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DIAGNOSTICO DE LA INFECCION POR EL VIRUS DE LA INMUNODEFICIENCIA HUMANA: DONDE ESTAMOS Y PARA DONDE VAMOS

Dra. Victoria Ins Bedoya E

MICROSCOPIA ELECTRNICA

AISLAMIENTO VIH

OBJETIVOS DE LAS PRUEBAS 1. Tamizaje 2. Confirmacin 3. Seguimiento

PRUEBAS DE TAMIZAJE
Deteccin de anticuerpo ELISA, deteccin de Ag p24, aglutinacin y Dot Blot

ELISA DE PRIMERA GENERACION


Ag extrado de lisados virales.

Cultivo infectado Agente ltico

LISIS CELULAR

PURIFICACIN DE PROTEINAS

INCONVENIENTE: Antgenos con protenas del sistema celular donde fue cultivado, reacciones inespecficas Pruebas confirmatorias

ELISA SEGUNDA GENERACION


Antgenos virales son pptidos recombinantes/sintticos de VIH-1 y VIH-2, Mayor sensibilidad y especificidad Detectan antgenos individuales

ELISA TERCERA GENERACION


Divergencia gentica

Subtipos

Antigeno VIH-1 del grupo O (outlayer o marginal) Mayor sensibilidad

ELISA CUARTA GENERACION


1997 con antgeno de tercera generacin. ELISA directo para la deteccin de antgeno p24 y un ELISA indirecto para detectar anticuerpos, Reduce la ventana diagnostica en cuatro das falsos positivos, Inconvenientes: menor sensibilidad por menor espacio en la fase slida para anticuerpos; limite alto para la deteccin del antgeno p24 (> 30 pg/ml) Indirecto

ELISAS ANTI-HIV DE PRIMERA, SEGUNDA, TERCERA Y CUARTA GENERACIN


Generacin Propiedades del Ag nmunoglobulina Primera Lisado IgG 9698 9598 810 16.733.3 Segunda Recomb o sinttico IgG > 99.5 > 99 46 50.0 Tercera (sandwich) Todas > 99.5 > 99.5 23 66.7 Cuarta (Combo) Ag + Ac monocl IgG e IgM > 99.5 > 99.5 ~2 66.7

Sensibilidad (%) Especificidad (%) Periodo de ventana (semanas) Valor predictivo positivo al 1% de prevalencia (%) Valor predictivo negativo al 1% de prevalencia (%)

9698

>99.5

> 99.5

> 99.5

DAX, E; ARNOTT, A Pathology ( 2004) 36(6), pp. 110

ELISA
Persisten resultados falsos negativos por: ventana diagnostica, fase de seroconversion, variabilidad gentica, seroconvertidos atpicos, respuesta retrasada o ausente. Falsos positivos reaccin cruzada con anticuerpos auto-reactivos (Ac anti-mitocondriales, Ac anti-nucleares). Artritis reumatoidea, LES y otras enf. Autoinmunes infecciones recientes Falla renal, fibrosis quistica, enfermedad heptica Multparas, multitransfundidos Receptores de algunas vacunas

PRUEBAS CONFIRMATORIAS
Objetivo es descartar falsos positivos Mayor especificidad Menor sensibilidad Falsos negativos en estadios tempranos

WESTERN BLOT

PRUEBAS CONFIRMATORIAS

J Clin Microbiol. 1994 August; 32(8): 18701875

PRUEBAS CONFIRMATORIAS

LIA

Tpico

Combinado

PRUEBAS CONFIRMATORIAS
INMUNOFLUORESCENCIA INDIRECTA (IFI) Prueba alternativa (OMS), Europa Lneas celulares de monocitos infectados Sensibilidad similar a la del WB, depende de experiencia del evaluador, reactividad cruzada con el VIH-2 RADIOINMUNOPRECIPITACION (RIPA): Laboratorios con experiencia y habilidad de propagar el VIH-1 en cultivos celulares en presencia de aminocidos radiomarcados Lisis y reaccin de protenas virales, para que ocurra unin AgAc si la muestra presenta Ac anti-VIH, Mayor sensibilidad y especificidad que el WB, Utilizado para esclarecer los resultados indeterminados del WB.

DETECCIN DIRECTA DEL Ag


Protenas Antgeno p24 Cultivo viral Material gentico Carga viral

Historia Natural de la Infeccin


1200 1100 1000
Primary infection Seroconversin Possible acute HIV syndrome Wide dissemination of virus Seeding of lymphoid organs Death

CD4 T Cells/mm3

900 800
Clinical latency

Opportunistic diseases

1:512 1:256 1:128

700 600
Constitutional symptoms

1:64 1:32 1:16 1.8 1.4

Plasma Viremia Titer

500 400 300 200 100 0 0 3


Anticuerpos CTL

1.2 1 2 5 6 7 8 9 10 0 11

12

Weeks

Years

ENSAYO DE CAPTURA DE Ag P24


Infeccin aguda o fase terminal de enfermedad
Baja sensibilidad por complejos inmunes Alternativa diagnostica en recin nacidos, monitoreo terapia antirretroviral y pronostico de la infeccin Detecta solo el 50% de infectados asintomtico
Antigeno

Anticuerpo

Conjugado

Enzima

Sustrato Producto

CULTIVO VIRAL

Especfica, Co-cultivo de mononucleares previamente activados Monitorean con Ag p24, transcriptasa reversa, deteccin de cidos nucleicos virales o por la observacin de sincitios (fusin de al menos dos clulas). Laboriosa, lenta, experiencia. Determina poblaciones latentes y activas

Pruebas de cidos ncleicos CARGA VIRAL


Cuantitativa Especificas, Carga viral no detectable no indica que no este presente el VIH en la muestra Acort en 11 das, el periodo de ventana Progreso de la infeccin Monitoreo de tratamiento Tamizaje en bancos de sangre Copias log10 10 1.0 50 1.7 100 2.0 500 2.7 1000 3.0 10000 4.0 50000 4.7 100000 5.0 1000000 6.0

RT-PCR (Roche Molecular Systems) AMPLICOR HIV-1 MONITOR TEST

QUANTIPLEX bDNA SYSTEMS

Nuclisens HIV-1 RNA QT NASBA

PCR EN TIEMPO REAL


:

GENOTIPIFICACIN

Tamizaje inicial con ELISA anti-VIH-1 y VIH-2 Reactivo Repetir prueba de tamizaje en duplicado No reactivo Doblemente No reactivo Al menos un duplicado reactivo Realizar prueba suplementaria de anticuerpos antiVIH-1: Western blot o inmunofluorescencia

Positiva Muestra confirmada positiva

Indeterminada

No reactiva

Considerar: fase de seroconversin al VIH-1 o infeccin por VIH-2 o reactividad inespecfica** Repetir en > 1 mes o hacer prueba de deteccin directa (PCR, RT-PCR, Ag-p24***)

Solicitar muestra fresca de sangre en EDTA (> 7 mL) para determinar carga viral. Considerar repetir prueba de tamizaje*

Sin evidencia de infeccin por VIH-1. (repetir en 2 meses si hubo exposicin reciente)

Cortesia del Dr. Javier Daz

Pruebas rpidas

Dot blot

Negativa

Positiva

BioRad Multispot VIH-1/2

Pruebas rpidas
OraQuick VIH-1/2

Inmunocromatografa

HemaStrip (SDS) y SureCheck (Chembio)

Pruebas rpidas

Salas de emergencia, Situaciones pre-quirrgicas, Partos de madres con estado de infeccin-VIH desconocido, estudios epidemiolgicos, Programas de prevencin de ETS Accidentes ocupacionales

Lector de pruebas rpidas

DIAGNOSTICO ACTUAL DEL VIH-1


Historia clnica del paciente. Tamizaje serolgico: ELISA de tercera generacin. Confirmacin serolgica: WB. Seguimiento del paciente y control de terapia antirretroviral: RT-PCR y cuantificacin de clulas CD4+.

Cuantificacin de linfocitos CD4+


Citmetro de flujo Manual

RESUMEN
Monitoreo ms simple de las cargas virales y de los niveles de CD4 Pases en desarrollo Ningn mtodo es perfecto Seleccin cuidadosa de las pruebas y saber sus limitaciones