
Plomo Pb 82 207,2
Plutonio Pu 94 242,06
Polonio Po 84 208,98
Potasio K 19 39,1
Praseodimio Pr 59 140,91
Promecio Pm 61 145
Protactinio Pa 91 231,04
Radio Ra 88 226,03
Radn Rn 86 222,02
Renio Re 75 186,2
Rodio Rh 45 102,91
Rubidio Rb 37 85,47
Rutenio Ru 44 101,07
Samario Sm 62 150,4
Selenio Se 34 78,96
Silicio Si 14 28,09
Sodio Na 11 22,99
Talio Tl 81 204,37
Tantalio Ta 73 180,95
Tecnetio Tc 43 98,91
Teluro Te 52 127,6
Terbio Tb 65 158,93
Titanio Ti 22 47,9
Torio Th 90 232,04
Tulio Tm 69 168,93
Uranio U 92 238,03
Vanadio V 23 50,94
Volframio W 74 183,85
Xnon Xe 54 131,3
Yodo I 53 126,9
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2. Elementos, reactivos, productos qumicos e istopos
.. cidos y bases
Peso molecular % de peso Molaridad (aprox.) M de solucin (ml/litro) Densidad especfca
cidos
cido actico (glacial) 60,05 99,6 17,4 57,5 1,05
cido frmico 46,03 90 23,6 42,4 1,205
98 25,9 38,5 1,22
cido hidroclrico 36,46 36 11,6 85,9 1,18
cido ntrico 63,01 70 15,7 63,7 1,42
cido perclrico 100,46 60 9,2 108,8 1,54
72 12,2 82,1 1,70
cido fosfrico 98,00 85 14,7 67,8 1,70
cido sulfurico 98,07 98 18,3 54,5 1,835
Bases
Hidrxido de amonio 35,0 28 14,8 67,6 0,90
Hidrxido de potasio 56,11 45 11,6 82,2 1,447
Hidrxido de sodio 40,0 50 19,1 52,4 1,53
.3. Istopos propiedades fsicoas de los istopos usados comunmente
Nuclidos Vida media Emisin Energa,
mx. (MeV)
Rango de
emisin, mx.
Material
recomendado
3
H 12,43 aos b 0,0186 0,42 cm (aire)
14
C 5.370 aos b 0,156 21,8 cm (aire)
32
P 14,3 das b 1,71 610 cm (aire) Vidrio acrlico (1 cm)
0,8 cm (agua)
0,76 cm (acrlico)
33
P 25,4 das b 0,249 49 cm Vidrio acrlico (1 cm)
35
S 87,4 das b 0,167 24,4 cm (aire)
125
I 60 das g 0,270,035 0,2 mm (plomo) Plomo (0,02 mm)
E-Mail: eppendorf@eppendorf.com Internet: www.eppendorf.es
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Datos vlidos en la fecha de impresin y salvo error tipogrfco.
3. Normas bsicas de la dispensacin
3.. Principio de cmara de aire (desplazamiento de aire)
Los sistemas de dispensacin funcionan de acuerdo con dos
principios fsicos diferentes: la dispensacin de lquido tiene lugar o
bien a travs de una cmara de aire o mediante un desplazamiento
positivo. Estos dos principios diferentes de dispensacin sern
analizados a continuacin, tomando como ejemplo las pipetas
de mbolo y teniendo en cuenta los aspectos ergonmicos tan
importantes hoy en da para los usuarios.
Las pipetas con cmara de aire constan de un mbolo y un clindro
que lleva a cabo la medicin real (Fig. 1). Una cmara de aire
separa la muestra aspirada en una punta de plstico del mbolo
que se encuentra en el interior de la pipeta. Un movimiento
ascendente del mbolo produce un vaco parcial en la punta, lo que
arrastra el lquido dentro de la punta. La cmara de aire desplazada
por el mbolo acta como un resorte elstico del que est sus-
pendido el volumen de lquido en la punta. Gracias a la expansin
de este volumen de aire, el volumen desplazado por el mbolo es
aprox. de un 2% a un 4% superior al volumen aspirado del lquido
requerido. Dicha expansin se compensa mediante un factor que
tiene en cuenta el volumen correcto y la altura de la elevacin en la
punta de la pipeta. Las variaciones de temperatura, presin de aire
y humedad deben minimizarse con las pipetas de cmara de aire a
travs de medidas diseadas para que la precisin de la dispensa-
cin no se deteriore.
Pulsador
Indicador digital (pipeta variable)
mbolo (cermica)
Cierre del mbolo
Cmara de aire
Resorte de eyeccin de puntas
Manguito de eyeccin
Cono de la pipeta
Fig.: Modelo de pipeta de cmara de aire por dentro (eppendorf Reference

)
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E-Mail: eppendorf@eppendorf.com Internet: www.eppendorf.es
3. Normas bsicas de la dispensacin
La fgura 2 muestra el principio de diseo funcionamiento de
una pipeta de cmara de aire en la posicin de reposo (1). Para
preparar la aspiracin del lquido (2) se presiona el pulsador hasta
el primer tope (recorrido de medicin). El mbolo desciende, des-
plazando un volumen de aire que se corresponde con el volumen
de aspiracin seleccionado del lquido. Para aspirar lquido (3) se
sumerge en l la punta de la pipeta verticalmente. A medida que el
pulsador vuelve lentamente a su posicin, se crea un vaco parcial
en la punta de la pipeta, aspirando el volumen requerido a travs
de la apertura de la punta.
Para dispensar lquido (4), se presiona lentamente el pulsador hasta
el primer tope (recorrido de medicin). El mbolo desciende,
vaciando la punta. Para vaciar la punta completamente (expulsin,
5), se presiona el pulsador hasta el segundo tope (expulsin), y la
pipeta se eleva con el pulsador sin presionar y se limpia contra la
pared del recipiente. Cuando el pulsador vuelve atrs, el mbolo
vuelve a la posicin de reposo (6).
La profundidad de inmersin de la punta de la pipeta tiene un
efecto signifcativo en el resultado. Si la punta est demasiado
sumergida en el lquido, se forman gotas en el exterior, falseando
posiblemente el volumen de dispensacin. Si la punta no est
sufcientemente sumergida en el lquido, se produce una turbulencia
y se aspira un volumen incorrecto.
Fig. : Funcionamiento de una pipeta de cmara de aire (Eppendorf Research

)
Rest
position
Preparation for
liquid aspiration
Liquid
aspiration
Rest position
1. Stop
(Measureing stroke)
Piston
moves
down
Liquid
dispensing
Blow-out Tip
ejection
Rest position
1. Stop (Measureing stroke)
Piston
moves
down
2. Stop
(Blow-out)
Blow-out
Tip
ejector
moves
down
Tip ejector
is pressed
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Datos vlidos en la fecha de impresin y salvo error tipogrfco.
3. Normas bsicas de la dispensacin
3.. Principio de desplazamiento positivo
Estos sistemas que funcionan de acuerdo con el principio de des-
plazamiento positivo estn sujetos a infuencias fsicas diferentes
a aquellas que se producen con los sistemas por cmara de aire
descritos anteriormente. Los efectos de las cmaras de aire no son
aplicables en este caso, por ello estos dispositivos son adecuados
tambin para la dispensacin de lquidos y para aplicaciones muy
importantes junto con los sistemas de cmara de aire. Dichas
aplicaciones incluyen: lquidos con una elevada presin de vapor,
una elevada viscosidad o una elevada densidad y aplicaciones en
biologa molecular tales como la reaccin en cadena de polime-
rasa, que requiere la ausencia de aerosoles.
La precisin de los sistemas de dispensacin de desplazamiento
positivo depende de la punta de plstico desechable en mayor
medida que con los sistemas por cmara de aire. Al contrario que
las puntas de plstico de los sistemas de cmara de aire, las
puntas de los sistemas de desplazamiento positivo tienen un
mbolo integrado que est acoplado a la varilla del mbolo del
dispositivo de dispensacin durante el pipeteo (Fig. 3) y que lleva a
cabo el proceso de dispensacin real. Las puntas estn diseadas
especialmente para utilizar sistemas de desplazamiento positivo, y
no pueden sustituirse por puntas extraas para el sistema.
La fgure 4 muestra el funcionamiento de un sistemas de desplaz-
amiento positivo. Para prepararse para la aspiracin del lquido (1),
se presiona el pulsador hasta el primer tope y el mbolo desciende
hasta la posicin correspondiente. Para aspirar el lquido (2), se
sumerge la punta de la pipeta unos milmetros en el lquido de
forma vertical; el pulsador puede entonces deslizarse hacia atrs
lentamente, el mbolo asciende y se aspira el volumen requerido
de lquido dentro de la punta a travs del vaco parcial que se
produce. Para dispensar el lquido en un recipiente (3), el puls-
ador se presiona lentamente hasta el primer tope (recorrido de
medicin). El mbolo en la punta desciende gracias a la varilla
del mbolo de la pipeta, desplazando as el lquido de la punta. El
pulsador se mantiene presionado y la punta contra la pared del
recipiente. Para expulsar la punta (4), se presiona el pulsador hasta
el fnal.
Fig. 4: Funcionamiento de una pipeta de desplazamiento
positivo (Eppendorf Biomaster

)
Fig. 3: Acoplamiento de una pipeta de desplazamiento
positivo a una punta de pipeta compatible:
La punta tiene un mbolo integrado (2) que est conectado de
forma segura durante el pipeteo con la varilla del mbolo de la
pipeta (1). El lquido en la punta slo llega al borde del sellado
hermtico (3), con lo que se excluye la formacin de aerosoles.
Preparation
for liquid
aspiration
Liquid
aspiration
Liquid
dispensing
Tip
ejection
Rest position
1. Stop (Measureing stroke)
Tip ejection
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4. Tcnicas de dispensacin
4.. Pipetas de cmara de aire
Las tcnicas de dispensacin utilizadas con ms frecuencia son
el pipeteo positivo, el pipeteo inverso, la dispensacin, la dispen-
sacin secuencial y la dilucin. Mientras que las pipetas manuales
slo son adecuadas para el pipeteo positivo y el pipeteo inverso,
los sistemas electrnicos de dispensacin cubren generalmente
todas las funciones mencionadas. La seleccin de la tcnica de
dispensacin adecuada en cada caso puede tener un impacto
signifcativo en losl resultados del anlisis.
La tcnica de pipeteo positivo es adecuada para soluciones
acuosas que pueden contener bajas concentraciones de protena
o detergentes. Humectar previamente la punta mejora el resultado
del anlisis. Con lquidos viscosos o espumosos o si se dispensan
vlumenes de muestras muy pequeos, pueden mejorarse mucho
los resultados con el pipeteo inverso. En este caso, el lquido es
aspirado con expulsin y dispensado sin expulsin. Un residuo de
lquido permanece en la punta de plstico, y despus es descarta-
do o devuelto a un recipiente de aspiracin.
Durante el proceso de dispensacin, el lquido aspirado se dispensa
en etapas defnidas. Esta tcnica se utiliza con frecuencia para
el procesamiento de series largas de ensayo o relleno de placas
microtest. Con dispensacin secuencial, se dispensan una tras otra
diferentes volmenes de una solucin en una secuencia especfca.
Esta tcnica se utiliza con frecuencia en procesos serolgicos o
aplicaciones similares.
Al diluir lquidos, primero se aspira un volumen inicial, seguido de
una burbuja de aire y el segundo volumen. Entonces se dispen-
san ambos volmenes en un paso. Esta tcnica de dispensacin
aumenta el rendimiento y, en comparacin con la realizacin de la
aspiracin y la dispensacin, reduce la fatiga a la mitad con pipetas
manuales en particular en el caso de volmenes considerables y
pipetas multicanal.
Fig. 5: Pipeteo positivo
Aplicacin recomendada para
soluciones estndar como el
agua, los tampones, las soluci-
ones salinas diluidas, los cidos
diluidos y las lejas
: Presionar el pulsador hasta el
primer tope. Sumergir la punta
unos mlimetros en el lquido.
: Soltar despacio el pulsador.
Se inicia el llenado de la punta.
3: Dispensar presionando el
pulsador hasta el primer tope,
y expulsar el lquido restante
presionando el pulsador hasta
el segundo tope.
Fig. 6: Pipeteo inverso
Aplicacin recomendada
para soluciones viscosas, solu-
ciones con una elevada presin
de vapor, disolventes muy
humectantes.
: Presionar el pulsador hasta el
segundo tope. Sumergir la punta
unos milmetros en el lquido.
: Soltar despacio el pulsador.
Se inicia el llenado de la punta.
3: Dispensar el lquido
presionando el pulsador hasta
el primer tope, en la punta
permanece resto de lquido.
E-Mail: eppendorf@eppendorf.com Internet: www.eppendorf.es
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rc
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Systemat|c
meas0|ement dev|at|on
0.2 - 0.4 %
Systemat|c
meas0|ement dev|at|on
0.5 - 0.8 %
Systemat|c
meas0|ement dev|at|on
1 - 1.2 %
@J @J @J
R
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s
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rc
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Systemat|c
meas0|ement dev|at|on
0.2 - 0.4 %
Systemat|c
meas0|ement dev|at|on
0.5 - 0.8 %
Systemat|c
meas0|ement dev|at|on
1 - 1.2 %
@J @J @J
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meas0|ement dev|at|on
0.2 - 0.4 %
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meas0|ement dev|at|on
0.5 - 0.8 %
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meas0|ement dev|at|on
1 - 1.2 %
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4. Tcnicas de dispensacin
4.. Manejo ptimo de pipetas manuales
Tabla. : Profundidad ptima de inmersin para
diferentes volmenes de pipeteo
Volumen (l) Profundidad ptima de inmersin (mm)
0,11 1
1500 23
1011.000 24
1.00110.000 36
La pipeta debe sostenerse en vertical durante la aspiracin.
Al aspirar el lquido, la presin hidrosttica de la columna de lquido
en la punta cae, pues el ngulo de inclinacin de la pipeta aumenta.
Como consecuencia, se produce un aumento del volumen de
aspiracin (Fig. 7). La desviacin en volumen puede ser estimada
para cualquier volumen de pipeta y cualquier ngulo de inclinacin.
Con un ngulo de 45 divergente de la vertical, el volumen extra
con una pipeta de 1.000 l es 2,9 l 0,29%.
Para una pipeta de 100 l a un ngulo de 60, resultar un volumen
extra de 0,53 l 0,53% (fg. 7).
El hecho de que personas diferentes no pipeteen exactamente el
mismo volumen con la misma pipeta exactamente tambin se puede
explicar por factores como los diferentes ngulos de inclinacin
al aspiracin de lquido. Aunque el efecto es pequeo en cada
caso, el error puede ser mucho mayor cuando se renen todos los
factores diferenciales.
Fig. 7: Infuencia de la profundidad de inmersin y ngulo de
sujecin de la pipeta durante la aspiracin de lquidos
Desviacin de la
medicin
sistemtica
0,20,4%
Desviacin de la
medicin
sistemtica
0,60,8%
Desviacin de la
medicin
sistemtica
1,01,2%
Pipeta vertical,
profundidad de
la inmersin de la
punta en el lquido
aprox. 1 cm
Pipeta vertical,
profundidad de
la inmersin de la
punta en el lquido
aprox. 3 cm
Pipeta en el ngulo
de sujecin de 30 a
40, profundida de
la inmersin de la
punta en el lquido
aprox. 34 cm
Datos vlidos en la fecha de impresin y salvo error tipogrfco.
Independientemente de la tcnica de dispensacin empleada, deben
tenerse en cuenta los siguientes elementos durante el pipeteo:
En el caso de pipetas con cmara de aire, debe seleccionarse
la punta de la pipeta de forma que la cmara de aire entre el
mbolo de la pipeta y la superfcie del lquido sea lo ms
pequea posible. Cuanto ms pequea sea la punta, menos
volumen de aire y mayor precisin de los resultados.
Al aspirar el lquido, la punta debe sumergirse slo unos
milmetros en el medio (tab. 1, fg. 7).
La punta llenada debe elevarse contra la pared del recipiente
para evitar que queden residuos de lquido en el exterior de la
punta.
Humectar previamente la punta dos o tres veces mejorar la
precisin de los resultados.
El lquido debe aspirarse lentamente y de forma constante.
Debe permitirse un periodo de espera de 1a 3 seg para que el
lquido se eleve en la punta.

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E-Mail: eppendorf@eppendorf.com Internet: www.eppendorf.es
4. Tcnicas de dispensacin
4.3. Posibilidad y prevencin de contaminacin
Se hace una distincin entre tres posibles fuentes de contaminacin:
De la pipeta a la muestra
De la muestra a la pipeta
De muestra a muestra, tambin conocido como carry over.
La primera fuente de contaminacin es a travs de una punta de
pipeta o una pipeta contaminada. La contaminacin de muestras
se puede evitar utilizando puntas estriles de pipetas y limpiando o
autoclavando la pipeta.
El segundo tipo de contaminacin implica el acceso de la muestra
o sus aerosoles en la pipeta. Para evitarlo, la pipeta debe sostener-
se en vertical durante la aspiracin del lquido. Tambin se reco-
mienda expulsar inmediatamente la punta de la pipeta despus de
usarla para evitar entren aerosoles en la pipeta y tambin colocar
la pipeta suspendida en el soporte de pipetas. Adems, el pulsador
debe elevarse lentamente en la aspiracin.
La proteccin ms efcaz contra la contaminacin de pipetas es
utilizar puntas con fltro. Evitan la posibilidad de que penetren ae-
rosoles y contaminen la pipeta (fg. 8 izquierda). El uso de pipetas
de desplazamiento positivo con puntas que ofrecen un mbolo con
un sello para fugas integrado tambin evita la contaminacin de la
pipeta (fg. 8 izquierda).
El tercer tipo de contaminacin se produce durante la dispensacin
de muestras. El carry over tiene lugar cuando se adhiere parte de la
muestra A a la superfcie interior de la punta de la pipeta en forma
de gotita. Entonces se mezcla con la muestra B, produciendo as
un resultado falso del ensayo (fg. 8 derecha). Para evitar la conta-
minacin muestra a muestra, la punta de la pipeta debe renovarse
despus de dispensar cada muestra .
Fig. 8:
Evitar la contaminacin de una pipeta de mbolo Contaminacin de muestra a muestra
Rest of sample A
in the
pipette tip
Contamination
of
sample B
Piston-stroke
pipette
with
Standard tip
Piston-stroke
pipette
with
Filter tip
Positive-
displacement
with
integrated
piston
in the tip
Protected
area
Aerosol
barrier
Filter
Unprotected
area
Risk of
contamination
via aerosols
No risk of
contamination
via aerosols
Sealing lip
of
piston

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Datos vlidos en la fecha de impresin y salvo error tipogrfco.
5. Calibracin
5.. Procedimiento de ensayo gravimtrico
El requisito previo para un procedimiento de ensayo gravimtrico
es una balanza analtica o un dispositivo de pesado equivalente. El
valor de graduacin de la escala debe corresponder al volumen se-
leccionado del sistema de dispensacin que va a examinarse (tab.
2). Para minimizar la prdida de la evaporacin durante el pesaje,
particularmente con volmenes pequeos (< 50 l), debe utilizarse
un recipiente de pesaje adecuado para el volumen y posiblemente
tambin una salida para la evaporacin (fg. 9).
Adems, deben tenerse en cuenta los siguientes puntos
durante la calibracin gravimtrica:
El ensayo debe realizarse en una sala sin corrientes de aire.
En la sala de ensayos debe haber un exceso de un 50% de
humedad relativa y una temperatura constante (0,5 C) de entre
15 y 30 C.
Antes del ensayo, el sistema de dispensacin y el lquido de
ensayo deben haber estado en vertical el tiempo sufciente en
la sala de ensayos (mn. dos horas) para establecer un equilibrio
con las condiciones de la sala.
Los ciclos del ensayo deben ser lo ms uniformes posibles.
Es importante que el tiempo de medicin sea lo ms idntico
posible dentro de cada ciclo, as como de ciclo a ciclo, para
compensar de forma fable los efectos de la evaporacin durante
una serie de mediciones mediante clculo.
Debe utilizarse agua desgasifcada, destilada o desionizada
como lquido de ensayo.
Con pipetas variables se prueban tres volmenes diferentes:
Volumen nominal (el mayor volumen que puede ajustar
el usuario y establecer el fabricante)
50% del volumen nominal
El lmite inferior del volumen til o el 10% del volumen nominal.
Generalmente se llevan a cabo diez mediciones por volumen de
ensayo. No obstante, el usuario puede alterar el nmero de volme-
nes de ensayo, el nmero de mediciones por volumen de ensayo y,
con pipetas multicanal, el nmero de canales probados de forma
adecuada para que el ensayo satisfaga sus necesidades en cuanto
a precisin.
De acuerdo con el ajuste inicial del fabricante, las pipetas y los
dispensadores deben ser probados para la dispensacin de
lquido de ensayo en un recipiente de pesaje. El procedimiento
de prueba es el siguiente:
El recipiente de pesaje se llena con el lquido de ensayo hasta un
nivel de mn. 3 mm.
Debe medirse la temperatura del lquido, la temperatura de la
sala y la presin del aire. (Las temperaturas y la presin del aire
son necesarios para la seleccin del factor Z de correccin).
La pipeta dispone de la punta de pipeta adecuada, y la punta de
la pipeta humectada previamente cinco veces con el lquido de
ensayo para producir un equilibrio de la humedad en el volumen
justo de aire.
Entonces se cambia la punta y se vuelve a humectar.
La balanza est calibrada.
La pipeta se sostiene verticalmente y la punta de la pipeta est
inmersa unos milmetros (vase la pgina 270, tab. 1) en el
lquido de ensayo.
Debe aspirarse lentamente y de forma constante el volumen que
se desea probar. Aqu debe tenerse en cuenta un periodo de
espera de 1 a 3 seg.
A continuacin, se saca lentamente la punta de la pipeta del
lquido, secndola contra la pared del recipiente.
La punta llenada se inclina contra la pared del recipiente de
pesaje, y el lquido de ensayo se dispensa lentamente hasta el
primer recorrido (recorrido de medicin).
El lquido residual se dispensa presionando el pulsador hasta el
segundo tope (expulsin).
El pulsador se mantiene presionado y la punta contra la pared
del recipiente.
El valor de pesaje, es decir, la masa del lquido pipeteado, se
calcula entonces.
Todas las mediciones en una serie de mediciones se llevan a cabo
tal como se ha descrito.
Fig. 9: calibracin de la pipeta en la balanza analtica con
salida para la evaporacin.
Tabla. : Valores estndar para
ensayos gravimtricos de pipetas
Desviacin
de medicin
aleatoria
(imprecisin)
(l)
Escala
graduacin
valor
(mg)
Tipo de balanza
hasta 0,01 0,001 Microbalanza
hasta 0,01 0,01 Semi-microbalanza
hasta 0,01 0,1 Balanza analtica
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E-Mail: eppendorf@eppendorf.com Internet: www.eppendorf.es
6. Pautas de aplicacin en la manipulacin de lquidos
6.. Descontaminacin y limpieza de pipetas de cmara de aire
Clasifcacin de sustancias Recomendaciones de manipulacin Descontaminacin y limpieza
Soluciones acuosas y tampones La pipeta se calibra con agua destilada.
Los resultados son muy precisos.
Abrir la pipeta, limpiar bien las partes contaminadas con
agua destilada. Dejar secar a un mximo de 60 C en
el compartimento de secado. Lubricar el mbolo si es
necesario.
cidos inorgnicos Es recomendable limpiar de vez en
cuando la parte inferior de la pipeta
con agua destilada si se pipetean con
frecuencia cidos muy concentrados.
Los plsticos utilizados en las pipetas Eppendorf son
resistentes a los cidos, pues son mbolos de cermica
(excepto al cido fuordrico). Sin embargo, los aerosoles
cidos pueden fltrarse en la parte inferior de la pipeta
y afectar al rendimiento de la misma. Limpiar tal como se
ha descrito en Soluciones acuosas.
Alcalinos Es recomendable limpiar de vez en
cuando la parte inferior de la pipeta
con agua destilada si se pipetean con
frecuencia alcalinos muy concentra-
dos. Tambin se recomienda el uso de
puntas con fltro.
Los plsticos utilizados en las pipetas Eppendorf son
resistentes a los alcalinos, pues son mbolos de cermica
(excepto al cido fuordrico). Sin embargo, los aerosoles
de los alcalinos pueden fltrarse en la parte inferior de la
pipeta y afectar al rendimiento de la misma. Limpiar tal
como se ha descrito en Soluciones acuosas.
Lquidos potencialmente
infecciosos
Para evitar la contaminacin, deben
utilizarse puntas con fltro.
Tambin pueden utilizarse sistemas de
desplazamiento positivo.
Autoclavar las partes contaminadas a 121 C durante
20 min (la Eppendorf Reference puede autoclavarse por
completo. Debe desmontarse de antemano desenroscando
dos veces), o sumergir las partes inferiores en desinfectan-
tes normales de laboratorio. Limpiar con agua destilada y
dejar secar tal como se ha descrito.
Cultivos de clulas Para garantizar la esterilidad, deben
utilizarse puntas estriles.
Proceder tal como se ha descrito en
Lquidos potencialmente infecciosos.
Disolventes orgnicos 1. La densidad es diferente a la del
agua. Por eso, es necesario ajustar la
pipeta.

2. El pipeteo debe realizarse con
rapidez debido a la elevada presin de
vapor y a los cambios en el comporta-
miento de humectacin.

3. Una vez fnalizado el pipeteo, abrir la
pipeta y dejar que se evapore el lquido.

Por lo general, este proceso de evaporacin es sufciente
para lquidos con elevada presin de vapor. Tambin se
pueden sumergir las partes contaminadas en detergente,
limpiar bien con agua destilada y secar tal como se ha
descrito antes. Lubricar ligeramente el mbolo.
Soluciones radioactivas Para evitar contaminaciones, deben
utilizarse puntas con fltro. Tambin se
pueden utilizar sistemas de desplaza-
miento positivo.
Abrir la pipeta y colocar las partes contaminadas en
soluciones complejantes o soluciones especiales de
limpieza. Limpiar bien con agua destilada y secar tal
como se ha descrito antes.
Protenas/cidos nucleicos Para evitar contaminaciones, deben
utilizarse puntas con fltro. Tambin se
pueden utilizar sistemas de desplaza-
miento positivo.
1. Protenas: Abrir la pipeta, lavarla bien con detergente.
Lavar y secar tal como se ha descrito.
2. cidos nucleicos: Descontaminar hirviendo en tampn
de glicina/HCL (pH = 2) durante 10 minutos (esto asegura
que no se detecte ADN en gel de agarosa). Lavar bien
con agua destilada y secar tal como se ha descrito antes.
Lubricar ligeramente el mbolo.
3. Limpiar con hipoclorito sdico (5%), lavar bien con agua
destilada y secar tal como se ha descrito antes. Lubricar
ligeramente el mbolo.

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6.3. Conversin de diferentes unidades de presin
Conversin Multiplicar
por
de a
bar Pascal (Pa) 10
5
bar Hectopascal (hPa) 10
3
bar Kilopascal (kPa) 10
2
millibar (mbar) Pascal (Pa) 10
2
millibar (mbar) Hectopascal (hPa) 1
millibar (mbar) Kilopascal (kPa) 0,1
Datos vlidos en la fecha de impresin y salvo error tipogrfco.
6. Pautas de aplicacin en la manipulacin de lquidos
6.. Posibles fuentes de error para el pipeteo con pipetas de cmara de aire
Parmetros que infuyen Efecto*

Puede estar infuenciado por Puede ser reconocido por


Diferencia en la densidad de aire del lquido
que se va a pipetear en comparacin con
la del agua utilizada para el ajuste
hasta 1.0% Reajustar la pipeta (observar
informacin de usuario)
Comparar la densidad del lquido
que se va a pipetear con la del
agua
Diferencia en la presin de vapor del lquido
que se va a pipetear en comparacin con
la del agua utilizada para el ajuste
hasta 2.0% Sufciente humectacin previa de
la punta de la pipeta; observar
EN ISO 8655-6
Empapar punta
Movimiento desigual del mbolo

hasta 0.5% Funcionamiento sin problemas del
mbolo; limpieza y lubricacin del
mbolo
Monitorizar la propia tcnica de
pipeteo
Ritmo desigual y tiempo durante el pipeteo

hasta 1.5% Tcnica constante de pipeteo Se ha sobrepasado el nmero
mximo de errores
Profundidad de inmersin de la punta de
la pipeta y ngulo de manipulacin durante
el pipeteo

hasta 1.0 Sujetar la pipeta en posicin
vertical. Observar la informacin
de usuario o las normas
EN ISO 8655-6
Control visual de la profundidad
de inmersin y el ngulo de
manipulacin
Error al humectar previamente la punta de
la pipeta

hasta 2% Humectacin previa de la punta
de la pipeta
Se ha sobrepasado el nmero
mximo de errores
Error al limpiar la punta de la pipeta contra
la pared del recipiente

hasta 3.0% Limpiar la punta de la pipeta en
la pared del recipiente.
Observar las normas
EN ISO 8655-6
Se ha sobrepasado el nmero
mximo de errores
Puntas de pipeta que pierden

De 0.5% hasta
50%
Utilizacin de puntas de pipeta
originales o recomendadas
Se ha sobrepasado el nmero
mximo de errores o el empapado
de la punta
*
1
Las posibles desviaciones de medicin son valores de referencia y aparecen en porcentajes a partir del valor nominal.
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6. Pautas de aplicacin en la manipulacin de lquidos
6.4. Datos fsicos de los lquidos (ejemplos relevantes)
Sustancia Frmula Punto de
ebullicin (C)
Densidad
mg/l
(0 C)
Presin de vapor
hPa
(0 C)
Viscosidad
mPas
(0 C)
Acetona C
3
H
6
O 56,5 0,79 233 0,32
cido actico CH
3
COOH 118 1,06 15,4 1,53 (25 C)
cido clorhdrico HCl 1,15 213 2
cido cloroactico CH
2
ClCOOH 189 1,60
cido fuordrico HF 112 1,13
cido frmico HCOOH 100,7 1,23 42 1,8
cido fosfrico H
3
PO
4
1,71 2
cido ntrico HNO
3
121,8 1,41 9 1,49 (40 C)
cido sulfrico H
2
SO
4
1,84 0,0016 26,9
cido tricloroactico CCl
3
COOH 196 1,62
Amonaco NH
3
37,7 0,91 500
Butanol C
4
H
9
OH 117,2 0,81 6,7
Cloroformo CHCl
3
61,7 1,47 213
Etanol C
2
H
5
OH 78,5 0,79 59 1,2
Fenol C
6
H
5
OH 181,4 1,06 1,099 (100 C)
Glicerol C
3
H
8
O
3
290 1,26
Metanol CH
3
OH 65 0,79 128 0,597
2-Propanol (alcohol isopropilo) C
3
H
7
OH 82,4 0,78 42,5 2,2
Solucin hidrxido potsico KOH 1,29
Solucin hidrxido sdico NaOH 1,33 19
E-Mail: eppendorf@eppendorf.com Internet: www.eppendorf.es
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6. Pautas de aplicacin en la manipulacin de lquidos
6.5. Resistencia qumica de los consumibles
Sustancia Frmula Concentracin
(%)
PE
(Polietileno)
PP
(Polipropi-
leno)
PC
(Policarbo-
nato)
PS
(Poli-
estireno)
Acetaldehdo CH
3
CHO 40 0 4 2 2 4 4 4 4
cido actico CH
3
COOH 96 1 2 1 2 3 3 3 4
cido fuordrico HF hasta 40 2 2 2 2 4 0 1 1
cido tricloroactico CCl
3
COOH 100 3 4 1 1 2 2 0 0
Aqua regia 4 4 3 4 4 4 3 4
Benceno 100 3 4 3 4 4 4 4 4
Bencina 100 3 4 3 4 2 2 3 4
Butanol C
4
H
9
OH 100 1 3 1 3 1 1 1 1
Diclorometano CH
2
Cl
2
100 4 4 3 4 0 0 0 0
Dioxano C
4
H
8
O
2
100 2 3 3 3 4 4 4 4
ter dietlico (C
2
H
5
)
2
O 100 2 3 3 0 4 4 4 0
ter de petrleo 100 3 3 2 3 2 3 3 3
Fenol C
6
H
5
OH Saturada de agua 1 1 1 1 3 3 3 4
Glicerol C
3
H
5
(OH)
3
1 1 1 1 1 1 1 1
Hipoclrito sdico diluido 2 3 1 2 2 0 2 3
Metanol CH
3
OH 100 2 3 2 2 2 2 1 1
Piridina 100 2 3 3 3 3 3 4 4
Polietilenglicol (PEG) 40 1 1 0 0 0 0 0 0
Solucin hidrxido sdico hasta 40 1 1 1 1 3 3 1 1
*
1
Atencin! Ataca al mbolo de cermica de la pipeta.
Primer nmero: resistencia qumica a 20 C, segundo nmero: a 50 C
1 = Resistente; el material no cambia ni siquiera despus de estar mucho tiempo en contacto con la sustancia correspondiente.
2 = Prcticamente resistente; el material no cambia despus de estar varias semanas en contacto con la sustancia.
3 = Conditionalmente resistente; si el material ha estado en contacto con la sustancia slo durante un corto periodo de tiempo, no cambia.
4 = No resistente; el material cambia incluso tras un breve contacto con la sustancia.
0 = Ningn valor disponible.
Datos vlidos en la fecha de impresin y salvo error tipogrfco.
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6. Puntas de aplicacin en la manipulacin de lquidos
6.6. Lmites de error segn EN ISO 8655
Segn la norma EN ISO 8655, los lmites de error se referen
siempre al sistema formado por la pipeta y la punta de pipeta.
Los lmites de error referidos al volumen nominal son vlidos para el
volumen til total de la pipeta de mbolo, es decir para una
pipeta con mbolo y volumen variable de 10 l a 100 l, el lmite
para los errores sistemticos es de 0,8 l y el lmite para los
errores aleatorios es de 0,3 l para cada volumen medido.
Si el volumen nominal de una pipeta se encuentra entre dos
volmenes nominales de los indicados en la Tabla 1, los lmites
de error absolutos son vlidos para el volumen nominal siguiente.
La frmula para calcular los lmites de error en relacin al
volumen nominal es:
El volumen nominal de una pipeta de mbolo y volumen variable
es el mayor volumen regulable por el usuario y el mayor volumen
establecido por el fabricante.
A continuacin se indican los lmites de error de la norma
EN ISO 8655 en relacin al volumen.
Errores sistemticos: desviaciones del volumen dosifcado
en relacin al volumen nominal o del volumen seleccionado
del aparato con mbolo. El error se calcula haciendo la media
de los valores obtenidos en 10 mediciones.
Errores aleatorios: desviacin de los volmenes dosifcados
en relacin a la media resultante de los volmenes dosifcados,
se obtiene calculando la discrepancia media obtenida en
10 mediciones.
a) Pipetas de mbolo monocanal con cmara de aire
Volumen nominal l 5 0 0 50 00 00 500 .000 .000 5.000 0.000
Lmites de
los errores
sistemticos
l 0,05 0,08 0,125 0,12 0,2 0,5 0,8 1,6 4,0 8,0 16 40 60
Lmites de
los errores
aleatorios
l 0,05 0,04 0,075 0,08 0,1 0,2 0,3 0,6 1,5 3,0 6,0 15,0 30,0
b) Los lmites de los errores sistemticos y aleatorios de las pipetas multicanal con mbolo son el doble de los valores indicados en la tabla
para las pipetas monocanal de mbolo. Esta condicin es vlida para cada canal de la pipeta multicanal de mbolo.
c) Dosifcador mltiple (Multipette)
Volumen nominal ml 0,00 0,00 0,003 0,0 0,0 0,05 0, 0, 0,5 5 0 5 50 00 00
Lmites de
los errores
sistemticos
l 0,05 0,1 0,075 0,2 0,3 0,5 1,0 2,0 5,0 10 16 30 50 125 250 500 1.000
Lmites de
los errores
aleatorios
l 0,05 0,1 0,11 0,25 0,4 0,75 1,0 2,0 3,0 4,0 8,0 15 30 75 125 250 500
d) Dosifcador sencillo (Varispenser)
Volumen nominal ml 0,0 0,0 0,05 0, 0, 0,5 5 0 5 50 00 00
Lmites de
los errores
sistemticos
l 0,2 0,4 0,75 1,5 2,0 5,0 6,0 12 30 60 150 300 600 1.200
Lmites de
los errores
aleatorios
l 0,1 0,1 0,2 0,3 0,6 1,0 2,0 4,0 10 20 50 100 200 400
Lmite de error [l] x 00%
Volumen nominal [l]
E-Mail: eppendorf@eppendorf.com Internet: www.eppendorf.es
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6. Puntas de aplicacin en la manipulacin de lquidos
6.7. Declaracin de conformidad
Resultados analticos seguros en los
laboratorios mdicos requieren precisin
en cada uno de los pasos de trabajo:
comenzando con el pipeteo pasando por
el anlisis hasta llegar a la evaluacin.
Cuanto ms pequeas sean las
tolerancias de errores de cada uno de
los instrumentos, mayor sern la exactitud
y precisin de los resultados.
Para que el laboratorio est desde el inicio
en el lado seguro, existe el certifcado de
conformidad para pipetas y puntas de pipeta.
Este certifcado garantiza que los lmites
de error fjados por la norma EN ISO 8655
no se sobrepasan y que se cumplen las
normativas legales.
Todas las pipetas de la marca Eppendorf se caracterizan por su gran exactitud y precisin.
Para los siguientes productos certifcamos el cumplimiento de las normas de calibracin.
Monocanal de volumen fjo
Research

fx Todos los volmenes


Reference

fx Todos los volmenes


Monocanal de volumen variable
Reference

Todos los volmenes


Research

Todos los volmenes


Research

pro Todos los volmenes


Varipette

480 Todos los volmenes


Varipette

470 En todas las combinaciones


Multicanal
Research

Todos los volmenes


Research

pro Todos los volmenes


Multipette

plus
En combinacin con todos los Combitips

plus
Multipette

Stream/Xstream
En combinacin con todos los Combitips

plus (modo dispensador)


Dispensadores de frasco
Todos los volmenes
Esto es vlido para el equipo formado
por pipetas y puntas de pipeta.
En Eppendorf se puede conseguir todo de
una sola mano. Si bien es verdad que se
pueden utilizar puntas de pipeta de otros
fabricantes, no es menos cierto que la
seguridad slo es posible si se cumplen
los requisitos de las normas EN ISO,
utilizando puntas de pipeta especfcas
para cada pipeta con certifcado de
conformidad. Los usuarios responsables
utilizan el equipo Pipeta-Punta de
pipeta, marcado con la comn seal de
conformidad.
Datos vlidos en la fecha de impresin y salvo error tipogrfco.
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7.000
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r [cm| n [rpm| rcf

max
7. Recomendaciones para la centrifugacin
7.. Tabla de conversin rpm/rcf (nomogramo)
Radio de centrifugacin r de un punto a una distancia h
del fondo del tubo con un rotor de ngulo fjo de 45:
r = r
max
h x 0,71
Ejemplo de aplicacin (bosquejo):
r
max
= 7,2 cm
n = 14.000 1/min
rcf
max
= 16.000 x g
Tenga en cuenta que las centrfugas Eppendorf MiniSpin plus,
5415 D, 5415 R, 5417 C, 5417 R, 5418, 5424, 5430, 5702,
5702 R, 5702 RH, 5804, 5804 R, 5810 y 5810 R tienen
una conversin automtica rpm/fcr, no siendo necesario
realizar clculos complicados, al menos para el rotor
estndar. El radio mximo de la MiniSpin es de 6 cm.
0
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7. Recomendaciones para la centrifugacin
7.. Factores K y tiempos de centrifugacin
El factor K es un valor determinado fundamentalmente por el
rotor y que infuye en el tiempo de sedimentacin.
Coloquialmente hablando, este valor es una medida para el
tramo de sedimentacin en el tubo de centrifugacin, es decir,
para la diferencia entre la distancia mnima y mxima de una
muestra respecto al eje del rotor. Cuanto ms grande es este
tramo, mayor es el tiempo necesario para la separacin en el tubo.
Es evidente que el factor K depende del ngulo de los tubos
en el rotor y de los tubos analizados. Un factor K pequeo es til
para una separacin ms rpida. El factor K est infuenciado
adems por el nmero de revoluciones. Cuanto mayor sea este
nmero, ms rpida ser la separacin.
La frmula es:
n = Velocidad; r
min
y r
max
: ver la fgura
La frmula para el clculo
del tiempo de centrifugacin relativo es:
t = tiempo de centrifugacin calculado experimentalmente
en la centrfuga de comparacin
t
x = tiempo de centrifugacin necesario en la centrfuga X
k = factor K de la centrfuga de comparacin
k
x = factor K de la centrfuga X
La comparacin directa de rendimiento entre dos rotores es
posible, si se calcula la velocidad relativa de una separacin
en ambos rotores.
Ejemplo:
El rotor de ngulo fjo de 30 posiciones de la centrfuga 5417 C
5417 R tiene un factor K de 377 (con microtubo Safe-Lock
de Eppendorf de 1,5 ml) a un nmero de revoluciones mximo
de 14.000 min-1 y a una fuerza de centrifugacin relativa de
20.800 x g. Con el mismo microtubo y el mismo ngulo de rotor
(45), el rotor de ngulo fjo de 18 posiciones de la centrfuga
5415 C alcanza con el mismo nmero de revoluciones mximo
(14.000 min-1) una fuerza de centrifugacin relativa de 16.000 x g
y un factor K de 525.
En el ejemplo de la 5417 C y 5415 C resulta un tiempo de
centrifugacin de 10 minutos para la 5415 C y un tiempo
de centrifugacin de slo 7 minutos para la 5417 C para lograr
el mismo rendimiento de separacin.
Para establecer el tiempo de centrifugacin, es conveniente tener
tambin en cuenta las caractersticas fsicas de la centrfuga a
utilizar, especialmente cuando se vayan a centrifugar muestras
crticas y cantidades pequeas de muestras.
Separation example:
Datos vlidos en la fecha de impresin y salvo error tipogrfco.

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Index: Practical information for Molecular Biology
E-Mail: eppendorf@eppendorf.com Internet: www.eppendorf.es
Description Page
II. Practical information for Molecular Biology: data, facts, tips and tricks
. Abbreviations, symbols, conversion factors and data
1.1. Metric prefxes 8
1.2. Abbreviations and symbols 8
1.3. Tris-HCl Buffer, pH-Values 8
1.4. Nucleic acid conversions 8
1.4.1. Conversion of weight to absolute quantity (mol) 8
1.4.2. Conversion of absolute quantity (mol) to weight 8
1.4.3. Molecular weight of DNA fragments 83
1.4.4. Molecular weights for nucleotides 83
1.5. Protein conversions 83
1.5.1. Conversion of proteins to DNA length 83
1.5.2. Conversion of absolute quantity (mol) to weight 83
1.6. DNA content of various organisms 83
. Genetic code, properties and molecular structure of amino acids
2.1. Genetic code 84
2.2. Nomenclature and properties of amino acids 84
2.3. Molecular structure of amino acids 85
3. Detection of nucleic acids and proteins
3.1. Electrophoretic resolution 86
3.1.1. Recommended agarose gel percentages for resolution of DNA 86
3.1.2. Recommended polyacrylamide gel percentages for resolution of DNA 86
3.1.3. Recommended polyacrylamide gel percentages for resolution of proteins 86
3.2. Dye migration in electrophoresis 86
3.2.1. Dye migration in polyacrylamide nondenaturing gels 86
3.2.2. Dye migration in polyacrylamide denaturing gels 86
3.3. Spectrophotometric conversion of nucleic acids and proteins 87
3.3.1. Physical properties of nucleotides 87
3.3.2. Biophysical data for deoxynucleoside triphosphates 87
3.3.3. Conversion to concentration (g/ml) 87
3.3.4. Quantifcation made easy 88
4. Application tips for PCR
4.1. Procedure and conditions for the PCR 89
4.2. Calculating primer quantity 9
4.2.1. Conversion to absolute quantity (in pmol) 9
4.2.2. Conversion to weight (in g) 9
4.2.3. Calculating the molar concentration of the primer 9
4.3. Using gradient PCR to optimize different reaction parameters 9
4.4. Eppendorf

thermal cycler and SteadySlope

technology 93
4.5. Optimization of the Primer concentration (Primer-Matrix) 94
PCR disclaimers 94

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Datos vlidos en la fecha de impresin y salvo error tipogrfco.
.4. Nucleic acid conversions
.4.. Conversion of weight to absolute quantity (mol)
1 g of 1,000 bp DNA = 1.52 pmol = 9.1 x 10
11
molecules
1 g of pUC18/19 DNA (2,686 bp) = 0.57 pmol = 3.4 x 10
11
molecules
1 g of pBR322 DNA (4,361 bp) = 0.35 pmol = 2.1 x 10
11
molecules
1 g of M13mp18/19 DNA (7,250 bp) = 0.21 pmol = 1.3 x 10
11
molecules
1 g of l-DNA (48,502 bp) = 0.03 pmol = 1.8 x 10
10
molecules
.4.. Conversion of absolute quantity (mol) to weight
1 pmol of 1000 bp DNA = 0.66 g
1 pmol of pUC18/19 DNA (2,686 bp) = 1.77 g
1 pmol of pBR 322 DNA (4,361 bp) = 2.88 g
1 pmol of M13mp18/19 DNA (7,250 bp) = 4.78 g
1 pmol of l-DNA (48,502 bp) = 32.01 g
1. Abbreviations, symbols, conversion factors and data
.. Abbreviations and symbols
ds double-stranded (as in dsDNA)
ss single-stranded (as in ssDNA)
bp base pair
kb kilobase: 1,000 bases or base pairs, as appropriate
nt Nucleotides (base)
Mb megabase: 1,000,000 bp
Da Dalton, the unit of molecular mass;
kDa = 1,000 Da, MDa = 1,000,000 Da.
MW molecular weight (g/mol)
M Molar or molarity, moles of solute
per liter of solution (mol/L)
mol Mole, absolute amount of a substance
(1 mol = 6.023 x 10E23, Avogadro number)
l wavelength
l
max
wavelength at the absorption maximum
.3. Tris-HCl buffer, pH values
5 C 7.76 7.89 7.97 8.07 8.18 8.26 8.37 8.48 8.58 8.68 8.78 8.88 8.98 9.09 9.18 9.28
5 C 7.20 7.30 7.40 7.50 7.60 7.70 7.80 7.90 8.00 8.10 8.20 8.30 8.40 8.50 8.60 8.70
37 C 6.91 7.02 7.12 7.22 7.30 7.40 7.52 7.62 7.71 7.80 7.91 8.01 8.10 8.22 8.31 8.42
.. Metric prefxes
E = exa = 10
18
P = peta = 10
15
T = terra = 10
12
G = giga = 10
9
M = mega = 10
6

k = kilo = 10
3
h = hecto = 10
2
da = deca = 10
1
d = deci = 10
-1
c = centi = 10
-2
m = milli = 10
-3
= micro = 10
-6
n = nano = 10
-9
p = pico = 10
-12
f = femto = 10
-15
a = atto = 10
-18
z = zepto = 10
-21
3
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E-Mail: eppendorf@eppendorf.com Internet: www.eppendorf.es
1. Abbreviations, symbols, conversion factors and data
.4.3. Molecular weight of DNA fragments
500 bp dsDNA = 325,000 Da
500 nt (nukleotide) ssDNA = 162,500 Da
1 kb dsDNA = 660,000 Da
1 kb ssDNA = 330,000 Da
1 kb ssRNA = 340,000 Da
1 MDa dsDNA = 1.52 kb
Average molecular weight of dNMP = 325 Da
Average molecular weight of
DNA base pair
= 650 Da
.4.4. Molecular weights for nucleotides
Compound Molecular weight (in Dalton)
ATP 507.2
CTP 483.2
GTP 523.2
UTP 484.2
dATP 491.2
dCTP 467.2
dGTP 507.2
dTTP 482.2
AMP 347.2
CMP 323.2
GMP 363.2
UMP 324.2
dAMP 312.2
dCMP 288.2
dGMP 328.2
dTMP 303.2
.5. Protein conversions
.5.. Conversion of proteins to DNA length
Protein with a molecular weight of 10,000 = 270 bp DNA
Protein with a molecular weight of 30,000 = 810 bp DNA
Protein with a molecular weight of 37,000 (corresponds to 333 amino acids) = 1,000 bp DNA
Protein with a molecular weight of 50,000 = 1.35 kb DNA
Protein with a molecular weight of 100,000 = 2.7 kb DNA
.5.. Conversion of absolute quantity (mol) to weight
100 pmoles of 100,000 Da protein = 10 g
100 pmoles of 50,000 Da protein = 5 g
100 pmoles of 10,000 Da protein = 1 g
.6. DNA content of various organisms
Organism DNA content (in bp) (haploid Genome)
Escherichia coli 4.2 x 10
6
Arabidopsis thaliana 4.7 x 10
6
Saccharomyces cerevisiae 1.4 x 10
7
Drosophila melanogaster 1.4 x 10
8
Homo sapiens 3.3 x 10
9
Triticum aestivum (hexaploid wheat) 1.7 x 10
10
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U C A G
U U
C
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C U
C
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G U
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2. Genetic code, properties and molecular structure of amino acids
Termination codons:
UAA: ochre
UAG: amber
UGA: opal
.. Nomenclature and properties of amino acids
Amino acid 3-letter symbol -letter symbol Major properties of side chains
Alanine Ala A Aliphatic
Arginine Arg R Basic group
Asparagine Asn N Amide group
Aspartic acid Asp D Acidic group
Cysteine Cys C Sulfur-containing
Glutamic Acid Glu E Acidic group
Glutamine Gln Q Amide group
Glycine Gly G No side chain
Histidine His H Imidazole group
Isoleucine Ile I Aliphatic
Leucine Leu L Aliphatic
Lysine Lys K Basic group
Methionine Met M Sulfur-containing
Phenylalanine Phe F Aromatic group
Proline Pro P Aliphatic
Serine Ser S Hydroxyl group
Threonine Thr T Hydroxyl group
Tryptophan Trp W Aromatic group
Tyrosine Tyr Y Aromatic group
Valine Val V Aliphatic
Datos vlidos en la fecha de impresin y salvo error tipogrfco.
.. Genetic code

nd
Codon position

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U C A G
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U UUU Phe UCU Ser UAU Try UGU Cys U
UUC UCC UAC UGC C
UUA Leu UCA UAA Stop UGA Stop A
UUG UCG UAG Stop UGG Trp G
C CUU Leu CCU Pro CAU His CGU Arg U
CUC CCC CAC CGC C
CUA CCA CAA Gln CGA A
CUG CCG CAG CGG G
A AUU Ile ACU Thr AAU Asn AGU Ser U
AUC ACC AAC AGC C
AUA ACA AAA Lys AGA Arg A
AUG
Met, Start
ACG AAG AGG G
G GUU Val GCU Ala GAU Asp GGU Gly U
GUC GCC GAC GGC C
GUA GCA GAA Glu GGA A
GUG GCG GAG GGG G
In yeast mitochondria, the AUA
and UGA codons are used
for Met and Trp, not for Ile and
Stop as normally.
Start codon:
AUG: Methionine
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CH COO
-
H3N
+
(CH2j3
NH
C
NH2
NH2
+

""

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CH
SH
COO
-
H3N
+
CH2
CH
C
COO
-
H3N
+
(CH2j2
NH2
O

""

""

""

""

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""

CH
NH3
+
COO
-
H3N
+
(CH2j4
S
COO
-
H3N
+
(CH2j2
CH3
""

""

"
""

""

"
""

""

"

""


2. Genetic code, properties and molecular structure of amino acids
.3. Molecular structure of amino acids
Alanine
(Ala)
Arginine
(Arg)
Asparagine
(Asn)
Aspartic acid
(Asp)
Cysteine
(Cys)
Glutamine
(Gln)
Glutamic acid
(Glu)
Glycine
(Gly)
Histidine
(His)
Isoleucine
(Ile)
Leucine
(Leu)
Lysine
(Lys)
Methionine
(Met)
Phenylalanine
(Phe)
Proline
(Pro)
Serine
(Ser)
Threonine
(Thr)
Tryptophan
(Trp)
Tyrosine
(Tyr)
Valine
(Val)
E-Mail: eppendorf@eppendorf.com Internet: www.eppendorf.es
6
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3. Detection of nucleic acids and proteins
3.. Electrophoretic resolution
3... Recommended polyacrylamide gel percentages
for resolution of DNA
Gel percentage DNA size range
3.5% 1,0002,000 bp
5.0% 75500 bp
8.0% 50400 bp
12.0% 35250 bp
15.0% 20150 bp
20.0% 5100 bp
3.. Dye migration in electrophoresis
3... Dye migration in polyacryamide denaturing gels
Gel percentage Bromophenol blue Xylene cyanol
5.0% 35 nucleotides 130 nucleotides
6.0% 26 nucleotides 106 nucleotides
8.0% 19 nucleotides 75 nucleotides
10.0% 12 nucleotides 55 nucleotides
20.0% 8 nucleotides 28 nucleotides
3... Recommended agarose gel percentages
for resolution of DNA
Gel percentage DNA size range
0.5% 130 kb
0.7% 0.812 kb
1.0% 0.510 kb
1.2% 0.47 kb
1.5% 0.23 kb
34% sieved agarose 0.011 kb
3... Dye migration in polyacryamide nondenaturing gels
Gel percentage Bromophenol blue Xylene cyanol
3.5% 100 bp 460 bp
5.0% 65 bp 260 bp
8.0% 45 bp 160 bp
12.0% 20 bp 70 bp
15.0% 15 bp 60 bp
20.0% 12 bp 45 bp
Datos vlidos en la fecha de impresin y salvo error tipogrfco.
3..3. Recommended polyacrylamide gel percentages for
resolution of proteins
Gel percentage Protein size range
5% 57 212 kDa
7.5% 36 94 kDa
10% 16 68 kDa
15% 12 43 kDa
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45
40
35
30
25
20
15
10
5
0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0
dsDNA
RNA
ssDNA
3.3.3. Conversion to concentration (g/ml)
Double-stranded DNA (dsDNA):
A
260
= OD
260
= 1 for a 50 g/ml dsDNA-solution*
Single-stranded RNA:
A
260
= OD
260
= 1 for a 40 g/ml RNA-solution*
Single-stranded DNA (ssDNA):
A
260
= OD
260
= 1 for a 33 g/ml ssDNA-solution*
Absorbance is calculated as:
Molar extinction coeffcient x concentration x path length
(usually cuvette width)
* These values apply when using a neutral-to-light alkaline measuring medium and
a cuvette optical path length of 1 cm.
E-Mail: eppendorf@eppendorf.com Internet: www.eppendorf.es
3. Photometric detection of nucleic acids and proteins
3.3. Spectrophotometric conversion of nucleic acids and proteins
3.3.. Biophysical data for deoxynucleoside triphosphates
Component Molecular weight (Daltons) Molar extinction coeffcient and l max
dATP 491 15,200 at 259 nm
dCTP 467 9,300 at 271 nm
dGTP 507 13,700 at 253 nm
dTTP 482 9,600 at 267 nm
3.3.. Physical properties of nucleotides
Compound Molecular weight l max (pH 7,0) Absorbance at l max
of a M solution (pH 7.0)
ATP 507.2 259 nm 15,400
CTP 483.2 271 nm 9,000
GTP 523.2 253 nm 13,700
UTP 484.2 260 nm 10,000
dATP 491.2 259 nm 15,400
dCTP 467.2 272 nm 9,100
dGTP 507.2 253 nm 13,700
dTTP 482.2 267 nm 9,600
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3. Photometric detection of nucleic acids and proteins
3.3.4. Quantifcation made easy
With the aid of spectroscopy, the quantitative analysis of nucleic
acids and proteins has established itself as a routine method in
many laboratories. It includes absorption measurements in the
ultraviolet and visible ranges. Proteins are measured (directly)
at 280 nm and nucleic acids at 260 nm; colorimetric protein
determination is performed in the 550 nm to 600 nm range.
The Eppendorf

BioPhotometer offers the following preinstalled


test procedures:
. Nucleic acid determination
DNA, RNA, oligonucleotides and even mononucleotides can be
measured directly in aqueous solutions. Aqueous buffers with
low ion concentrations (e.g., TE buffer) are ideal for this method.
The concentration is determined by measuring at 260 nm against
a blank and then calculating via a factor. Normally, the user has
to calculate the concentration of the measured sample using the
appropriate factor. The BioPhotometer can change these factors
easily and will do all necessary calculations.
The absorption of 1 OD at 260 nm is equivalent to approximately
50 g/ml dsDNA, 37 g/ml ssDNA, 40 g/ml RNA or 30 g/ml
for oligonucleotides. Purity determination of DNA interference by
contaminants can be recognized by ratio calculations. The ratio
A
260
/A
280
is used to estimate the purity of nucleic acid since proteins
absorb at 280 nm. Pure DNA should have a ratio of approximately
1.8, whereas pure RNA should give a ratio of approximately 2.0.
Absorption at 230 nm refects contamination of the sample by
substances such as carbohydrates, peptides, phenols or aromatic
compounds. In the case of pure samples, the ratio A
260
/A
230
should
be > 2.0.
. Protein determination
The protein content of a sample can be determined by various
analytical procedures using the BioPhotometer. Calculations
can be performed via factor or via a calibration curve with up
to 10 standards.
. Absorption measurement at 80 nm (A
80
)
A
280
method may be used in concentrations of up to approximately
4 mg/ml (3.0 A). This method is simple and rapid, but it may be
disturbed by the parallel absorption of nonproteins (e.g., DNA).
Unlike the colorimetric process, this method is less sensitive,
requires higher protein concentrations and should thus be used
with pure protein solutions. In addition to the direct absorbance
display, evaluation is possible with the BioPhotometer via the
Warburg formula or against a standard.
. Colorimetric determination (dye tests)
Protein samples often consist of a complex mixture of many
different proteins. The quantitative detection of the protein
content is usually based on the reaction shown by functional
groups of the proteins to dye-forming reagents. The intensity
of the dye correlates directly with the concentration of the
reacting groups and can be measured exactly. Different methods
for dye-quantifcation are available depending on the type of dye
being used:
.. Lowry assay
Specialist literature contains a multitude of modifcations for the
Lowry assay. The principal goal is to reduce the high susceptibility
to interference. In comparison to the pure Biuret assay, the
sensitivity of this assay is greatly increased. However, the Lowry
method is adversely affected by a wide range of nonproteins.
Additives such as EDTA, ammonia sulfate or Triton

X-100,
in particular, are incompatible with the test.
.. Bicinchoninine acid assay (BCA)
This test represents a highly regarded alternative to the Lowry
assay. It is easier to perform, sensitivity can be varied using
different temperatures and the dye complex is very stable.
In addition, its sensitivity to detergents is similar to that of the
Lowry method. This test is also highly susceptible to interference.
..3 Bradford assay
This most rapid and easiest method to use is twice as sensitive as
the Lowry or BCA tests and is thus the most sensitive quantitative
dye assay. Its additional advantage is that a number of reducing
substances (e.g., DTT and mercaptoethanol), which interfere
with the Lowry or BCA test, have no adverse effect on results; ho-
wever, it is sensitive to several detergents. The main disadvantage
is that identical amounts of different standard proteins can cause
considerable differences in the resulting absorption coeffcients.
3. Bacterial cell density
The density of bacterial suspensions may be measured
photometrically at OD600 without adding dyes. This applies,
for example, to the preparation of competent cells, which
must be in a specifc phase of growth.
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E-Mail: eppendorf@eppendorf.com Internet: www.eppendorf.es
4. Application tips for PCR
4.. Procedure and parameters for PCR
This PCR table is intended to provide all PCR newcomers with an
overview of the common rules and concentrations that should be
observed when developing their experiments.
There are, of course, a number of exceptions and special points
that we are unable to accommodate in the table.
We invite you to send us any comments or tips of general interest on this topic. References: Sambrook, J., Fritsch EF., Maniatis T. Molecular cloning, 2nd ed. New York;
Cold Spring Harbor Laboratory Press: 1989
Steps Basic rules Comments

No. of source molecules No. of cycles Do only perform as many cycles as necessary
to obtain suffcient PCR product. With too many
cycles the formation of unspecifc products may
occur.
For calculation of molecule number please refer
to table 1.4.1 and 1.4.2 on page 282
10
5
2530
10
4
3035
No. of cycles 10
3
3540
50 and less 2030 followed by a second
PCR with nested primers,
i. e. with a primer pair that
binds between the frst
two primers of the target
sequence

95 C for 30 s or 97 C for 15 s
For complex templates (e.g. genomic DNA) begin with
an initial denaturation for 23 min before the actual
cycles
G/C content greater than 50% increases the
denaturation temperature
Ineffcient denaturation is a frequent cause
of errors. However:
T Taq at 92.5 C = 2 h
T Taq at 95.0 C = 40 min
T Taq at 97.5 C = 5 min
(T = half life of Taq at a specifc temperature)
Denaturation step
3
For standard primers
(approx. 20 nucleotides [nt]; 1 M; 100% match)
Approx. 20 s, T
m
should be approx. 55-72C
Low concentrations and long primers extend
necessary annealing times. The optimal an-
nealing temperature is normally 5-10C lower
than the primer melting temperature (T
m
). The
T
m
value can be calculated using the following
formulas:
T
m
= (A+T) x 2 + (C+G) x 4 [Wallace],
up to approx. 20 nt
T
m
= 81.5 C + 16.6 (log[Na
+
]) + 0.41 (%G+C)
(500/n) 0.61 (%FA) [Meinkoth and Wahl];
FA = Formamide
Annealing step
4
1 kb require approx. 1 min The shorter the fragment, the easier it is to
control the reaction
200500 bp fragments are suffcient for
most detection reactions
Elongation step
5
Initial denaturation: 2 min 94 C
Denaturation: 0.5 min 94 C
Annealing: 0.5 min 5068 C 2535 cycles
Elongation: 1 min/kb 72 C
Final elongation: 10 min 72 C
Basic thermo cycling
protocol
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Datos vlidos en la fecha de impresin y salvo error tipogrfco.
4. Application tips for PCR
4.. Procedure and parameters for PCR
Reagents Basic rules Comments

Buffers
The most common components (as 10x buffers):
500 mM KCl
100 mM Tris-HCl, pH 8.3 (at 25 C) or 150200 mM
(NH
4
)
2
SO
4
with 500750 mM Tris-HCl, pH 9 (at 25 C)
12% Triton

X-100 or 0.1% Tween

1015 mM Mg
2+
(usually available separately)
The buffers delivered with the polymerase
are specially tailored to this variety, and it
is often not possible to use them with
enzymes from other manufacturers
NaCl concentrations greater than 50 mM
inhibit the Taq polymerase
Mg
2+
must be added (if not present in
buffer) as Mg
2+
is essential as a cofactor
for the DNA polymerase

Mg
+
0.53.5 mM in the assay
Essential as a cofactor of the DNA polymerase
If dUTP is used instead of dTTP, the Mg
2+

concentration usually must be increased
(max. 5 mM).
Concentration too high: promotes the
amplifcation of nonspecifc fragments
(smears appear); increases the melting
temperature
Concentration too low: reduces
annealing effciency and the synthesis rate
of the polymerase

Taq Polymerase
0.5 - 2.5 units per PCR reaction Concentration too high: reduced specifcity
Concentration too low: reduced effciency
Please see step 2, Denaturation step

dNTP
Storage in 10 mM, pH 7.0 aliquots
20200 M in the assay
Concentration too high: leads to mispriming
and the misincorporation of nucleotides
Following a successful PCR, theoretically
the major part of the dNTPs are left over
All nucleotides must have the same
concentration
Modifed nucleotides must have a higher
concentration

Primer
0.11 M in the assay
Length: approx. 1530 nt

Secondary structures should not be able to
form (Stemloop, Hairpin)
Primer must not be complementary at the
3 ends, as this will lead to the formation
of primer-dimers
Both primers should have the same T
m
No stretches of individual nucleotides
G or C at the 3 end improves binding
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4. Application tips for PCR
4.. Calculating primer quantity
4... Conversion to absolute quantity (in pmole)
Primer in pmole =
Weight in g x 1,000,000
Length x 327
Example: 0.1 g of 20 oligomer:
0.1 x 1,000,000
= 15.3 pmole primer
20 x 327
4..3. Calculation of the molar concentration of the primer
Micromolar concentration of primer = pmol/l
Example Example
20 pmol of primer in 100 l PCR mixture = 0.20 micromolar (M) Primer is 24 nucleotides in length and is dissolved in 0.1 ml of water
A 10 l aliquot is diluted to 1.0 ml for A
260
measurement: A
260
= 0.76.
The stock solution has an absorbance at 260 nm (A
260
) of 76.
The stock solution (0.1 ml) contains 2.6 A
260
units.
The base composition of the primer is:
A = 6
C = 6
G = 6
T = 6
The Molar Extinction Coeffcient at 260 nm for the primer = k (15,200) + l (12,010) + m (7,050) + n (8,400) where:
k = number of As
m = number of Gs
l = number of Cs
n = number of Ts
The Molar Extinction of the PCR primer = 6 (15,200) + 6 (12,010) + 6 (7,050) + 6 (8,400) = 255,960a
The Molar concentration of the PCR primer stock solution is
76
= 297 micromolar
255,960
For more information on DNA quantifcation, see page 88.
4... Conversion to weight (in g)
Weight in g =
pmol x Length x 327
1,000,000
Example: 10 pmol of 25 oligomer:
10 x 25 x 327
= 0.081 g primer
1,000,000
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300 bp
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
53 C 67 C
4.3. La PCR de gradientes para optimizar diferentes parmetros de reaccin
4. Application tips for PCR
La PCR en gradientes es una tcnica que permite determinar
empricamente las condiciones ptimas para la PCR dando los
menos pasos posibles. Esta optimizacin puede obtenerse a
menudo mediante un solo ensayo. Tanto el termociclador del
nuevo sistema Mastercycler ep como el clsico de la serie
Mastercycler ofrecen una funcin de gradiente que permite
llevar a cabo, durante una nica sesin, el anlisis de hasta
12 24 temperaturas diferentes de anillamiento, elongacin y/o
desnaturalizacin. Durante la misma sesin es posible adems
chequear una serie de otros parmetros de reaccin, fla por fla.
Durante la amplifcacin de un fragmento especfco de ADN es
posible que se produzcan problemas en el trabajo cotidiano de
laboratorio. A menudo se generan despus de la reaccin PCR
bandas secundarias no especfcas que difcultan o imposibilitan
otras aplicaciones posteriores o bien la evaluacin correcta del
resultado de la PCR. En estos casos debe llevarse a cabo una
optimizacin de las condiciones PCR.
l
Fig. : Determinacin de la temperatura ideal de anillamiento.
Temperatura de anillamiento
La seleccin de la temperatura de anillamiento es, en este
proceso, el componente ms crtico para la optimizacin de la
especifcidad de una reaccin PCR. En la mayora de los casos
debe comprobarse este parmetro empricamente.
La formacin de bandas secundarias no especfcas demuestra
que la temperatura ptima es a menudo muy superior a la
calculada (hasta 12 C ms).
Los termocicladores con gradiente de Eppendorf permiten
comprobar rpidamente las condiciones ptimas de temperatura
en un solo bloque y ensayo. Durante la fase de anillamiento se
genera un gradiente de 12 24 temperaturas que aumentan
gradualmente a lo largo del termobloque. Al mismo tiempo todas
las flas, cada una con 8 16 pocillos, presentan una perfecta
homogeneidad de temperaturas, de forma que tambin es posible
comprobar al mismo tiempo los componentes de la reaccin como
las cantidades de enzimas, cebadores y moldes de ADN.
Temperatura de desnaturalizacin y elongacin
La temperatura de desnaturalizacin para la mayora de las
muestras de ADN se encuentra entre los 94 C y 96 C.
Dependiendo del contenido en GC, de la complejidad y de la
estructura, el punto de fusin especfco de un fragmento de
ADN puede estar por encima o debajo de este rango. Por otro
lado, la temperatura, o bien el tiempo de permanencia deben
mantenerse sufcientemente bajos con el fn de reducir lo menos
posible la actividad de la polimerasa. En estos casos se simplifca
considerablemente la determinacin de la temperatura ptima
de desnaturalizacin mediante los Mastercycler gradient. Para
ello se ajusta un gradiente entre 90 C y 99 C, de modo que
sea posible determinar empricamente la temperatura de des-
naturalizacin menor posible que permita el mayor rendimiento
de ADN amplifcado.
En la mayora de las aplicaciones estndar con Taq polimerasa
no se requiere una optimizacin. No es as en protocolos ms
complejos, por ejemplo, en la amplifcacin de largos fragmentos
con una mezcla de diferentes polimerasas. En este caso la optimi-
zacin de la temperatura de elongacin puede desempear un
papel muy importante, ya que la temperatura ideal de los enzimas
Taq polimerasa y proof reading puede variar considerablemente.
l
Fig. : Registro termogrfco del termobloque del
Mastercycler gradient.
Datos vlidos en la fecha de impresin y salvo error tipogrfco.
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4. Application tips for PCR
4.4. Eppendorf Thermocycler: control de temperatura es sinnimo de calidad
Homogeneidad de las flas en el modo gradiente
Mediante la tecnologa de triple circuito se dispone de una zona de
calentamiento y refrigeracin adicional, garantizando as un control
preciso de la temperatura para todos los perfles de gradientes.
l
Control adicional de la temperatura mediante TCT
Caractersticas del control de la temperatura
Las caractersticas del control de la temperatura infuyen notable-
mente en la calidad del resultado, es decir el perfl de las
temperaturas y la velocidad con la que se lleva a cabo el cambio
de temperatura de los ensayos (el calentamiento y el enfriamiento
entre los distintos pasos de la PCR).
La aplicacin PCR ms conocida, que indica la importancia de
una velocidad de control de la temperatura constante, es el
anlisis del ADN polimrfco amplifcado al azar (random amplifed
polymorphic DNA analysis, RAPD) para detectar polimorfsmos
en el marco de investigaciones de la huella gentica del ADN.
Los cambios en la velocidad de control de la temperatura alteran
la muestra de bandas resultante, al igual que las imprecisiones
trmicas difcultan la interpretacin de los resultados obtenidos.
Para que el ciclador de gradiente transmita con xito los proto-
colos PCR del modo gradiente al modo normal, la temperatura
se tiene que desarrollar en ambos modos de la forma ms similar
posible. Con la tcnica de pendiente constante SteadySlope de
Eppendorf se cumple este requisito: tambin en el modo gradiente
se alcanza la temperatura con la misma caracterstica, es decir
cada temperatura a la velocidad ptima. Para las aplicaciones
PCR estndar, la velocidad mayor posible es siempre la mejor
para una ptima especifcidad. sta est claramente defnida y
tambin se reproduce 1:1 en el modo normal. As se garantiza la
transmisin segura entre los dos modos de servicio y se excluye
una reduccin de la ganancia o de la especifcidad debido a
las diferentes caractersticas de la temperatura, y se asegura
una transferencia sin problemas de las condiciones de reaccin
obtenidas del modo gradiente al normal.
Control del bloque y control del tubo
El control del bloque es el modo de servicio para largas incu-
baciones estticas. Para tiempos de incubacin cortos, como
es el caso durante la PCR, el tiempo programado y el tiempo de
sometimiento real a la temperatura seleccionada en la mezcla
de reaccin pueden diferir, por el contrario, considerablemente.
El control del tubo compensa automticamente este tiempo
cuidando que la mezcla de reaccin se mantenga durante todo
el tiempo a la temperatura por usted indicada, tal y como usted
la ha programado. El algoritmo altamente desarrollado de la
familia Mastercycler garantiza que este principio sea vlido para
todos los tipos de tubos usados permitindole emplear todo el
bloque para sus ensayos.
Tecnologa SteadySlope
de Eppendorf: curva de la
temperatura constante en el
modo gradiente
Equipo de otra marca con
caracterstica dinmica:
caracterstica variable del
control de temperatura
(diferentes velocidades de
refrigeracin) en el modo
gradiente
E-Mail: eppendorf@eppendorf.com Internet: www.eppendorf.es
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PCR disclaimers
Eppendorf Mastercycler

family
Practice of the patented polymerase chain reaction (PCR)
process requires a license. The Mastercycler is an Authorized
Thermal Cycler and may be used with PCR licenses available
from Applied Biosystems. Its use with Authorized Reagents
also provides a limited PCR license in accordance with the
label rights accompanying such reagent
Real-Time PCR
Practice of the patented polymerase chain reaction (PCR) process
requires a license. The Eppendorf [or appropriate trademark]
Thermal Cycler is an Authorized Thermal Cycler and may be used
with PCR licenses available from Applied Biosystems. Its use
with Authorized Reagents also provides a limited PCR license in
accordance with the label rights accompanying such reagents. This
is a Licensed Real-Time Thermal Cycler under Appleras United
States Patent No. 6,814,934 and corresponding claims in non-U.S.
counterparts thereof, for use in research and for all other applied
felds except human in vitro diagnostics. No right is conveyed ex-
pressly, by implication or by estoppel under any other patent claim.
Combinacin tpica de primeres directo y reverso para una Matriz de primers.
Forward
50 nM 00 nM 300 nM 600 nM 900 nM
R
e
v
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r
s
e
50 nM 50/50 100/50 300/50 600/50 900/50
00 nM 50/100 100/100 300/100 600/100 900/100
300 nM 50/300 100/300 300/300 600/300 900/300
600 nM 50/600 100/600 300/600 600/600 900/600
900 nM 50/900 100/900 300/900 600/900 900/900
4. Application tips for PCR
Para encontrar la combinacin ptima de concentraciones para los
primers es recomendable construir una matriz de primers que ab-
arque un rango de concentraciones empleadas habitualmente para
los primers directo y reverso. Normalmente se usa un rango de
50-900 nM. En la tabla 1 se muestra una matriz de primers tpica.
Para conseguir unos resultados fables, cada combinacin debera
usarse por triplicado y con controles negativos adicionales.
4.5. Optimizacin de la concentracin de Primers
(Matriz de Primers)