BIOSINTESIS DE AMINOCIDOS EN ESCHERICHIA COLI

E.A.P. Ciencias Biolgicas, Facultad de Ciencias Biolgicas, Universidad Nacional Mayor de San Marcos, Lima, Per

Resumen
Se tiene conocimiento de que todos los aminocidos provienen de intermediarios, del ciclo del acido ctrico o de la va de las pentosas fosfato, sobre esta base se realizo el siguiente trabajo. Los distintos organismos presentan considerables diferencias en su capacidad para sintetizar los 20 aminocidos estndar. Mientras que la mayor parte de bacterias y plantas pueden sintetizar los 20 aminocidos, los mamferos solo pueden sintetizar la mitad, generalmente aquellos cuyas vas metablicas son sencillas, estos son los denominados aminocidos no esenciales, que no son necesarios obtenerlos en la dieta, ya que el organismo con simples reacciones puede sintetizarlos. El resto, los aminocidos esenciales, deben obtenerse de la dieta. Existen microorganismos como E. Coli que puede fabricarse sus propios aminocidos a partir de amoniaco. En el presente informe se presentan las vas de la biosntesis de aminocidos, en un cultivo de E. Coli; a la cual se le aadi glucosa marcada con 14C y un sustrato carbonado o aminocidos no radioactivos, en donde se demuestra la radioactividad de estos compuestos sobre los aminocidos. Con este trabajo deducimos que los aminocidos competidores son precursores de la biosntesis de otros aminocidos (los aminocidos no esenciales), que por procesos de transaminacin y aminacin reductiva de los intermediarios del ciclo de Krebs y el piruvato. As obtuvimos 3 familias: Familia del cido Asprtico, Familia de cido Glutmico y Familia de la Serina.

Palabras clave: Aminocidos, transaminacin, intermediarios, radiactividad.

Abstract
It is known that all amino acids come from intermediaries, citric acid cycle or the pentose phosphate pathway, on this basis took place the next job. Individual agencies have considerable differences in their ability to synthesize the 20 standard amino acids. While the majority of bacteria and plants can synthesize the 20 amino acids, mammals can synthesize only half, generally those whose metabolic pathways are simple, they are called non-essential amino acids, which are not required to obtain them in the diet, since the organism can synthesize simple reactions. The remainder, essential amino acids, be obtained from the diet. There are microorganisms such as E. Coli can be manufactured their own amino acids from ammonia. This report presents the pathways of biosynthesis of amino acids in a culture of E. Coli, to which glucose was added 14C and a carbon substrate or nonradioactive amino acids, where it shows the radioactivity of these compounds on the amino acids. With this work we conclude that amino acids are precursors competitors for the biosynthesis of other amino acids (nonessential amino acids), which processes transamination and reductive amination of the Krebs cycle intermediates and pyruvate. So we got 3 families: Family of Aspartic Acid, Glutamic Acid Family and Family of Serine.

Keywords: Amino acids, transamination, brokers, radioactivity.

Introduccin
La sntesis de aminocidos se desarrolla a un ritmo variable, dependiente de las necesidades que existan que existan en la clula respecto a cada aminocido en particular. En los mamferos existen rutas anablicas para los aminocidos considerados como esenciales (Alanina, Arginina, Asparragina, Aspartato, Cisteina, Glutamato, Glutamina, Glicina, Prolina, Serina, Tirosina) Los 20 aminocidos estndar(o proteinognicos) se dividen en 5 familias en relacin a su biosntesis. Los miembros de cada familia derivan a partir de precursores comunes generados en el ciclo de Krebs, en la gliclisis o en la va de las pentosas fosfato. Los aminocidos glucognicos son los que dan lugar a una produccin neta de piruvato o intermediarios del Ciclo del TCA, tales como -cetoglutarato u oxaloacetato, que son precursores de la

glucosa va gluconeognesis. Todos los aminocidos excepto la lisina y la leucina son al menos en parte glucognicos. La lisina y la leucina son los nicos aminocidos que son solamente cetognicos, dando lugar solamente a acetil-CoA o a acetoacetil-CoA, ninguno de los cuales puede traer la produccin neta de la glucosa. Un grupo pequeo de aminocidos comprendidos por isoleucina, fenilalanina,

treonina, triptfano, y tirosina dan lugar a precursores de la glucosa y de cidos grasos y as son caracterizados como glucognicos y cetognicos. Finalmente, debe ser reconocido que los aminocidos tienen un tercer posible destino. Durante etapas de hambruna los esqueletos de carbono reducidos se utilizan para la produccin energtica, con el resultado que se oxida a CO2 y H2O.

Materiales y Mtodos
En el experimento realizado para investigar las vas de la biosntesis de aminocidos, un cultivo de Escherichia coli que creca exponencialmente en un medio de glucosa con sales fue dividido en dieciocho cultivos separados. Se aadi a cada cultivo, glucosa marcada con 14C y un sustrato carbonado (oxalacetato, -cetoglutarato, piruvato, acetato y semialdehdo glutmico) o un aminocido (c. asprtico, c. glutmico, homoserina, serina, acetato, treonina, valina, arginina, isoleucina, glicina, leucina y prolina) no radioactivo. Despus de crecer por una generacin, los organismos fueron lisados, aislando luego fracciones de lpidos, cidos nuclecos y protenas residuales. Se usaron solo las fracciones proteicas las que fueron primero, hidrolizadas en medio bsico y a altas temperaturas, para romper el enlace peptdico, obteniendo aminocidos. Los aminocidos fueron separados por cromatografa bidimensional, en la cual se hizo una cromatografa ascendente vertical y otra horizontal (girando el papel 90), usando solventes distintos. A los aminocidos separados se los reconoci usando la ninhidrina (reacciona con todos los aminocidos alfa cuyo pH se encuentra entre 4 y 8), dando una coloracin que vara de azul a violeta intenso. Este producto colorido (llamado prpura de Ruhemann) se estabiliza por resonancia, la coloracin producida por la ninhidrina es independiente de la coloracin original del aminocido. La prolina da coloracin amarilla. Por su sensibilidad esta reaccin se emplea para valoracin cuantitativa de aminocidos por colorimetra. Los aminocidos separados fueron eludos individualmente, determinndose su concentracin y midindose la radioactividad en una alcuota de la muestra por medio de un fotocolormetro.

Resultados
La actividad especfica de cada aminocido, se determino sabiendo la radioactividad de cada aminocido. La actividad especfica de los aminocidos se encuentra en la Tabla I.

Tabla I. El efecto de Competidores Sobre la Incorporacin de C14 Glucosa en Aminocidos.

Sustrato Carbonado o Aminoacido no Radiactivo Control Acetato Alanina Arginina Acido Aspartico Acido Glutamico Semialdehido Glutamico Glicina Homoserina Isoleucina -cetoglutarato Leucina Oxalacetato Prolina Piruvato Serina Treonina Valina

Actividad especfica de los Aminocidos (cpm/mol) ala

1600 1580 320 1610 1590 1570 1600 1620 1560 1630 1610 1560 1220 1600 650 960 1580 1590

arg
1300 ------60 ---150 1290 1320 ------------1280 ----------------

asp
820 680 ---840 205 375 810 820 825 830 570 580 820 700 ---810 ----

cys
220 ---215 ------------225 ---------220 ------215 10 ---220

glu
2500 1510 ---2520 1760 200 2480 2520 ------1550 ---1620 2500 1850 ----------

gly
550 ---560 ------550 ---275 ---------560 ---550 555 270 ---550

ile
340 ---------205 ---------120 122 ------------------118 ----

leu
1500 ---1520 ------------1490 ---------0 ------615 1130 ---600

lys
800 ---------480 ---------800 805 ------------------800 ----

met
510 ---------230 ---------100 500 ------------------510 ----

pro
1100 660 ---1090 790 85 90 1100 ------650 ---715 50 790 ----------

ser
450 ---455 ------------450 ---------440 ------450 25 ---450

thr
650 540 ------160 325 ------30 645 470 ---455 ---540 ---30 ----

val
600 ---590 ------------610 ---------600 ------270 450 ---5

La actividad especfica de cada aminocido debera calcularse como un porcentaje del valor control, encontrando de esta manera el porcentaje de inhibicin de cada uno de los aminocidos y sustratos carbonaos no radioactivos sobre la glucosa marcada.
Tabla II. El efecto en porcentaje de Competidores Sobre la Incorporacin de C14 Glucosa

en Aminocidos.

Sustrato Carbonado o Aminoacido no Radiactivo Control Acetato Alanina Arginina cido Asprtico cido Glutmico Semialdehdo Glutmico Glicina Homoserina Isoleucina -cetoglutarato Leucina Oxalacetato Prolina Piruvato Serina Treonina Valina

Actividad especfica de los Aminocidos (cpm/mol)% ala

100 99 20 100 99 98 100 100 98 100 100 98 76 100 41 60 99 99

arg
100 ----5 --12 99 100 ----------98 ---------

asp
100 83 --100 25 46 99 100 100 100 70 --71 100 85 --99 ---

cys
100 --98 --------100 ------100 ----98 5 --100

glu
100 60 --100 70 8 99 100 ----62 --65 100 74 -------

gly
100 --100 ----100 --50 ------100 --100 100 49 --100

ile
100 ------60 ------35 36 ------------35 ---

leu
100 --100 --------99 ------0 ----41 75 --40

lys
100 ------60 ------100 100 ------------100 ---

met
100 ------45 ------20 98 ------------100 ---

Pro
100 60 --99 72 8 8 100 ----59 --65 5 72 -------

ser
100 --100 --------100 ------98 ----100 6 --100

thr
100 83 ----25 50 ----5 99 72 --70 --83 --5 ---

val
100 --98 --------100 ------100 ----45 75 --1

1) Segn los resultados la Tabla I y la Tabla II, vemos como los aminocidos afectan la radioactividad del mismo aminocido y no de otro ms. Alanina Arginina Glicina Isoleucina Leucina Prolina

2) En los resultados de las tablas tambin podemos observar que algunos aminocidos aparte de afectar la radioactividad del mismo aminocido, afectan a otros diferentes a l y que otros aminocidos que no son parte de las protenas tambin afectan la radioactividad de otros

aminocidos que si forman parte de las protenas. A estos aminocidos los llamaremos competidores.

Grafico I. Aminocidos presentes en cadena proteica

cido Asprtico
Aspartato

cido Glutmico
Arginina

Serina
Alanina

Treonina
Isoleucina

Valina
Leucina

Glutamato

Aspartato

Cisteina

Treonina

Valina

Isoleucina

Glutamato

Glicina

Lisina

Prolina

Leucina

Metionina

Treonina

Serina

Prolina

Valina

Treonina

Grafico II. Aminocidos no presentes en cadena proteica

Homoserina Semialdehido Glutamico

Isoleucina

Prolina

Metionina

Treonina

3) Tambin trabajamos con alfa cetocidos (-cetoglutarato, oxalacetato, piruvato, acetato), observamos que estos compuestos tambin tienen efecto sobre la radioactividad de ciertos aminocidos. Por conocimientos de la va metablica de ciclo del acido ctrico, sabemos que intermediarios de esta va por reacciones qumica se convierten a ciertos aminocidos.

Grafico III. -cetoacidos que tienen efecto sobre la radioactividad de los aminocidos.
Acetato
Aspartato cetoglutarato Aspartato

Oxalacetat o
Alanina

Piruvato

Alanina

Glutamato

Glutamato

Aspartato

Aspartato

Prolina

Prolina

Glutamato

Glutamato

Treonina

Treonina

Prolina

Leucina

Treonina

Prolina

Treonina

Valina

4) Revisando los resultados de la Tabla II y los Grficos I, II y por ltimo el III, nos dimos cuenta de que uno de los aminocidos que ms efecta o inhibe la sntesis de otros aminocidos era el acido asprtico, lo relacionamos con un aminocido, pudimos percatarnos que la mayora de los aminocidos que eran afectados por la Homoserina (Ile, Met,Thr) tambin eran afectados por el c. Asprtico, luego observamos que la Treonina afecta la radioactividad de un aminocido (Ile), aparte del mismo afecta, con quien se acaba la sntesis ya que como se seal en el primer punto, es una protena de fi n de ciclo. Para ver mejor estos resultados, elaboramos la Tabla III, que nos mostrara la relacin entre los aminocidos. 5) Otro aminocido que afecta a varios aminocidos es el cido Glutmico (Arg, Asp, Glu, Pro, Thr), el nico aminocido que afecta la sntesis de aminocidos coincidentes con el Ac. Glutmico es el Semialdehdo Glutmico (Pro).

6) Y por ltimo, observamos que la Serina tambin es otro aminocido que afecta la sntesis de varios aminocidos aparte del mismo (Ala, Cys,Gly, Ala,Leu, Val) y vemos que coincide con un aminocidos que afecta la Valina (Leu ) aparte del mismo. A continuacin la siguiente tabla nos mostrara mejor los resultados obtenidos. Tabla III. El efecto de los Aminocidos Competidores sobre la incorporacin de C14 Proveniente de la glucosa
Aminocido Competidor Aminocidos Afectados Asp Thr Met Ile Lys (Glu)* (Pro)* Thr Met Ile Thr Ile Glu Pro Arg (Asp)* (Thr)* Pro Ser Cys Gly Ala Leu Val Val Leu Inhibicin 75 75 55 40 40 30 28 95 80 65 95 65 92 92 88 54 50 92 94 95 51 40 25 25 99 60 Otros aminocidos significativos no afectados

cido asprtico

Homoserina

Asp Lys Asp Met Lys

Treonina

Acido Glutmico

Semialdehdo Glutmico

Arg Glu

Serina

Valina

()* No se estn considerando estos aminocidos pues probablemente provengan de un proceso de transaminacin de algn intermediario del ciclo de Krebs.

Discusin
Ahora discutiremos los resultados obtenidos para llegar a las conclusiones de nuestro trabajo: En el punto 1) observamos que haban aminocidos que solo afectaban la sntesis de los mismo aminocidos, como por ejemplo Alanina que inhibe a la misma en un 80%, y a ningn otro aminocido mas. As tambin la Glicina que inhibe a la misma en un 50%, no afecta a ningn otro aminocido ms. Entonces llegamos podemos decir que estos aminocidos no son precursores de ningn otro, si no que son el producto final, son los que terminan la va metablica de la biosntesis de aminocidos. En el punto 2) observamos que haba aminocidos que aparte de inhibir la sntesis del mismo, afectaban a ms aminocidos, como por ejemplo el c. asprtico que inhibe a la isoleucina y lisina en un 40%, asi como tambin inhibe a la Metionina en un 55% y a la treonina en un 75%, aunque en los resultados de la tabla tambin aparece que afecta al glutamato y a la prolina, no podemos asegurar esto, pues tambin tenemos conocimiento de que los aminoacidos se sintetizan a partir de los intermediarios del ciclo de Krebs, por una reaccin qumica que ser explicada ms adelante. Entonces podemos deducir que estos aminocidos participan en la sntesis de esos aminocidos a los que inhiben, a estos aa los llamamos competidores. En el punto 3), observamos que los cetocidos (-cetoglutarato, oxalacetato, piruvato) utilizados en el trabajo inhiban tambin la sntesis de los aminocidos. Y de esto tenemos conocimiento pues sabemos que los intermediarios del ciclo de Krebs pueden llegar a convertirse en aminocidos. Basado en la va catablica en la que participen, los aminocidos pueden tener un destino en el cual sus esqueletos de Carbono sean incorporados en intermediarios metablicos que puedan posteriormente transformarse en glucosa, estos son los aminocidos glucognicos. Los aminocidos tambin pueden ser cetognicos, y en este caso sus esqueletos de C son en forma de acetoacetato, el mismo que se puede transformar posteriormente en acetil-CoA. Tenemos conocimiento de que algunos aminocidos se forman gracias a intermediarios del Ciclo del Acido Ctrico o Ciclo de Krebs, por un proceso llamado Transaminacin. La reaccin de aminotransferasa ocurre en dos pasos: 1.- el grupo amino de un aminocido es transferido a la enzima, produciendo el correspondiente a-ceto cido y la enzima aminada Aminocido + enzima D a-ceto cido + E-NH2

2.- El grupo amino es transferido al -ceto cido aceptor (ej. -cetoglutarato) formando el producto aminocido (ej. Glutamato) y regenerando la enzima -cetoglutarato + enzima-NH2 D enzima + glutamato Por ejemplo tenemos que el glutamato se sintetiza a partir de NH4+ y -cetoglutarato por medio de la glutamato deshidrogenasa. La reaccin es la siguiente:

Otro ejemplo es el Aspartato y por este se explica porque no tomamos en cuenta al glutamato como un aminocido que inhibe el c. Asprtico:

Como vemos por el mismo proceso de transaminacin, el glutamato transfiere su grupo amino al oxalacetato para convertirlo en Aspartato. Por este motivo no tomamos en cuenta al glutamato. Un ltimo ejemplo es la Alanina, que se forma gracias a la adicin de un grupo amino al piruvato, la reaccin es la siguiente:

Aunque se ha demostrado que en ciertas especies la serina se puede convertir en piruvato mediante una reaccin catalizada por la desaminacin de serina/treonina deshidratasa, esta actividad de la enzima parece faltar en los seres humanos. Entonces ya despus de esta discusin, por ultimo podemos establecer la familia de sntesis de aminocidos:

Familia del Acido Asprtico

De los datos obtenidos vemos que el Acido Aspartico afecta sntesis de Treonina, Metionina, Isoleucina y Lisina. La Homoserina afecta a sntesis de Treonina, Metionina e Isoleucina. La Treonina participa en la sntesis de Isoleucina. *No se considera a la glutamato pues se sabe que es producto de las reacciones de los intermediarios del ciclo de Krebs, desde Oxalacetato que llega a ser -cetoglutarato y por transaminacin se convierte a glutamato. *La prolina no se considero, pues no es totalmente seguro que el cido asprtico participe en la sntesis de este aminocido, pues su porcentaje de inhibicin es demasiado bajo, mucho mas que la inhibicin del propio Aspartato.

Relacionndolos:

Metionina Homoserina Treonina Acido Asprtico Isoleucina

Lisina

Familia del cido Glutmico

De los datos obtenidos en clase nos damos cuenta que el Acido Glutmico afecta la sntesis del mismo Acido Glutmico, de la Prolina, de la Arginina, del Acido Asprtico y de la Treonina. Continuamos con el -Cetoglutarato que a su vez afecta al Acido Glutmico, a la Prolina, a la Treonina y al Acido Asprtico. Mientras que el Semialdehdo Glutmico afecta prcticamente solo la sntesis de Prolina, es decir la Prolina. *No se consider a la Treonina ni al Aspartato, pues por intermediarios de ciclo de Krebs y el proceso de transaminacin el cido Glutmico es solo un camino, mas no es su precursor. Relacionndolos:

Prolina Semialdehdo Glutmico Glutamina -Cetoglutarato Treonina cido Asprtico cido Glutmico Arginina

Familia de la Serina
Serina participa en la sntesis de Alanina, Cisteina, Glicina, Leucina, Valina. Valina afecta la sntesis de Leucina. Serina se convierte a Piruvato. Piruvato participa en la sntesis de Alanina, Valina. Relacionndolos:

Cistena Alanina

Serina

Piruvato Valina Glicina Leucina

Como nuestra base para el trabajo, fue el conocimiento previo de que los intermediarios del Ciclo del cido Ctrico eran precursores de la mayora de aminocidos. El siguiente grfico nos permitir entender la relacin de esta va metablica con la sntesis de aminocidos.

Conclusiones
Los aminocidos que no inhiben la sntesis de otro aminocido que no sea el mismo, son aminocidos de fin de sntesis, son los que terminan la va metablica. Los aminocidos que inhiben la sntesis de otros aminocidos aparte de a ellos mismos se les denomina competidores, y participan en la sntesis de otros aminocidos. Los aminocidos tambin se sintetizan a partir de intermediarios del ciclo del cido ctrico, por un proceso simple, la transaminacin. Los esqueletos carbonados de los aminocidos provienen de intermediarios de la glicolisis (piruvato), de las vas de las pentosas fosfato o del ciclo del cido ctrico (cetoglutarato, oxalacetato, fumarato, succinato) Las reacciones de transaminacin intervienen en la sntesis de la mayora de aminocidos.

Bibliografa
Armstrong, F Bioqumica. Editorial Reverte, S.A. Barcelona Espaa. 1982 Stryer, Lubert et al, Bioqumica, Quinta Edicin, Editorial W.H. Freeman, EEUU. http://laguna.fmedic.unam.mx/~evazquez/0403/interconversion%20aminoacidos.html