Alba Signes Marrah

Caso en estudio: Fiebre a la Vuelta del Trpico

La fiebre a la vuelta del trpico es un tema cada vez de mayor impacto, puesto que est aumentando su incidencia en pases occidentales. Las enfermedades que pueden causarla, como la malaria o el dengue, presentan cuadros pseudo-gripales con fiebre y cefaleas que son sntomas muy comunes en una gripe normal. Por ello, sera muy interesante desarrollar un biosensor capaz de detectar y diferenciar estas tres enfermedades de forma rpida, sensible y especfica.

1.- Introduccin
En Espaa existe un inters creciente por el impacto de enfermedades importadas, debido a los cambios socioeconmicos que ha experimentado el pas en las ltimas dcadas (crecimiento del turismo, negocios internacionales, etc.) y por el aumento de la inmigracin desde los pases en desarrollo de reas tropicales y subtropicales. De entre estas enfermedades del trpico, las de mayor riesgo son: la diarrea que es la primera causa de morbilidad (entre un 25-65% la padecen), la malaria, otras infecciones gastrointestinales y las hepatitis virales. En concreto, la malaria es la primera causa infecciosa de complicaciones graves y muerte.

Figura 1. Enfermedades que originan fiebre en el trpico Por ello, los viajeros intercontinentales que acuden a un centro mdico con fiebre deben ser considerados como una Urgencia Mdica, ya que un 1/3 estn provocados por paludismo, fiebre tifoidea, meningitis etc. en las que el retraso diagnstico puede

aumentar la morbilidad y la mortalidad del paciente. [1] Hay que tener en cuenta, que la fiebre puede ser un marcador de enfermedad potencialmente letal, o bien indicar la existencia de una infeccin trivial y autolimitada. Adems, la fiebre no es un sntoma exclusivo de enfermedades infecciosas sino que puede presentarse tambin en enfermedades tumorales, inflamatorias o endocrinolgicas. Por ello, lo importante es identificar rpidamente las enfermedades graves, las potencialmente transmisibles, as como las tratables (lo cual es complicado si slo se usan mtodos basados en el diagnstico clnico). [2]

Un frotis de sangre correctamente preparado en un laboratorio o una prueba rpida, por ejemplo inmunolgica, son por lo general suficientes para identificar el mircroorganismo causal de la fiebre y poder confirmar as un diagnstico de malaria o dengue. Un ejemplo de estas pruebas rpidas es el test ICT que detecta la Lactato deshidrogenasa (LDH) parasitaria comn a P.falciparum y P,vivax (insectos portadores de varios tipos de malaria).

Figura 2. Presentacin comercial del test ICT El problema de los mtodos de laboratorio es que muchas reas endmicas de estas enfermedades no pueden acceder a ellos. Por sus elevados costes no pueden recurrir a prcticas tan comunes como la PCR (para detectar ADN genmico de las especies parasitarias) o los ensayos ELISA (para detectar sus antgenos). La nica tcnica de laboratorio a la cual pueden recurrir es a la microscopa (para detectar parsitos en la sangre). El problema es que se necesitan condiciones ptimas para que este diagnstico sea fiable lo cual no se suele dar en estos pases (reciclan los microscopios, no los mantienen adecuadamente, etc.). [3]

Por ello existe un considerable inters en conseguir algn tipo de diagnstico fcil de realizar por cualquier persona sin necesidad de un mdico, rpido, que no precise microsocopio ni personal especializado y fiable. Las pruebas rpidas como el test ICT, seran una buena solucin pero su relacin coste-efectividad no es rentable. Por ello,

sera interesante desarrollar un biosensor capaz de detectar y diferenciar enfermedades como la malaria y el dengue de un simple resfriado, de forma fiable, sensible, rpida y especfica. [4] Este mtodo podra extenderse si se consiguiesen dispositivos de bajo coste, de un solo uso y fiables para detectar al mismo tiempo las tres enfermedades. Adems, en los pases occidentales tambin supondra un avance muy importante puesto que se podran detectar con enorme rapidez y fiabilidad estas patologas, lo cual es de vital importancia, como ya se ha dicho, para prevenir su morbilidad y mortalidad.

2.- Desarrollo de un biosensor

El desarrollo de un biosensor es una labor realmente compleja. La adecuada seleccin del elemento de reconocimiento biolgico y el transductor apropiado es en realidad, la tarea ms importante para el xito de estos dispositivos de diagnstico. La mayora de tcnicas se basan en el uso de anticuerpos como elementos de reconocimiento, pero tambin se pueden usar otros elementos biolgicos como las secuencias de ADN. En cuanto a los transductores, se usan principalmente tcnicas pticas o electroqumicas. La Resonancia de Plasmn Superficial (SPR) por ejemplo, es una tcnica ptica analtica muy potente a la hora de monitorizar con gran sensibilidad y en tiempo real interacciones moleculares superficiales sin necesidad de marcadores. Adems se ha conseguido mejorar su sensibilidad y su miniaturizacin, pero su coste y complejidad hace a estas tcnicas pticas menos atractivas para la mayora de los usuarios finales. En cambio, las tcnicas electroqumicas (potenciomtricas, amperomtricas, etc) son ms sencillas de utilizar, tienen una alta sensibilidad, un coste ms bajo, etc. [5]

Teniendo en cuenta todo esto, en este caso en estudio, se va a recurrir a los genosensores, que son los biosensores que utilizan como elemento de

reconocimiento secuencias de ADN. El fundamento de esta tcnica es la hibridacin con las hebras complementarias a travs de la renaturalizacin de la doble hlice controlada por el rigor o la estringencia en el apareamiento. Y la deteccin se har mediante transductores electroqumicos por su elevada sensibilidad unida a la posibilidad de miniaturizacin y microfabricacin de los dispositivos y al bajo coste de los mismos. Lo que permite el desarrollo de dispositivos porttiles, simples y econmicos para la realizacin de diagnsticos clnicos fuera del laboratorio. [6]

2.1.- Genosensor para la deteccin de virus

La construccin de biosensores empleando secuencias de ADN se fundamenta en la ordenacin adecuada de las hebras sobre la superficie de un electrodo. Estas hebras (sondas) deben ser complementarias a las secuencias de ADN que interesan detectar en la muestra, es decir, a las secuencias de los tres virus mencionados: malaria, dengue y gripe. [7] Por ello, en este genosensor el elemento de reconocimiento son 3 olignucletidos sintticos complementarios cada uno de ellos a uno de estos diferentes virus. La secuencia que se sintetiza de cada virus es la correspondiente a las bases que codifican la subunidad pequea del ADN ribosmico (regin del genoma medianamente repetida en el ADN de estos virus). Aunque esta secuencia es comn en muchos organismos tambin contienen regiones cuya secuencia de bases es especfica de cada virus. Esta dualidad "secuencias especficas/secuencias comunes" permite el diseo de oligonucletidos con diversos niveles de especificidad (universales, con especificidad de gnero, con especificidad de especie). En este caso se buscar una especificidad de especie que sirva para detectar y diferenciar los virus causantes de estas tres enfermedades. [8] Los tres oligos constan, cada uno, de unas 30 bases aproximadamente y estn tiolados en el extremo 3 complementario a la diana concreta del genoma del virus que se biotinila tambin en el extremo 3.

Para llevar a cabo la orientacin deseada de las hebras de ADN se realiza una reaccin en la superficie del electrodo con avidina-biotina, se recubre al electrodo con avidina o compuestos derivados, como la estreptavidina o neutravidina. Esto ha demostrado dar buenos resultados para llevar a cabo una buena orientacin de la hebra. [7]

La muestra biolgica necesaria para este diagnstico es una simple muestra de sangre del paciente, puesto que el ADN del virus se encontrar presente en ella en el caso de que el enfermo est infectado por alguno de ellos (cuando el virus destruye las clulas que parasita, todo su material gentico, conjunto de protenas, etc. es liberado al torrente sanguneo). Un genosensor permite detectar este ADN de forma directa y sin necesidad de tratar la muestra.

Como transductor se utiliza un electrodo serigrafiado y nanoestructurado con nanopartculas de oro, sobre las cuales se ordenan los tres tipos de sondas debido a la interaccin azufre-oro. [7]

Figura 3 Diseo de un genosensor para la deteccin de virus. A) Etapas de construccin del elemento de reconocimiento; B) metodologa analtica seguida para la obtencin de la seal analtica.

En este caso se han elegido electrodos serigrafiados por sus caractersticas: bajo coste, manejo simple y son desechables (para construir biosensores de un solo uso que es lo ms conveniente en este caso). Adems, para mejorar sus propiedades como la selectividad y la sensibilidad, se realizan modificaciones en su superficie con nanomateriales como las nanopartculas de oro (de un tamao promedio de 70 nm),. Aunque tambin se podran usar otros como los nanotubos de carbono. Esto no encarece demasiado su coste y adems mejora la inmovilizacin de las molculas de ADN en la superficie del electrodo.

Figura 4. Superficie modificada del electrodo serigrafiado. Las nanopartculas de oro tienen muchas aplicaciones electroanalticas, debido tanto a la elevada conductividad de las mismas como a la elevada relacin superficie/volumen que presentan. Adems, recientemente se ha visto la posibilidad de generar in situ sobre la propia superficie del electrodo serigrafiado nanopartculas de oro de forma muy controlada, sencilla y barata por electrodeposicin para dar lugar a transductores nanoestructurados de oro de excelentes prestaciones. [6]

Figura 5. Nanoestructuracin de electrodos serigrafiados con oro. La deteccin de las secuencias de ADN del virus se realiza mediante deteccin electroqumica, es decir, mediante la modificacin de los perfiles de potencial vs corriente posterior a la unin de las cadenas complementarias. Las ventajas, ya antes mencionadas, son una alta sensibilidad, una respuesta rpida, bajo coste y un fcil manejo, por lo que son muy tiles en la deteccin directa de virus. [7] Las propiedades electroactivas del ADN permiten medir la diferencia de corriente elctrica antes y despus de la hibridacin, lo cual est relacionado con la cantidad de ADN fijado sobre el electrodo. Sin embargo, esta deteccin directa sin marcador no es muy selectiva, por lo que para mejorar esta sensibilidad, se usar una reaccin enzimtica. [9] Puesto que la preconcentracin electrdica presenta lmites de cuantificacin muy bajos, la catlisis enzimtica ayudar a la amplificacin de esa seal analtica. De esta forma, una combinacin de estos dos procesos resuelve la determinacin de bajas concentraciones de analito. En este caso se va a usar en concreto, fosfatasa alcalina como marca enzimtica y plata y 3-indoxil fosfato como coosustratos. En la figura 6 queda reflejado cmo la fosfatasa alcalina hidroliza el 3indoxil fosfato y cmo el compuesto intermedio indoxlico generado en la reaccin reduce los iones plata a plata elemental a la vez que l se oxida a ndigo, de tal forma que tanto la plata elemental como el ndigo quedan depositados sobre el transductor. El ndigo no es electroactivo y la plata acumulada puede redisolverse por voltamperometra de redisolucin andica dando lugar a picos de redisolucin cuya intensidad mxima est relacionada directamente con la concentracin de fosfatasa alcalina. [6]

Figura 6. Esquema de la reaccin enzimtica catalizada por la fosfatasa alcalina (AP).

Respecto al soporte fsico del biosensor desarrollado consta en esencia, de una celda electroqumica en la que se integran tres electrodos: un electrodo de trabajo serigrafiado y nanoestructurado con nanopartculas de oro donde estn fijadas las sondas de ADN, un contraelectrodo (CE) de platino, y un electrodo de referencia (RE) de plata. Hay que tener en cuenta que el diseo debe ser triparamtrico, es decir, debe constar no de uno sino de tres electrodos de trabajo situados en la misma celda electroqumica. Cada uno de ellos se modifica con uno de los tres tipos de sondas: uno con aquellas especficas del virus de la malaria, otro con las del dengue y otro con las de la gripe. La metodologa analtica es la misma que la utilizada para un biosensor electroqumico comn, simplemente que los tres electrodos comparten muestra y reactivos. Todo ello es posible porque el producto de la catlisis enzimtica que genera la seal analtica es plata metlica que slo queda depositada donde ha reaccionado el analito. No puede trasladarse de un electrodo de trabajo a otro por ser una especie slida generada in situ, por lo tanto, no puede haber interferencias entre uno y otro electrodo a pesar de compartir muestra y reactivos biolgicos (ADN biotinilado y estreptavidina marcada con fosfatasa alcalina) y sustratos enzimticos (3-indoxil fosfato y cationes plata). [9]

3.- Conclusiones y recomendaciones

Un biosensor electroqumico hace posible la combinacin de la sensibilidad de las tcnicas electroqumicas con la selectividad de los procesos de reconocimiento biolgico (en este caso, hibridacin de hebras de ADN complementario) de una forma sencilla. Esto da lugar a dispositivos de bajo coste, sobre todo cuando para su construccin se utilizan como transductores electrodos serigrafiados. Este tipo de electrodos son los que estn dando una mejor respuesta para la fabricacin a gran escala de biosensores que con una mnima modificacin puedan ser utilizados como transductores. Los electrodos convencionales de oro, platino o carbono no son vlidos para el diagnstico clnico en general, puesto que el contacto del elemento de reconocimiento con la muestra (sangre, suero, orina, lquido cefalorraqudeo) invalida al sensor para posteriores determinaciones con lo que la solucin lgica sera la de construir sensores de un solo uso, esto es, de usar y tirar, lo que hace econmicamente inviable la utilizacin de los citados electrodos. Adems, la

necesidad cada vez mayor de realizar anlisis en microvolmenes de muestra hace tambin difcil la adaptacin de estos electrodos a la solucin de problemas reales. En cambio la tcnica de serigrafiado que la ingeniera electrnica viene utilizando durante ms de cincuenta aos en la produccin de circuitos impresos, se ha ido adaptando tambin a la produccin de electrodos serigrafiados con grandes ventajas frente a otras tecnologas como son: 1. La flexibilidad del diseo: cualquier geometra es posible para el electrodo de trabajo y adems permite, utilizando distintas mscaras y tintas de serigrafiado, el diseo completo de cualquier celda electroltica en la que se puedan variar tanto el nmero de electrodos como el volumen de la misma en funcin de las necesidades. 2. La automatizacin del proceso de produccin: una vez diseadas adecuadamente las mscaras y escogidas las tintas de serigrafiado, la produccin de tarjetas serigrafiadas que incluyan la celda electroltica completa se puede hacer a gran escala, reproduciendo con gran precisin tamaos y geometras y abaratando costes. 3. La gran variedad de tintas de serigrafiado permite combinar distintos materiales electrdicos en la misma celda electroltica. As, es posible utilizar

electrodos de oro, de platino, de carbono, de plata o de plata/cloruro de plata en la misma celda electroltica en funcin de las necesidades de la transduccin del biosensor. 4. El proceso de produccin de electrodos serigrafiados se puede adaptar a distintos soportes tambin en funcin de necesidades concretas, de tal manera que la naturaleza de la tarjeta soporte, donde va a quedar impresa la celda y los electrodos, puede variar desde materiales polimricos o plsticos a materiales cermicos o almina. [6]

As pues, este genosensor desarrollado representa, sin duda, una de las formas ms eficaces para combinar factores atractivos para el mercado tanto occidental como de los pases endmicos de estas enfermedades (con menor capacidad econmica). Puesto que exhibe propiedades como alta sensibilidad, rapidez de respuesta, facilidad de uso y bajo coste. Adems, de la posibilidad de ser microfabricado para su miniaturizacin (sin encarecerse por ello los costes), lo que permite el desarrollo de estos dispositivos como instrumentos porttiles y de un solo uso. [5]

4.- Bibliografa
[1] Juan Narciso Bellot Botello, "Malaria, fiebre al regreso del trpico y viajes internacionales", [en lnea]. 03 de Junio de 2012. Disponible en la Web: http://www.monografias.com/trabajos81/malaria-fiebre-tropico-viajesinternacionales/malaria-fiebre-tropico-viajes-internacionales2.shtml

[2] Ruth Paz Maya, Pilar Zamarrn Fuertes, Agustn Julin Jimnez, Manual de protocolos y actuacin en urgencias, captulo 87 - Fiebre al regreso del trpico en urgencias, [libro en lnea]. 03 de Junio de 2012. Disponible en la Web: http://es.scribd.com/doc/50082611/38/FIEBRE-AL-REGRESO-DEL-TROPICO-ENURGENCIAS [3] Mendoza, Nohora Marcela et al. Evaluacin de dos pruebas rpidas NOW ICT Malaria Pf/Pv y OptiMAL para el diagnstico de paludismo en Tumaco, Colombia. Biomdica [en lnea]. 2007, vol.27, n.4, pp. 571-580. [4] Csar Cabezas, Nancy Arrspide et. Al. "Evaluacin del uso de una prueba rpida inmunocromatogrfica en promotores de salud para el diagnstico de la malaria en reas rurales de la amazonia peruana", Peru medicina exp salud publica [en lnea]. 2004, vol 21, n1.

[5] FarmaEspaa Industrial, "Aplicacin de los biosensores en diagnstico clnico de las enfermedades infecciosas", [en lnea]. Mayo/Junio 2010, 03 de Junio de 2012. Disponible en la Web:

http://www.aromics.es/adjuntos_newsrooms/01._farmaespana_%28may_2010%29.pdf

[6] Mara Begoa Gonzlez Garca, Agustn Costa Garca, Los biosensores electroqumicos: herramientas de la analtica y del diagnstico clnico, [en lnea]. 03 de Junio de 2012. Disponible en la Web:

http://www.analesranf.com/index.php/mono/article/viewFile/1068/1065

[7] Acta Qumica Mexicana, Electrodos serigrafiados en el empleo de genosensores, [en lnea]. 03 de Junio de 2012. Disponible en la Web:

http://www.postgradoeinvestigacion.uadec.mx/AQM/No.%204/AQM4electrodos.html

[8] Yanetsy Machado Tugores, Paludismo, enfermedad del tercer mundo", [en lnea]. 03 de Junio de 2012. Disponible en la Web:

http://www.monografias.com/trabajos77/paludismo-enfermedad-tercermundo/paludismo-enfermedad-tercer-mundo2.shtml [9] Digna Biotech, Desarrollo de un biosensor electroqumico para la deteccin de mutaciones de ADN", [en lnea]. 03 de Junio de 2012. Disponible en la Web: http://www.dignabiotech.com/cas/r_d.DNA.asp

- Patricia Nieto-Sandoval Martn de la Sierra, Fiebre en viajero procedente del trpico", [en lnea]. 03 de Junio de 2012. Disponible en la Web: http://www.hgucr.es/wpcontent/uploads/2011/12/fiebre_en_el_viajero_procedente_del_tr%C3%B3pico.pdf

- David N. Drrheim, Tropical Fevers: C. Important human parasitic fevers of the tropics, [en lnea]. 03 de Junio de 2012. Disponible en la Web:

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- Ministerio de Sanidad y Consumo, Enfermedades infecciosas importadas por viajeros internacionales a los trpicos, [en lnea]. 03 de Junio de 2012. Disponible en la Web:

http://www.msc.es/profesionales/saludPublica/prevPromocion/promocion/migracion/do cs/enfInfImpViajerosTropicos.pdf