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HAEMOPHILUS

As espcies oficialmente aceitas so: H. influenzae, H. parainfluenzae, H. haemolyticus, H. parahaemolyticus, H. aphrophilus , H. paraphrophilus, H. ducreyi, H. segnis. Apresentam interesse mdico mais acentuado as espcies: H. influenzae e H. ducreyi. Tirando o H. influenzae e o H. ducreyi que so patgenos humanos importantes, todos os outros Hemophilus so considerados da flora/biota normal.

HAEMOPHILUS INFLUENZAE
um patgeno importante do ser humano. MORFOLOGIA H. influenzae um bacilo bem pequenino, gram-negativo, curto, imvel e que no esporula, produz uma cpsula. um bacilo to pequenino que alguns autores chamam de coco-bacilo. O germe pleomrfico: as vezes apresenta-se na forma filamentosa outras vezes com forma mais cocides. Segundo o prof. ,na literatura que ele dispe, no h uma explicao para esse pleomorfsmo.

Essa imagem de um LCR de um paciente que apresentou meningite por H. influenzae, que mostra a variabilidade de formas dessa bactria.

CULTIVO Os hemfilos crescem em meios enriquecidos com sangue ou derivados de sangue. H. influenzae s cresce se o meio apresentar: Fator X (xis) a hemoglobina ou qualquer derivado da hemoglobina e Fator V (v) NAD ou NADP. Tem que ter os 2 fatores, se no colocar os 2 fatores a bactria no cresce!

Semeia a bactria no: Agar-chocolate, porque na preparao desse meio, ao cozinhar o sangue as hemcias se rompem e liberam a hemoglobina (fator X) e o NADP (fator V). O Agar sangue de carneiro pode ser usado para semear essa bactria desde que voc adicione o fator X e o fator V. Ai o aluno pergunta: porque adicionar esses fatores se eles j esto presentes nas hemcias? Resposta: as hemcias esto ntegras, no liberam esses fatores. Outra possibilidade usar o meio Agar sangue de carneiro que tenha sido lisado por outra bactria, por exemplo Staphylococcus aureus lisam as hemcias (so B-hemolticos). Ento voc prepara o meio, coloca os S. aureus que vo lisar as hemcias (liberando os fatores) e os H. influenzae vo crecer perto dos estfilos. Agar de Meller-Hinton um meio recomendado internacionalmente para se fazer antibiograma pela tcnica da difuso, esse meio pode ser usado para cultivar H. influenzae desde que sejam adicionados os fatores X e V.

SATELITISMO - Meio contendo Agar sangue de carneiro o H. influenzae no cresce porque os fatores X e V esto dentro das hemcias. No lugar onde passa uma bactria beta-hemoltica (S. aureus), vo ser lisadas as hemcias, os fatores X e V liberados e o H. influenzae cresce bem junto a essa rea onde esto os S. aureus, por isso esse fenmeno chamado de satelitismo.

Esse teste pra mais uma vez afirmar que o Haemophilus Influenzae s cresce se o meio conter os fatores X e V. Note que nos locais onde tem apenas um dos fatores a bactria no cresce. O teste feito quando se tem suspeita que um Haemophilus (atravs da morfologia, bacilo curtinho, gram negativo....) BIOTIPOS

Biotipo significa tipo BIOQUMICO, ou seja, relativo ao comportamento bioqumico da bactria. H oito tipos diferentes dessa bactria com base no seu comportamento bioqumico, frente as provas do indol, prova da urease, prova da ornitina descarboxilase. Com base no resultado dessas provas bioqumicas temos 8 tipos de bactrias.

O professor NO falou especificamente de cada prova bioqumica em sala, NO precisa decorar, s pra saber o que mesmo, eu copiei isso da intenet:

Prova do inol - o objetivo determinar a capacidade do microrganismo degradar o aminocido triptofano (presente em quase todas as protenas) at indol. Prova da urease - o objetivo desta prova determinar a capacidade do microrganismo para desdobrar a uria atravs da enzima urase. Prova da ornitina descarboxilase - usado para diferenciar bactrias baseado na sua habilidade para descarboxilar os aminocidos. (O caldo
caldo Ornitina descarboxilase possui peptonas e extrato de carne que favorecem o crescimento bacteriano. A fermentao de glicose abaixa o pH e este fica amarelo. Se ocorrer atividade da enzima ornitina descarboxilase o pH aumentar, devido a transformao da ornitina em uma amina primria: a putrescina , e o meio voltar a apresentar uma colorao roxa, devido a viragem dos indicadores de pH, Prpura de Bromocresol e Vermelho de Cresol.)

O biotipo 3 engloba uma variedade que j exibiu o nome H. aegyptiu, mas hoje no se considera mais essa denominao, est ultrapassado.

CLONALIDADE Os Haemophilus influenzae possuem uma cpsula de polissacardeos (semelhante ao que vivos nos pneumococos) o que nos permite classificar essas bactrias em 6 sorotipos. Ns sabemos tambm que alguns H. influenza no possuem cpsula. As cepas capsuladas so geneticamente diferentes das cepas acapsuladas, ou seja, o DNA de um capsulado no idntico a um DNA de uma H. influenzae capsulada. O sorotipo B compreende dois tipos clonais (isso significa que os H. influenzae que expressam a cpsula tipo B possui 2 populaes com material gentico diferente entre si, por isso chamamos de 2 tipos clonais), um desses tipos clonais responsvel por quase todos os casos de meningite.

OBS: Observem que podemos classificar o H. influenzae de acordo com 2 critrios: o BIOTIPO relativo ao comportamento BIOqumico da bactria e SOROTIPO de acordo com a estrutura da cpsula.

ESTRUTURA ANTIGNICA H. influenzae exibe cpsula polissacardica em culturas jovens ( o prof. no explicou esse tpico). O polissacardeo capsular dos H. influenzae imunognicos, ou seja, o sistema imune produz anticorpos contra esses polissacardeos. H seis sorotipos de H. influenzae designados pelas letras A, B, C, D, E, F. O H. influenzae do tipo B a mais estudada por ser a mais importante. Ao analisar a natureza qumica da capsula do sorotipo B, descobriu-se o polmero que constitui a cpsula e que confere a sua antigenicidade (da capsula do sorotipo B), este polmero constitudo de Polirribosil-Ribitol- fosfato (PRP). Um vez que se pensou que esta era a principal arma virulenta da bactria os cientistas fizeram uma vacina contra esse micrbio feita com base nesse polmero, foi a primeira vacina feita para imunizar os seres humanos contra o sorotipo B. Esta cpsula de polmero de PRP parece muito com uma substancia que existe na Escherichia coli. A Escherichia coli quando entra no nosso tubo digestivo, dependendo do arcabouo gentico da cepa de E. coli, ela pode no fazer nenhum mal e viver em simbiose com o ser humano (lembrando que tem algumas cepas de E. coli que so patognicas). Se uma pessoa engolir uma E. coli K100 (esse antgeno dela K100, K de cpsula em alemo hehehe) a bactria chega ao intestino grosso, o ser humano consegue reagir a esse antgeno K100 e comea a produzir anticorpos. Esses anticorpos produzidos contra a E.coli K100 se ligam no PRP. Um antgeno feito para uma bactria da flora normal pode suscitar o surgimento de anticorpos para uma bactria patognica. Isso mostra um ponto positivo da simbiose com as bactrias no intestino. Isso acontece porque alguns antgenos, epitopos so iguais, comuns a 2 tipos de bactrias. Essa idia da existncia de epitopos, iguais ou semelhantes, em bactrias de espcies diferentes constitui o que denominamos mosaiscismo antignico. Como muitas molculas so freqentes em vrias bactrias, essas molculas so padres moleculares associados a patgenos (PAMPs). Estrutura do Polirribosil-Ribitol- P (PRP): (RIBOSE+RIBITOL+FOSTATO)n Quando uma cepa de H. influenzae no exibe cpsula, ela no pode ser sorotipada. A sorotipagem exige uso de anticorpos especficos. Acredita-se que a fagocitose mediada por anticorpos opsonizantes (IgM, IgG) tipoespecficos seja a mais importante defesa contra H. influenzae. Outra opo a deposio do C3b depositado na bactria porque o fagcito tem receptor para C3b, mas a bactria esperta, faz cpsula que dificulta a deposio do C3b. Anticorpos anti-Hib so induzidos por ex-posio E. coli K100.

FATORES DE VIRULNCIA (armamentos agressivos da bactria) Cpsula polissacardica (locus cap) toda bactria que possui cpsula tem uma camada que se ope a fagocitose. LOS (loci lic1, lic2 e lic3); LOS (lipo-oligossacardeo: lipdio A + KDO) um armamento importante, agressivo da bactria. O loci lic1, lic2 e lic3 so segmentos do cromossomo que vo fazer os sistemas enzimticos que vo colocar fosfocolinafosfolipolina, galactose-galactose e cido silico no KDO respectivamente. KDO um acar que s existe nas bactrias gram negativas. Se a bactria liga esse operon chamado lig 3, esse operon vai permitir que a bactria coloque cido silico em cima do KDO, a bactria ao colocar o cido silico em cima do LOS ela faz o LOS da bactria virar uma coisa self. Isso porque o sistema imune olha e v como algo self pois o cido silico uma coisa humana, a bactria produz uma enzima chamada sialil transferase que transfere cido silico humano pra cima do LOS. Em linguagem de barzinho, lobo se vestindo de ovelha hehehe. A bactria est fazendo um mimetismo molecular, ela camufla-se parecendo self.

Glicopeptdio/Murena parece ser um fator de virulncia. O glicopeptdio/murena de uma bactria um PAMP (padro molecular associado a patgeno), quando isso reage com receptores especficos dos macrfagos humanos, os macrfagos do uma resposta secretando citocinas pr-inflamatrias. Fmbria Hif (?) Um pelinho com adesinas para a adeso. Omps diversas (Hia, P5 e outras) protenas de membranas externas cujo significado e importncia esto sendo investigados. Protease de IgA1

O retngulo cinza representa os genes que codificam a cpsula, em preto o transposon (IS -seqncia de insero) e o vermelho BEX representando o gene que codifica o mecanismo de exportao do polissacride B. Quando a bactria no possui o bex ela no possui cpsula , no faz cpsula porque no possui o sistema de exportao pois a cpsula tem que ser feita dentro da clula e depois exportada (a bactria sabe fazer a cpsula mas no sabe export-la, resultado NO tem cpsula). Quando a bactria sabe fazer a cpsula (tem o retngulo cinza) e sabe exportar a cpsula (tem retngulo vermelho) a bactria capsulada. No exemplo Cap ++, h 2 bex e 3 retngulos cinza que codificam a cpsula, essa bactria faz uma cpsula grossa, espessa. Apesar de possuir 2 genes bex, sabe-se que um gene bex contm uma mutao e por isso s o outro gene realmente funciona. Dessa maneira, o que vai determinar se a cpsula ser espessa a quantidade de genes responsveis pela produo da cpsula (cinza), quanto mais genes pra fazer cpsula, mas espessa esta ser. Por isso que a bactria capsulada geneticamente diferente da acapsulada. A acapsulada no possui o gene bex.

IMPORTNCIA MDICA As cepas encapsuladas de H. inflenzae do sorotipo b causam vrios processos infecciosos: meningite, epiglotite, pneumonia e empiema, celulite, bacteremia (sem doena localizada) e artrite sptica. Fator de risco: deficincia de IgG2. As principais vtimas do Haemophilus influenzae so as crianas pequenas, depois que passa o efeito do anti-corpo materno at os 5 anos as crianas esto com o mximo risco de exposio a estas bactrias. As cepas no capsuladas tambm podem causar doena: sinusite, otite mdia exacerbao da DOPC, pneumonia, sepse neonatal e materna, conjuntivite. Isso significa que a cpsula por si s, embora sendo uma arma importante da bactria, no a nica, pois as bactrias acapsuladas tambm so capazes de ser patognicas.

As cepas de H . Influenzae do biotipo 3 so geneticamente heterognas. Uma delas causa a Febre Purprica Brasileira, causado por um H. influenzae especial que causa conjutivite mas a bactria pode passar para o sangue e causar sepse que chega a falncia de rgos e morte. (Febre, prpura, choque e bito).

DIAGNSTICO BACTERIOLGICO O material a ser estudado depende do stio anatmico da infeco: escarro, secrees purulentas diversas, sangue, LCR, lquido sinovial, outros (na otite, no tire material pra anlise, perigoso mexer, furar o tmpano, consulte um colega otorrinolaringologista). EXAMES: Gram (utilidade dependente da amostra, no tem quase valor nenhum quando pega a amostra de uma mucosa onde tem vrias outras espcies de bactrias); Teste do Quellung; Cultura para piognicos; Pesquisa de antgeno capsular no lquor ou em vrias secrees humanas. Sorologia (no tem utilidade pois quando observamos o paciente ele est em fase aguda e ele ainda no tem anticorpo detectvel); mtodos moleculares no so usado no Brasil com rotina. Deteco de PRP em lquor por vrios mtodos o mais usual o ELISA ou outros testes que esto caindo em desuso: aglutinao do ltex, contra-imunoeletroforeses, outros... Mtodo molecular sonda de DNA marcada com ster de acridina, que hibridiza com RNAr (Accuprobe/Gen-Probe, San Diego, Cali-fornia), usado em situaes especiais!

TRATAMENTO (O professor no fez comentrio nenhum, s ficou falando que estudante de 4


semestre ainda no deve saber usar antibitico)

Os dados epidemilgicos so de grande importncia. Os antibiogramas podem ser necessrios. Muitas cepas de H. influenzae ainda so sensveis : Ampicilina Cloranfenicol Cefalosporinas mais recentes (cefotaxima)

As cepas no capsuladas so sensveis a vrias drogas: Sulfonamidas Macroldios Quinolonas Amoxicilina + cido clavulnico Cefalosporinas de expectro estendido (cefaclor, cefuroxima)

PROFILAXIA Vacinas conjugadas vo associar o PRP com uma protena estranha ao corpo humano atravs de uma ligao covalente.

Vacinas conjugadas de PRP HbOC (HibTITER/Praxis) > PRP + CRM (Cross-Reacting Material, protena mutante derivada da exotoxina diftrica) Esta vacina recomendada para crianas a partir de 2 meses de idade, ou seja no pode dar a recm nascido.

Vacinas conjugadas de PRP PRP-D (ProHIBit/Connaught Labs) PRP + toxide diftrico Esta vacina deve ser administrada cri-anas a partir dos 15 meses de idade

Outras vacinas conjugadas de PRP PRP-T (Act HIB/Pasteur Merieux Labs) > PRP + toxide tetnico PRP-OMPC (PedvaxHIB/Merck, Sharp & Dome) > PRP + complexo proteico de membrana externa de Neisseria meningitidis