Bioseguridad en Microbiología

Culiacn, Sinaloa, Septiembre de 2009
Manual de Prcticas de Microbiologa
Directorio
Dr. Vctor Antonio Corrales Burgueo Rector Dr. Jos Alfredo Leal Orduo Secretario General Dr. Juan Ignacio Velzquez Dimas Director de Servicios Escolares Dr. Jos de Jess Zazueta Morales Director M en C Mara Luisa Torres Duarte Sub Directora Acadmica QFB Jos Luis Meza Arana Sub Director Administrativo QFB Mara del Refugio Gallardo Rodrguez Jefa de Carrera de QFB Dr. Misael Odn Vega Garca Jefe de Carrera de IBQ Dra. Ana Mara Lpez Beltrn Jefe de Carrera de IQ IQ Juan Bernardo Castaeda Snchez Coordinadora del Departamento de Servicio Social IQ Ladislao Romero Bojrquez Coordinador del Departamento de Control Escolar IQ Ignacio Caldern Ayala Coordinador del Departamento de Planeacin Educativa y Tutoras M en C Mara del Carmen de la Cruz Otero M en C Magdalena de Jess Uribe Beltrn Coordinacin de la Elaboracin de Manuales TI Oscar Francisco Martnez Contreras Asistente Tcnico
FACULTAD DE CIENCIAS QUMICO BIOLGICAS / UAS
CONTENIDO Pg.
1. INTRODUCCIN ......................................................................................4
2. PRCTICAS
2.1 2.2 2.3 2.4 2.5 2.6 2.7 2.8 2.9 2.10 2.11 2.12 2.13 2.14 Micr-01 Bioseguridad en el laboratorio de Microbiologa ....................................... 5 Micr-02 Presencia de microorganismos en la naturaleza ....................................... 11 Micr-03 Forma y agrupamiento de clulas bacterianas.......................................... 15 Micr-04 Preparacin y uso de medios de cultivo para bacterias ............................ 21 Micr-05 Morfologa colonial bacteriana................................................................. 27 Micr-06 Introduccin a pruebas bioqumicas para bacterias .................................. 33 Micr-07 Identificacin microscpica de algas........................................................ 39 Micr-08 Morfologa microscpica de hongos ........................................................ 43 Micr-09 Preparacin de Medios de cultivo para hongos ........................................ 47 Micr-10 Morfologa colonial de hongos................................................................. 51 Micr-11 Identificacin de protozoos de vida libre ................................................. 55 Micr-12 Identificacin microscpica de protozoos intestinales ............................. 59 Micr-13 Identificacin microscpica de protozoos extraintestinales ..................... 65 Micr-14 Uso de agentes fsicos y qumicos en el control de Microorganismos..................................................................................................... 69
3. BIBLIOGRAFA ................................................................................................73 4. ANEXOS ............................................................................................................75

4.1 4.2 4.3 4.4 Actividades previas Preparacin de medios de cultivo Preparacin de soluciones y reactivos Figuras
INTRODUCCIN
El presente Manual de Microbiologa tiene el objetivo primordial de contribuir a que los alumnos adquieran habilidades que los capaciten en los aspectos bsicos para el trabajo en el laboratorio. Debern entrenarse y desarrollarn las habilidades tcnicas fundamentales para trabajar con microorganismos de los diferentes grupos que conforman el mundo microbiano. Esta materia provee los conocimientos necesarios para una mejor comprensin y aprovechamiento de las materias subsecuentes del rea de Microbiologa como son Bacteriologa, Micologa, Virologa y Parasitologa. Por lo tanto, es importante que los alumnos estn conscientes de la importancia del buen aprovechamiento del trabajo de laboratorio y pongan todo su empeo en la obtencin y bsqueda de conocimientos a travs de la realizacin de las prcticas de Microbiologa. Esto seguramente tendr un efecto positivo en su formacin acadmica ya que mediante la observacin y experimentacin complementarn y reforzarn los conocimientos adquiridos en el aula. Al principio, las prcticas estn orientadas hacia la comprensin por parte del alumno, del riesgo inherente al trabajo de laboratorio as como a los cuidados que pueden ayudarles a minimizar ese riesgo. Tambin comprobarn la distribucin cosmopolita de los microorganismos mediante el anlisis microscpico y microbiolgico de muestras que son parte de nuestro entorno.
Universidad Autnoma de Sinaloa Facultad de Ciencias Qumico Biolgicas

Micr-01. Bioseguridad en el laboratorio de Microbiologa
1.0 Objetivos 1.1 Concientizar a los alumnos de los riesgos de trabajo en un laboratorio de Microbiologa. 1.2 Establecer las medidas generales de precaucin y normas bsicas para la prevencin de infecciones en el laboratorio. 1.3 Valorar el efecto de la esterilizacin con productos qumicos, calor hmedo y calor seco sobre la viabilidad de los microorganismos.
2.0 Introduccin El personal que trabaja en un laboratorio est sujeto a diversos riesgos ocupacionales. Los profesionales y estudiantes que manejan agentes infecciosos pueden infectarse y enfermar de manera mas o menos grave, pudiendo quedar afectados a largo plazo. La mayora de las infecciones adquiridas en un laboratorio de microbiologa pueden ser atribudas a errores al realizar procedimientos rutinarios como por ejemplo: 1. Procedimientos tcnicas que involucran el riesgo de inhalacin de bacterias debido a la formacin de aerosoles como la centrifugacin, la homogenizacin y la manipulacin de placas. stos deben realizarse con cubreboca y dentro de una campana de flujo laminar en condiciones de esterilidad. 2. Procedimientos que involucren el riesgo de ingestin. Nunca deber pipetearse con la boca, sino usando una perilla o pipeta automtica. 3. Procedimientos en los que se corre el riesgo de inoculacin. Los pinchazos con material contaminado pueden evitarse teniendo un gran cuidado al aplicar una sustancia o extraer una muestra. El material punzocortante debe desecharse en contenedores rgidos especiales para residuos biolgico-infecciosos. Los microorganismos presentes en sangre y lquidos corporales como los virus de la hepatitis y de la inmunodeficiencia humana, constituyen un grave peligro si se tiene contacto directo con dichos lquidos. Es importante mencionar que la sangre en hemocultivo, las muestras de suero en pruebas para anticuerpos, antgenos o agentes antimicrobianos conservan su infectividad y riesgo potencial. Hay que tener siempre presente que los errores humanos y las prcticas inadecuadas comprometen la seguridad en el laboratorio, por lo que es prioritario que se establezcan y adopten normas apropiadas bsicas para el trabajo y entre el personal de laboratorio, se designen responsables de la supervisin de las diferentes secciones, adems de establecer las medidas de emergencia para actuar en caso de accidente. El uso de bata y calzado cerrado no brinda proteccin suficiente, se requiere
indumentaria adicional para proteger rostro, manos y piernas si hay riesgo de salpicaduras. Medidas generales de precaucin 1. Colocar el material contaminado en un contenedor dispuesto para este propsito. 2. Usar guantes para meter a esterilizar el material sucio. 3. Colocar por separado pipetas, portaobjetos y cubreobjetos contaminados. 4. Desinfectar con fenol, benzal o cloro las mesas, los materiales y las centrfugas que hayan estado en contacto con el material contaminado. 5. Usar siempre bata. 6. Nunca comer, beber, fumar o aplicarse cosmticos en el rea del laboratorio. 7. Evitar accidentes avisando inmediatamente cuando algo se descomponga, se rompa o se contamine. 8. Seguir estrictamente las reglas establecidas de control de calidad en el trabajo que se realiza. 9. Verificar diariamente la temperatura de estufas y autoclaves, as como el estado en general de los aparatos elctricos que se utilizan en el laboratorio. Normas bsicas para prevenir infecciones en el laboratorio 1. No pipetear con la boca. 2. No comer, beber, fumar, almacenar alimentos, aplicarse cosmticos, etc, en el rea de trabajo del laboratorio. 3. Mantener el laboratorio limpio y libre de materiales no relacionados con el trabajo. 4. La superficie de trabajo individual debe descontaminarse con un papel absorbente, esponja o gasa humedecida con un desinfectante (fenol, benzal o cloro) al iniciar y finalizar cada sesin de trabajo. 5. Lavarse las manos despus de manipular agentes infecciosos, material contaminado, animales y cuando abandone el laboratorio. 6. Efectuar cuidadosamente todos los procedimientos para reducir al mnimo la formacin de aerosoles, de preferencia dentro de una campana de flujo laminar. 7. Todo residuo contaminado lquido o slido deber someterse a esterilizacin o incineracin antes de ser desechado. 8. Utilizar guantes en aqullos procedimientos que impliquen contacto directo con material infeccioso. 9. Debe haber una gua disponible para acciones de emergencia. Agentes desinfectantes tiles en el laboratorio Agentes qumicos. Hipoclorito de sodio. Es el agente qumico ms comnmente empleado. Se prepara a partir de soluciones que se expenden en el comercio como blanqueadores de ropa; se diluye a una concentracin final de 10% o bien, se prepara a partir de solucin concentrada. Para desinfectar material de laboratorio se agrega hipoclorito de sodio en un recipiente donde se depositan portaobjetos, cubreobjetos, pipetas Pasteur, pipetas graduadas y se dejan hasta el da siguiente. Posteriormente este material se lava. La solucin de hipoclorito debe permanecer limpia, libre de desechos orgnicos. Debe cambiarse diariamente y mantenerse tapada.
Agentes fsicos. Calor seco. Para esterilizar material de vidrio se utiliza calor seco a 180C, durante un mnimo de 30 minutos. El horno es el equipo recomendado para esto. El material puede estar envuelto en papel, pero de preferencia, se coloca dentro de recipientes adecuados de acero inoxidable (portapipetas o portacajas), siempre acompaados de una tira de papel testigo y con una etiqueta con la fecha y tipo de material. Debe vigilarse que los tubos y pipetas graduadas que contengan puntas y tapones de algodn no se quemen por efecto del calor ya que se producen alquitranes y otras sustancias bactericidas, muy difciles de remover que pueden alterar los resultados en las siguientes ocasiones en que se utilice dicho material. Calor hmedo. Se necesita vapor a presin generado en autoclave u olla express a alta temperatura. Las condiciones ms comnmente empleadas son 121C, con 15 lbs/pulg2 de presin durante 15 minutos. 3.0 Material y equipo - Caja con cultivo bacteriano - Tubo con cultivo de hongos - Tres cajas petri con medio enriquecido (Anexo MicrM-01) - Dos tubos de caldo soya tripticasa (Anexo MicrM-02) - Dos cajas de medio PDA (Anexo MicrM-03) - Mecheros Bunsen - Asas microbiolgicas - Hisopos - Benzal 4.0 Tcnica 1. Escoger un rea de la mesa y dividirla en dos partes iguales. 2. Lavar con agua y jabn una de las partes y luego desinfectar con benzal. 3. Frotar con un hisopo estril el rea desinfectada y estriar en una caja de medio enriquecido previamente rotulada. 4. Frotar con un hisopo estril la zona sin desinfectar y estriar en otra caja petri. 5. Esterilizar un asa en la flama y estriar la tercera caja. 6. Incubar las cajas a 37C durante 24 horas. 7. Preparar el caldo soya tripticasa y vaciarlo en tubos. Cada equipo deber esterilizar slo un tubo. 8. Incubar ambos tubos (el estril y el que no se esteriliz) a 37C durante 24 horas . 9. Continuar con el cultivo fngico sembrando el hongo en una caja de PDA. Posteriormente esterilizar el tubo que contiene el cultivo del hongo y despus de esterilizado, sembrar en la otra caja de PDA e incubar las dos cajas a temperatura ambiente durante 24 horas. 10. Registrar el desarrollo de los cultivos y registrar los resultados.
5.0 Resultados
Area desinfectada
rea sin desinfectar
Asa flameada
Desarrollo en medio estril
Desarrollo en medio sin esterilizar
Cultivo de hongo
Cultivo de hongo esterilizado
6.0 Conclusiones y comentarios 7.0 Bibliografa Nmeros 3 y 5 de la seccin de bibliografa de este Manual 8.0 Anexos 8.1 MicrM-01, 8.2 MicrM-02, 8.3 MicrM-03

REPORTE DE LA PRCTICA Nombre de la prctica: Bioseguridad en el laboratorio de Microbiologa
Nombre del alumno: Grupo: Grado: 5.0 Resultados
Equipo:
Fecha: Carrera:
Area desinfectada
rea sin desinfectar
Asa flameada
Desarrollo en medio estril
Desarrollo en medio sin esterilizar
Cultivo de hongo
Cultivo de hongo esterilizado 9
6.0 Conclusiones y comentarios
Alcanzaron los objetivos? Comentarios:
No
Nombre del Instructor: Firma Sello
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Micr-02. Presencia de microorganismos en la naturaleza.
1.0 Objetivo 1.1 Demostrar la presencia de diversos tipos de microorganismos en la naturaleza. 2.0 Introduccin Los microorganismos se encuentran ampliamente distribuidos en la naturaleza. Sus hbitats naturales son extremadamente diversos. Prcticamente los encontramos en todas partes: en el agua que bebemos, en el aire que respiramos, en el suelo, en los alimentos que ingerimos, algunos pueden vivir en el interior de plantas y animales, incluso dentro de otros microorganismos, sobre nuestra piel, y en general sobre cualquier material que les proporcione nutrientes y condiciones de humedad y temperatura favorables para su desarrollo y multiplicacin. Hay muchos hbitats donde, debido a las extremas condiciones fsicas o qumicas, los organismos superiores no pueden vivir. Sin embargo, existen microorganismos que incluso, crecen mejor en esos ambientes. 3.0 Material y equipo - Frasco gotero con agua estancada - Frasco gotero con suspensin de tierra de jardn - Frasco gotero con agua destilada - Alimento contaminado por hongos (verdura, fruta, pan, tortilla, etc.). - 3 portaobjetos - 3 cubreobjetos - Asa bacteriolgica - Hisopos - Papel absorbente - Cerillos encendedor - Mechero Bunsen - Microscopio 4.0 Tcnica 1. Poner en el centro de un portaobjetos limpio, una gota del agua estancada. 2. Colocar sobre la gota de agua un cubreobjetos, cuidando que no se formen burbujas de aire. 3. Observar al microscopio utilizando primero el objetivo de 10X y posteriormente el de 40X. Dibujar lo observado. 5. Repetir lo anterior para la suspensin de tierra. 6. Colocar en el centro de un portaobjetos limpio una gota de agua destilada. 7. Tomar con el asa bacteriolgica en condiciones aspticas (esterilizar el asa calentndola al rojo vivo sobre la flama del mechero antes y despus de hacer la preparacin) tomar una porcin del desarrollo fngico del alimento y suspenderla en la gota de agua. 8. Colocar un cubreobjetos sobre la preparacin.
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9. Observar al microscopio primero con el objetivo de 10X y posteriormente con el de 40X. 10. Registrar las observaciones y comparar con figuras del anexo 4.4. 5.0 Resultados AGUA ESTANCADA:
10X SUSPENSIN DE TIERRA:
40X
10X
40X ALIMENTO CONTAMINADO POR HONGOS:
10Xl 6.0 Conclusiones y comentarios 7.0 Bibliografa Nmero 10 de la seccin de bibliografa de este Manual. 8.0 Anexos No aplica.
40X
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REPORTE DE LA PRCTICA Nombre de la prctica: Distribucin de los microorganismos en la naturaleza.
Nombre del alumno: Grupo: Grado: 5.0 Resultados Dibujar las observaciones
Equipo:
Fecha: Carrera:
AGUA ESTANCADA:
10X SUSPENSIN DE TIERRA:
40X
10X
40X
ALIMENTO CONTAMINADO POR HONGOS:
10X
40X
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No
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Micr-03. Forma y agrupamiento de clulas bacterianas.
1.0 Objetivos 1.1 Observar el tipo de agrupamiento en ciertos grupos bacterianos de importancia mdica. 1.2 Identificar la importancia de algunos mtodos de coloracin para definir caractersticas o propiedades bacterianas. 1.3 Realizar la tincin de Gram. 2.0 Introduccin Las formas que asumen las bacterias tienen estrecha relacin con las caractersticas propias de su pared celular. Dentro del gran nmero de especies bacterianas que existen, resalta la pobreza morfolgica de stas, considerando que todas las bacterias conocidas y descritas solo presentan dos formas bsicas: cocos (ejemplo peptococcus niger) y bacilos (ejemplo Bacillus antharacis); sin embargo ambas formas presentan modificaciones como los cocobacilos Brucella melitensis, los bacilos en espiral o helicoidiales como Treponema pallidum y Leptospira interrogans, los bacilos curvos como Vibrio cholerae y Campylobacter jejuni y los bacilos delgados fusiformes como Fusobacterium nucleatum. A la vez, esta formas pueden agruparse en dos unidades como los diplococos (Neisseria meningitidis), en cuatro denominadas ttradas (Aerococcus viridans) u ocho denominadas sarcinas (Sarcina spp.) en cadenas cortas o largas como los estreptococos (Streptococcus pneumoniae y S. pyogenes) y los estreptobacilos (Bacillus antharacis), en racimos como los estafilococos (Staphylococcus aureus), o bien agrupndose a semejanza de letras chinas (Corynebacterium diphteriae). Aunque la subdivisin de bacterias segn su forma y agrupamiento permite una separacin burda de grandes grupos bacterianos, se recurre algunas veces a otros parmetros morfolgicos que confieren ms informacin sobre la clula bacteriana, como demostrar por mtodos de tinciones selectivas ciertas estructuras, tales como: cpsula (Haemophilus influenzae [tincin de Gin-tinta china y Anthony]); esporas (Clostridium tetani [tincin de Schaeffer y Fulton]); grnulos metacromticos (Corynebacterium diphteriae [tincin de Albert]) y flagelos (Proteus mirabilis [tincin de Leisfon]). No obstante que se recurre rutinariamente a la observacin de forma, agrupamiento y tincin para iniciar un proceso de identificacin de bacterias, no hay que perder de vista que estos datos iniciales son insuficientes para definir una especie bacteriana, por lo que se requiere sistemticamente de informacin adicional, como: aspectos fisiolgicos y metablicos de las bacterias; adems del apoyo de las caractersticas antignicas y moleculares para identificar un espcimen bacteriano.
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3.0 Material y equipo Cultivos de: Escherichia coli Streptococcus spp Staphylococcus spp Bacillus spp - Asas bacteriolgicas - Portaobjetos de 26 x 76 mm. - Frasco gotero con agua destilada - Puentes para tincin - Reactivos para la tincin de Gram (MicrR-03.1 a MicrR-03.4) - Mecheros de Bunsen - Aceite de inmersin - Papel limpia lentes - Microscopio - Marcador indeleble - Preparaciones fijas de bacterias con diferentes formas y agrupamientos. 4.0 Tcnica Preparaciones de frotes para tincin. 1 Trabajar en un rea de aproximadamente 10 cm de distancia de la flama del mechero (zona considerada estril). 2 Esterilizar el asa, flamendola y enfriarla. 3 Tomar una pequea porcin de una colonia aislada. 4 Resuspender el material del asa en una gota de agua destilada, colocada previamente en un portaobjeto, mezclar y extender la suspensin en un rea de 2 cm como mximo. 5 Secar la preparacin al aire libre. 6 Fijar la preparacin por cuatro o cinco pases sobre la flama del mechero evitando el calentamiento excesivo. 7 Identificar cada preparacin con un marcador indeleble. 8 Colocar el frote sobre el puente de tincin. Tincin 1 Cubrir los frotes con cristal violeta, durante un minuto. 2 Lavar con agua corriente, ligeramente. 3 Cubrir con lugol, durante un minuto. 4 Lavar con agua corriente, ligeramente. 5 Decolorar con la mezcla alcohol-acetona (hasta que no salga colorante). 6 Lavar con agua corriente, ligeramente. 7 Cubrir con safranina (colorante de contraste), durante treinta segundos. 8 Lavar con agua corriente. 9 Secar al aire. 10 Observar al microscopio con objetivo de 100x y comparar con figuras 1 a 8 en anexo 4.4. Interpretacin: Las bacterias que retienen el colorante inicial y se tien de color violeta son Gram positivas y las que se decoloran y adquieren la coloracin roja del colorante de contraste son Gram negativas. (Anexo 4.4).
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5.0 Resultados Complete el cuadro con la morfologa micrsoscpica observada para cada mocroorganismo. Bacteria Escherichia coli Sstapphylococcus spp Streptococcus spp Bacillus subtilis Forma Agrupamiento Afinidad al Gram
7.0 Bibliografa Nmeros 3 y 9 de la seccin de bibliografa de este Manual.
8.0 Anexos 8.1 MicrR-03.1 8.2 MicrR-03.2, 8.3 MicrR-03.3, 8.4 MicrR-03.4 8.5 Figuras 1 a 8.
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HOJA PARA ANOTACIONES
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REPORTE DE LA PRCTICA Nombre de la prctica: Forma y agrupamiento de clulas bacterianas.
Equipo:
Fecha: Carrera:
Complete el cuadro con la morfologa micrsoscpica observada para cada mocroorganismo. Bacteria Escherichia coli Sstapphylococcus spp Streptococcus spp Bacillus subtilis Forma Agrupamiento Afinidad al Gram
No
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Micr-04. Preparacin y uso de medios de cultivo para bacterias.
1.0 Objetivo 1. Sealar los distintos tipos de medio de cultivo 2. Diferenciar entre caldo de cultivo, agar inclinado y agar semislido. 3. Realizar la transferencia asptica de bacterias desde un tipo de medio de cultivo a otro. 2.0 Introduccin Los medios de cultivo tienen cuatro componentes esenciales: fuentes de carbono, nitrgeno, minerales y vitaminas. Como fuente de carbono podemos utilizar sustancias como alcoholes, pentosas, hexosas, disacridos, trisacridos, glicoles, glucsidos, cidos e hidroxicidos. En cuanto a fuentes de Nitrgeno: aminocidos y pptidos, hidrolizados de protena de origen animal o vegetal como la soya, malta o levadura. En el caso de las vitaminas que requieren las bacterias para su desarrollo pertenecen al grupo B y se le agregan al medio de cultivo como mezcla en forma de extracto de levadura o en forma individual. Los minerales se requieren en cantidades muy pequeas y se encuentran como contaminantes en otras sustancias. Los medios de cultivo se pueden clasificar segn su consistencia o su funcin. Por su consistencia: - Lquidos (caldo nutritivo) - Semislidos - Slidos Por su funcin: - Aislamiento - Diferenciales - Selectivos e inhibitorios - Enriquecimiento - Caracterizacin - Mantenimiento Las bacterias se cultivan en diferentes medios para facilitar la identificacin y estudiar su crecimiento y metabolismo, por ejemplo, caldos, agar profundo (tubo), agar en caja, agar semislido, etc. La inoculacin en el medio deben de hacerse sin introduccin de otras bacterias contaminantes. Los caldos de cultivos proveen concentraciones muy elevadas de bacterias en pequeos espacios y son fcilmente transportables. Los tubos de agar inclinado contienen medio de cultivo que solidific en posicin inclinada. Los tubos del agar inclinado igual que el agar en caja de Petri, proveen una superficie de crecimiento, pero los tubos son ms fciles de almacenar y transportar que las cajas petri.
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En el caso del agar profundo se deja solidificar el agar en posicin vertical, y generalmente se usa para el crecimiento de bacterias que necesitan menos oxgeno que el que est presente en la superficie del medio. El agar semislido vertical que contiene 0.5 0.7 % de agar en vez del usual 1.5 %, puede utilizarse para determinar la movilidad. Una bacteria mvil crecer alejndose del punto de inoculacin, dando una apariencia de rbol de navidad invertido. 3.0 Material y equipo - Caldo de Staphylococcus epidermidis - Caldo de Pseudomonas aeruginosa - Tubo inclinado con Proteus vulgaris - 3 tubos con caldo nutritivo (Anexo MicrM-04.1) - 3 tubos con agar nutritivo inclinado (Anexo MicrM-04.2 ) - 3 tubos con agar nutritivo semislido ( Anexo MicrM-04.3) - Asa de inoculacin - Aguja de inoculacin - Mecheros Bunsen - Incubadora - Gradilla - Encendedor - Marcador indeleble 4.0 Tcnica 1. Esterilizar el asa en la flama del mechero hasta el rojo vivo y dejarla enfriar. 2. Tomar una asada de S. epidermidis, destapar el caldo nutritivo cerca de la flama del mechero e inocularlo, agitando el asa dentro del medio. Flamear la boca del tubo y taparlo. Flamear el asa. 3. Tomar otra asada de S. epidermidis y estriar la superficie de un tubo de agar inclinado teniendo cuidado de no rasgar el agar. Flamear la boca del tubo y taparlo. Flamear el asa. 4. Con la aguja de inoculacin picar una colonia de S. lactis e inocular un tubo de agar nutritivo semislido introduciendo la aguja hasta la mitad del medio y retirarla siguiendo el mismo trayecto de la puncin. Flamear la boca del tubo y taparlo. Flamear el asa. 5. Inocular de igual manera P. aeruginosa y Proteus vulgaris en otro caldo nutritivo, agar inclinado y agar semislido. Medio de cultivo Caldo nutritivo Agar inclinado Agar semislido S. epidermidis * * * P. aeruginosa * * * P. vulgaris * * *
6. Rotular todos los tubos e incubar a 37C durante 24 horas. 7. Registrar el desarrollo en cada medio de cultivo. Nota. Trabajar con slo un cultivo bacteriano a la vez, para prevenir cualquier equivocacin o contaminacin cruzada.
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5.0 Resultado Registre el desarrollo de cada cultivo. Medio de cultivo Caldo nutritivo Agar inclinado Agar semislido S. epidermidis P. aeruginosa P. vulgaris
7.0 Bibliografa Nmeros 8 y 9 de la seccin de bibliografa de este Manual
8.0 Anexos 8.1 MicrM-04.1 8.2 MicrM-04.2 8.3 MicrM-04.3 8.4 Figuras 9 a 12
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REPORTE DE LA PRCTICA Nombre de la prctica: Preparacin y uso de medios de cultivo para bacterias.
Nombre del alumno: Grupo: Grado: 5.0 Resultados Registre el desarrollo de cada cultivo. Medio de cultivo Caldo nutritivo Agar inclinado Agar semislido S. epidermidis
Equipo:
Fecha: Carrera:
P. aeruginosa
P. vulgaris
No
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Micro-05. Morfologa colonial bacteriana.
1.0 Objetivo 1. Diferenciar colonias de bacterias aisladas teniendo en cuenta la morfologa colonial de los cultivos: tamao, forma, color, produccin de pigmentos y de hemlisis mediante examen visual. 2.0 Introduccin La caracterizacin macroscpica de las colonias se lleva a cabo mediante el examen visual del desarrollo en la superficie de las placas de agar. Se debe estudiar con cuidado la placa debido a que las bacterias aisladas inicialmente a partir de muestras, constituyen a menudo cultivos mixtos y puede haber una gran variedad de colonias de diversos tipos. Las colonias puntiformes constituidas por bacterias de desarrollo lento, pueden pasar inadvertidas entre las de mayor tamao principalmente si hay una tendencia a la dispersin del desarrollo por toda la superficie de la placa. Durante el examen de las placas se debe de inclinar en distintas direcciones con iluminacin brillante directa, de modo que la luz sea reflejada desde diversos ngulos. En algunos casos se utiliza una lupa o microscopio de diseccin para la mejor identificacin de colonias minsculas o inmaduras, y as observar mejor sus caractersticas morfolgicas en el agar. 3.0 Material y equipo Placas con cultivos de: Streptococcus -hemoltico Pseudomonas fluorescens Proteus spp Lupa 4.0 Tcnica En cultivos bacterianos de 24 horas y con la ayuda de una lupa analizar las siguientes caractersticas: 1. Tamao: Dimetro de la colonia en mm. 2. Forma: puntiformes, circular, fila-mentosa, irregular, rizoide, fusiforme. 3. Elevacin: Colonia plana, elevada, convexa, monticular, umbeliforme, umbilicada. 4. Margen (borde de la colonia): entero, ondulado, lobulado, aserrado, filamentoso, rizado. 5. Color de la colonia: blanco, amarillo, negro, ante, naranja, etc.
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6. 7. 8. 9.
Superficie (luz reflejada): brillante, mate, etc. Densidad (luz transmitida): opaca, translcida, transparente, etc. Consistencia de la colonia: butirosa, viscosa, membranosa, quebradiza. Hemlisis en agar sangre (Se pueden distinguir tres tipo de hemlisis). - alfa: aclaramiento parcial de la sangre alrededor de las colonias, con coloracin verde del medio. - beta: Zona de aclaracin completa de la sangre alrededor de la colonia, debido a la lisis de los eritrocitos. - gamma: No hay cambio en el medio que rodea a la colonia, no hay lisis de los eritrocitos. Adems, puede haber doble zona de hemlisis: se observa halo de lisis completa inmediatamente alrededor de las colonias, con la segunda zona de hemlisis parcial ubicada en la periferia.
10. Produccin de pigmentos en el medio de agar: - Pigmentos hidrosolubles que colorean el medio. - Piocianinas. - Pigmentos fluorocrmicos (fluorescena). - Pigmentos no difusibles, confinados a las colonias. 11. Olor. En algunos casos las bacterias producen olores caractersticos como los que se anotan a continuacin: Bacteria Pseudomonas spp. Proteus spp. Streptomyces spp. Clostridium spp. Olor Zumo de uvas Chocolate quemado Stano enmohecido Ftido, nauseabundo
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5.0 Resultados Comparar las observaciones con anexo 4.4, figuras 13 a 16 y anotar los resultados en la siguiente tabla. Bacteria Pseudomonas spp Olor Morfologa colonial Tamao (mm): Forma: Elevacin: Margen: Color: Consistencia: Tamao (mm): Forma: Elevacin: Margen: Color: Consistencia: Tamao (mm): Forma: Elevacin: Margen: Color: Consistencia: Pccin. de Tipo de pigmentos hemlisis
Proteus spp
Streptococcus -hemoltico
7.0 Bibliografa Nmeros 3 y 9 de la seccin de bibliografa de este Manual 8.0 Anexos 8.1 Figuras 13 a 16
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REPORTE DE LA PRCTICA Nombre de la prctica: Morfologa colonial bacteriana.
Equipo:
Fecha: Carrera:
Registre sus observaciones en la tabla Bacteria Olor Morfologa colonial Pseudomonas spp Tamao (mm): Forma: Elevacin: Margen: Color: Consistencia:
Pccin. de pigmentos
Tipo de hemlisis
Proteus spp
Tamao (mm): Forma: Elevacin: Margen: Color: Consistencia:
Streptococcus -hemoltico
Tamao (mm): Forma: Elevacin: Margen: Color: Consistencia:
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No
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Micr-06. Introduccin a pruebas bioqumicas para bacterias.
1.0 Objetivos 1.1 Llevar a cabo pruebas bioqumicas sencillas para detectar el tipo de metabolismo bacteriano. 2.0 Introduccin El proceso de identificacin de bacterias est basado principalmente en la determinacin de la presencia o ausencia de diferentes enzimas. Estas enzimas dirigen el metabolismo de las bacterias por distintas vas que pueden detectarse con medios especiales de cultivo en el laboratorio. Los sustratos de esas enzimas se incorporan al medio de cultivo junto con un indicador capaz de detectar la utilizacin del sustrato o la presencia de productos metablicos especficos. La fermentacin es un proceso metablico de oxido-reduccin en donde un sustrato orgnico sirve como aceptor electrnico de los electrones, en lugar del oxgeno molecular. En la fermentacin el cido pirvico resultante de la gliclisis finalmente deriva en una variedad de cidos orgnicos como cido actico, propinico, succnico, frmico y otros. Como consecuencia, podemos diferenciar bacterias basndonos en sus reacciones de fermentacin, es decir, los hidratos de carbono que son capaces de utilizar y los tipos y cantidades de cidos mixtos que producen. Otra caracterstica metablica importante que se usa para diferenciar bacterias es la actividad de citocromooxidasa. La presencia de esta enzima indica que la bacteria es capaz de llevar a cabo un metabolismo oxidativo donde se transfieren los hidrgenos del cido pirvico al ciclo de Krebs y el aceptor electrnico final es el oxgeno molecular y se forma agua. As por ejemplo, todo organismo que muestre actividad de citocromooxidasa se excluye de la familia Enterobacteriaceae. 3.0 Material y equipo - Cultivo de Escherichia coli en TSA ( Anexo MicrM-01.2) - Cultivo de Klebsiella pneumoniae en TSA (Anexo MicrM-01.2) - Cultivo de Citrobacter freundii en TSA (Anexo MicrM-01.2) - Cultivo de Pseudomonas spp. - Cinco tubos de agar citrato de Simmons (Anexo MicrM-06.1) - Cinco tubos de agar hierro y lisina (LIA) ( Anexo MicrM-06.2) - Cinco tubos de medio MIO (Anexo MicrM-06.3) - Cinco tubos de rojo de fenol con sacarosa ( Anexo MicrM-06.4) - Discos para oxidasa - Aguja de inoculacin (asa recta) - Hisopos estriles
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4.0 Tcnica 1. Trabajar siempre junto al mechero. Flamear el asa hasta el rojo vivo. Enfriar. 2. Picar una colonia aislada de E. coli . Flamear el tubo de medio fresco y destapar. Sembrar como se describe a continuacin: a) En el medio citrato de Simmons hacer una estra sobre el medio inclinado. b) En el LIA hacer una puncin casi hasta la base del tubo y al retirar el asa estriar la superficie inclinada. c) en el medio MIO inocular por puncin hasta el fondo del tubo. d) En el medio rojo de fenol con sacarosa inclinar el tubo y poner la punta del asa con el inculo en el vidrio, cerca del caldo. Frotar contra el vidrio y enderezar el tubo para que el inculo quede sumergido en el medio. 3. Repetir el procedimiento para Klebsiella pneumoniae en todos los medios. 4. Realizar el procedimiento para Citrobacter freundii en todos los medios. 5. Realizar el procedimiento para Pseudomonas spp. en todos los medios. 6. De cada cultivo bacteriano tomar suficiente cantidad con el hisopo estril y frotarla sobre un disco para oxidasa. Esperar 10 segundos y observar si aparece coloracin. 7. Registrar los resultados para cada bacteria y comparar con figura en anexo 4.4. 8. Incubar todos los tubos a 37 C durante 24 horas. 9. Registrar los resultados al trmino de la incubacin y comparar con figuras 17 a 21 en anexo 4.4. 5.0 Resultados Bacteria Escherichia coli Klebsiella pneumoniae Citrobacter freundii Pseudomonas spp Fermentacin de sacarosa Prueba de oxidasa
Descarboxilacin Lisina / ornitina
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7.0 Bibliografa Nmero 9 de la seccin de bibliografa de este Manual.
8.0 Anexos 8.1 MicrM-01.2 8.2 MicrM-06.1 8.3 MicrM-06.2 8.4 MicrM-06.3 8.5 MicrM-06.4 8.6 Figuras 17 a 21.
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36

REPORTE DE LA PRCTICA Nombre de la prctica: Introduccin a pruebas bioqumicas para bacterias.
Nombre del alumno: Grupo: Grado: 5.0 Resultados Bacteria Escherichia coli Klebsiella pneumoniae Citrobacter freundii Pseudomonas spp Fermentacin de sacarosa
Equipo:
Fecha: Carrera:
Prueba de oxidasa
Descarboxilacin Lisina / ornitina
No
37
38

Micro-07. Identificacin microscpica de Algas.
1.0 Objetivo 1.1 Observar la morfologa de algas en muestras ambientales. 2.0 Introduccin Las algas son organismos aerobios fotosintticos. La mayora son organismos acuticos y microscpicos, aunque existen algas cuyo tamao alcanza varios metros de longitud. Estn muy extendidas en la naturaleza encontrndose en casi todos los ambientes donde hay luz solar, incluso en las regiones polares y en las cumbres de las montaas coloreando el paisaje con los pigmentos de sus clulas. Contienen clorofila y otros pigmentos como carotenoides y ficobilinas. La flora del mar o fitoplancton est constituda por diminutas algas en suspensin y constituye el inicio de la mayora de las cadenas alimentarias acuticas ya que son fuente importante de alimento para otros organismos incluyendo las ballenas. Muchas especies de algas existen como clulas aisladas que pueden ser esfricas, ovaladas o en forma de porra, mviles o inmviles. Otras especies de algas forman colonias pluricelulares de clulas idnticas al quedar unidas despus de la divisin; mientras que otras colonias se componen de diferentes clases de clulas con funciones especializadas. Algunas otras son pluricelulares muy grandes y de morfologa compleja. En agua dulce podemos encontrar algas unicelulares representadas por clorofitas como Chlamydomona, Chlorella, Volvox y Scenedesmus. Estas algas son las responsables del agua verde. Hay tambin algas verdes filamentosas como Cladophora, Oedogonium, Vaucheria y Spirogyra que recubren los objetos y plantas con filamentos de color verde. Las algas azuladas y verde azuladas tapizantes se encuentran tanto en agua dulce como en agua salada y estn representadas por algas cianofitas como Anabaena, Oscilatoria y Ribularia. Las diatomeas abundan tanto en agua dulce y salada, mientras que las algas rojas tapizantes son propias del medio marino. 3.0 Material y equipo - Agua verde - Agua de acuario - Cubreobjetos de 22 x22 mm - Portaobjetos de 26 x 76 mm - Pipeta Pasteur con bulbo - Microscopio ptico
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4.0 Tcnica 1. Con la pipeta Pasteur colocar una gota de cada muestra en un portaobjeto, cubrir con un cubreobjetos y observar con el objetivo de 10X y 40S. 2. Registrar sus observaciones y comparar con figuras 22 a 26 en anexo 4.4. 5.0 Resultados
Agua verde
Agua de acuario
7.0 Bibliografa Nmeros 6 y 10 de la seccin de bibliografa de este Manual. 8.0 Anexos 8.1 Figuras 22 a 26
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REPORTE DE LA PRCTICA Nombre de la prctica: Identificacin microscpica de Algas.
Equipo:
Fecha: Carrera:
Agua verde
Agua de acuario
No
41
42

Micro-08. Morfologa microscpica de hongos.
1.0 Objetivos 1.1 Hacer preparaciones para observar la estructura microscpica del micelio, conidios y cuerpos fructferos de algunos hongos contaminantes de alimentos. 2.0 Introduccin Las caractersticas ms importantes que se utilizan para la identificacin de hongos son la morfologa de sus esporas sexuales y asexuales as como de sus cuerpos fructferos (o estructuras portadoras de cuerpos fructferos) y hasta cierto grado, las caractersticas de su micelio. Estos rganos se examinan directamente al microscopio compuesto. La forma, color, tamao y manera en que se disponen las esporas sobre los esporforos o cuerpos fructferos, as como la forma, color y tamao de stos ltimos son caractersticas que sugieren, si se tiene experiencia en taxonoma de hongos, la clase, orden o el gnero al que pertenece un determinado hongo. Existen muchas clases de esporas asexuales: 1. Conidios. Existen conidios pequeos unicelulares. Los conidios grandes pluricelulares se denominan macroconidios. 2. Esporangiconidios. Se forman dentro de sacos o esporangios que estn en el extremo de hifas denominadas esporangiforo. 3. Artroconidios. Se forman al desprenderse las clulas de la hifa. Son unicelulares 4. Clamidoconidios. Se forman a partir de clulas de las hifas vegetativas. Son esporas unicelulares de paredes gruesas. 5. Blastoconidios. Son las yemas que se forman sobre las clulas de levaduras. Los hongos tambin forman esporas sexuales mediante la fusin de dos ncleos. Son menos abundantes que las esporas asexuales. Dentro de las esporas sexuales se encuentran: 1. Ascosporas. Se producen dentro de un saco denominado asca 2. Basidiosporas. Esporas unicelulares que nacen de una estructura con forma de porra o basidio. 3. Zigosporas. Se forman cuando los extremos de dos hifas sexualmente compatibles se fusionan entre s. Son esporas grandes. 4. Oosporas. Se forman dentro de una estructura femenina denominada oogonio. Tanto las esporas asexuales como las sexuales pueden estar rodeadas de una estructura protectora denominada cuerpo fructfero. Los cuerpos fructferos asexuales se denominan acrvulo y picnidio, los sexuales se conocen como peritecio y apotecio.
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3.0 Material y equipo. - Tortillas con hongos - Naranja con hongos - Pan con hongos - Solucin salina al 0.85% (Anexo MicR-08) - Azul de lactofenol - Portaobjetos de 26x 76 mm - Cubreobjetos de 22 x 22 mm - Asas micolgica - Microscopio - Mechero de Bunsen 4.0 Tcnica 1. Tomar un portaobjetos y depositar una gota de solucin salina. Con el asa micolgica tomar un poco de micelio de la tortilla y depositarlo sobre la gota de solucin salina. Cubrir con un cubreobjeto. 2. En otro portaobjetos repetir el procedimiento con azul de lactofenol . 3. Igualmente hacer dos preparaciones con el hongo del pan y la naranja. 4. Observar las preparaciones al microscopio con objetivos de 10X y 40X. 5. Comprar las observaciones con figuras 27 a 35 en anexo 4.4.
5.0 Resultados Dibuje sus observaciones
Hongo en tortilla 6.0 Conclusiones y comentarios
Hongo en pan
Hongo en naranja
7.0 Bibliografa Nmeros 1, 6 y 10 de la seccin de bibliografa de este Manual. 8.0 Anexos 8.1 MicR-08 8.2 Figuras 27 a 35.
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REPORTE DE LA PRCTICA Nombre de la prctica: Morfologa microscpica de hongos.
Nombre del alumno: Grupo: Grado: 5.0 Resultados Dibuje sus observaciones
Equipo:
Fecha: Carrera:
Hongo en tortilla 40X
Hongo en pan 40X
Hongo en naranja 40X
No
45
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Micro-09. Preparacin de medios de cultivo para hongos.
1.0 Objetivo 1.1 Preparar un medio de cultivo para hongos a base de papa. 2.0 Introduccin Los hongos pueden soportar un ambiente desfavorable mejor que la mayora de los microorganismos. Los hongos filamentosos y las levaduras pueden crecer en un sustrato o medio con concentraciones de azcares que inhiben a la mayora de las bacterias. Los hongos son capaces de utilizar una gran variedad de materiales para su nutricin, sin embargo, son hetertrofos. Al contrario de lo que sucede con algunas bacterias no pueden utilizar compuestos de carbono inorgnicos como el dixido de carbono. El carbono debe proceder de una fuente orgnica como la glucosa. Algunas especies pueden utilizar compuestos de nitrgeno como las sales de amonio. Todos los hongos pueden utilizar el nitrgeno orgnico, razn por la que los medios de cultivo para hongos usualmente contienen peptona, que es un producto a base de protena hidrolizada. 3.0 Material y equipo - Matraces - Vaso de precipitado - Olla de presin - Probeta - Alcohol - Agua destilada - Dextrosa - Extracto de carne - Bactopetona - Balanza analtica - 1 papa - Gasa - Embudo
4.0 Tcnica 1. Pesar Papa ..........................200g Dextrosa....................10g Agar...........................18g Agua purificada...........100ml 2. Se pone a cocer la papa en 500 ml de agua destilada. 3. Se disuelve la dextrosa y el agar en un poco de agua. 4. Cuando la papa est cocida se agrega el agua de cocimiento a la mezcla del paso nmero 2, filtrando con gasa. Se afora con agua destilada a 1000 mL. 5. Esterilizar la mezcla durante 15 minutos a 15 lb/plg2.
47
5.0 Resultados Medio Medio PDA 6.0 Conclusiones y comentarios Color Solidificacin ( buena o mala)
8.0 Anexos
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REPORTE DE LA PRCTICA Nombre de la prctica: Medios de cultivo para hongos.
Equipo:
Fecha: Carrera:
Medio PDA
Color
Solidificacin (buena o mala)
No
49
50

Micro-10. Morfologa colonial de hongos.
1.0 Objetivo 1.1 Observacin de la morfologa colonial de algunos hongos 2.0 Introduccin Los hongos son pequeos organismos productores de esporas, generalmente microscpicos, eucariticos, ramificados y a menudo filamentosos que carecen de clorofila. La mayora de las 100 000 especies de hongos conocidas son estrictamente saprofitas y viven sobre la materia orgnica muerta descomponindola. Alrededor de 50 especies de hongos producen enfermedades en el hombre y casi el mismo nmero ocasiona enfermedades en los animales. Los hongos crecen en dos formas bsicas: levaduras y mohos. El crecimiento del hongo en forma de moho produce colonias filamentosas multicelulares, que constan de tbulos cilndricos ramificados llamados hifas; cada hifa puede tener un grosor uniforme o bien, terminar en porciones ms delgadas o ms anchas. Adems, las hifas pueden ser septadas (con divisiones o tabiques) o cenocticas (contnuas, sin ninguna divisin). El micelio puede clasificarse como reproductor (areo) o como nutritivo. El primero es aqul cuyas hifas se elevan por encima del sustrato donde crece, dando lugar a la formacin de esporas. El segundo es el que penetra en el medio o sustrato y su funcin es de nutricin (vegetativo). El conjunto de micelio y diferentes estructuras de reproduccin constituye la colonia del hongo, la cual presenta un crecimiento radial. 3.0 Material y equipo - Placas con cultivos de hongos - Microscopio estereoscpico - Lupa - Asas micolgicas 4.0 Tcnica 1. Observar a simple vista las colonias de hongos por el frente y reverso de la caja 2. Colocar al caja en el microscopio estereoscpico y observar las colonias de hongos 3. Registrar las observaciones y comparar con figura 36 en anexo 4.4.
51
5.0 Resultados Origen del hongo Color Frente Reverso Aspecto Presencia de Otras micelio Observaciones
7.0 Bibliografa Nmeros 1, 7 y 10 de la seccin de bibliografa de este Manual. 8.0 Anexos
52

REPORTE DE LA PRCTICA Nombre de la prctica: Morfologa colonial de hongos.
Equipo:
Fecha: Carrera:
Origen del hongo
Color Frente Reverso
Aspecto
Presencia de Otras micelio Observaciones
No
53
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Micro-11. Protozoos de vida libre.
1.0 Objetivo 1.1 Identificar protozoos presentes en agua de ro y otros especimenes ambientales.
2.0 Introduccin Los organismos eucariotes se han clasificado dentro de cuatro reinos: Animalia, Fungi, Plantae y Protista. Los tres primeros son grupos monofilticos, bien definidos; en cambio, el Reino Protista contiene un extraordinario nmero de organismos ms relacionados con miembros de otros reinos que con otros protistas. Los protozoos son un eslabn muy importante en la cadena alimentaria en ambientes acuticos. El zooplancton est constituido por protozoos que se alimentan del fitoplancton. Los protozoos a su vez, son alimento de otros organismos marinos mayores. En tierras hmedas pueden vivir como saprfitos y alimentarse de bacterias. Existen reportes de enfermedades causadas por algunos protozoos de vida libre con distribucin mundial, principalmente en EUA, Australia, Nueva Zelanda y Checoeslovaquia; en menor proporcin en India, Africa, Per y Mxico. Como ejemplo, Naegleria que es un protozoo termoflico, se encuentra idealmente entre 30 45 C, mientras que Acanthamoeba entre 25 - 35 C, por lo que se localizan en climas tropicales y subtropicales, en presencia de materia rganica, durante todo el ao. Estos protozoos proliferan en zonas geogrficas templadas durante el verano. Se han detectado en redes pblicas de agua, albercas, estanques, lagos, ros, aguas termales, lodos, suelos desnudos y encharcados, canales artificiales, aguas de desecho industrial, redes de agua potable, agua embotellada, unidades dentales, de dilisis, fisioterapia, y aire acondicionado, as como en materia fecal de diversos animales. 3.0 Material y equipo - Cultivo de paja - Agua de ro - Portaobjetos de 26 x 36 mm - Cubreobjetos de 22 x 22 mm - Pipetas Pasteur - Bulbos de caucho - Microscopio
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4.0 Tcnica 1. Con una pipeta Pasteur tomar agua de ro. 2. Depositarla sobre un portaobjeto. 3. Colocarle un cubreobjeto. 4. Observar al microscopio con el objetivo de 10x y 40x. 5. Repetir el procedimiento con cultivo de paja. 6. Registrar observaciones y comparar con figuras 37 a 38 en anexo 4.4. 5.0 Resultados
Cultivo de Paja
Agua de Ro
10x
40x
7.0 Bibliografa Nmeros 4 y 6 de la seccin de bibliografa de este Manual. 8.0 Anexos 8.1 Figuras 37 a 38
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REPORTE DE LA PRCTICA Nombre de la prctica: Aislamiento e identificacin de Enterobacterias y Pseudomonas. Nombre del alumno: Grupo: Grado: 5.0 Resultados Dibuje sus observaciones Fecha: Carrera:
Equipo:
Cultivo de paja
Agua de ro
10X 6.0 Conclusiones y comentarios
40X
No
57
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Micro-12. Identificacin microscpica de protozoos intestinales.
1.0 Objetivo 1.1 Observar protozoos intestinales pertenecientes a las principales clases para identificar sus principales caractersticas morfolgicas. 2.0 Introduccin Los protozoos son protistas eucariticos que existen como clulas aisladas y que pueden distinguirse de otros protistas eucariticos por su capacidad de desplazarse durante algn estado de su ciclo biolgico y por su falta de pared celular. Los protozoarios muestran una considerable variedad de formas y tamaos. Algunos son alargados o esfricos, otros son ovalados y otros presentan diferentes aspectos morfolgicos en los diferentes estados de su ciclo biolgico. Una clula tpica de un protozoo est rodeada por una membrana citoplasmtica. Muchos poseen una capa externa de citoplasma, el ectoplasma, que se distingue del citoplasma ms interno o endoplasma. La mayora de las estructuras celulares se encuentran en el endoplasma. Cada clula de protozoo tiene al menos un ncleo. Sin embargo, muchos protozoos poseen mltiples ncleos durante la mayor parte de su ciclo biolgico. Algunos protozoos pueden formar quistes. De esta manera las formas vegetativas o trofozoitos se protegen de la desecacin, el agotamiento de los alimentos o la acidez gstrica cuando estn dentro del husped. El estado de desarrollo de un protozoo parsito que se transmite de un husped a otro es el quiste resistente. Algunos protozoos son parsitos del hombre y le causan enfermedades graves. 3.0 Material y equipo - Materia fecal - Preparaciones de: - Entamoeba histolytica - Entamoeba coli - Giardia spp - Chilomastix mesnilii - Portaobjetos de 26 x 76 mm - Cubreobjetos de 22 x 22 mm - Lugol parasitolgico (Anexo MicrR-03.2) - Solucin salina - Aplicadores de madera
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4.0 Tcnica 1. Observar cada una de las preparaciones disponibles con objetivos de 10X y 40X. 2. Registrar sus observaciones y comparar con figuras de anexo 4.4. 3. Colocar en un portaobjetos una gota de solucin salina isotnica. 4. Con un aplicador de madera tomar una pequea muestra de heces. 5. Mezclarla con la solucin salina isotnica procurando hacer una suspensin, no un frote. 6. Quitar de la suspensin fibras y otros elementos slidos. 7. Cubrir con un cubreobjetos y observar con objetivos de 10X y 40X. 8. Repetir el procedimiento Lugol. 9. Registrar sus observaciones y compararlas con anexo 4.4, figuras 39 a 43. 5.0 Resultados Observacin de preparaciones
Observacin de materia fecal
Solucin salina
Lugol
60
8.0 Anexos 8.1 MicrR-03.2 8.2 Figuras 39 a 43.
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REPORTE DE LA PRCTICA Nombre de la prctica: Identificacin microscpica de protozoos intestinales.
Nombre del alumno: Grupo: Grado: 5.0 Resultados Observacin de preparaciones
Equipo:
Fecha: Carrera:
Observacin de materia fecal
Solucin salina
Lugol
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No
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Micro-13. Identificacin microscpica de protozoos extraintestinales.
1.0 Objetivo 1.1 Observar las caractersticas morfolgicas de algunos protozoos extraintestinales de inters mdico.
2.0 Introduccin Dentro de los protozoos flagelados, adems de los intestinales, existe otro grupo, los hemoflagelados que son formas de la sangre o los tejidos. Los gneros de estos organismos son Trypanosoma y Leishmania. La tripanosomiasis comprende la enfermedad africana del sueo, mientras que la leishmaniasis abarca lesiones de la piel u rganos viscerales dependiendo de la especie. Estos protozoos son transmitidos a las personas por insectos chupadores de sangre causando infecciones graves. En el grupo de los esporozoos se encuentran parsitos con ciclos de vida complicados, ya que algunos estados pueden existir en un husped y otros, en un husped diferente. La toxoplasmosis y la malaria son las principales enfermedades humanas causadas por esporozoos. Los esporozoos ms importantes son los causantes de la malaria y pertenecen al gnero Plasmodium. En este padecimiento los esporozoitos infectan el hgado y los glbulos rojos. 3.0 Material y equipo - Preparaciones de: - Leishmania spp - Tripanosoma cruzi - Plasmodium spp - Microscopio ptico - Papel limpialentes - Aceite de inmersin 4.0 Tcnica 1. Observar detenidamente al microscopio con los objetivos de 40X y 100X cada una de las laminillas disponibles y registrar sus observaciones. 2. Comparar con figuras 44 y 45 en anexo 4.4.
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5.0 Resultados
Leishmania spp.
Trypanosoma cruzi
Plasmodium spp.
8.0 Anexos 8.1 Figuras 44 a 45
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REPORTE DE LA PRCTICA Nombre de la prctica: Identificacin microscpica de protozoos extraintestinales.
Equipo:
Fecha: Carrera:
Leishmania spp.
Trypanosoma cruzi
Plasmodium spp.
No
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Micro-14. Uso de agentes fsicos en el control de microorganismos.
1.0 Objetivo 1.1 Llevar a cabo un mtodo fsico para control de microorganismos. 2.0 Introduccin El control de microorganismos es esencial en la prevencin de enfermedades as como para retardar la descomposicin y deterioro de productos alimenticios. Los microorganismos se controlan mediante agentes fsicos y qumicos. Los agentes fsicos incluyen mtodos de control como el uso de altas o bajas temperaturas, desecacin, presin osmtica, radiacin UV, radiacin ionizante y filtracin. El control mediante agentes qumicos se refiere al uso de desinfectantes, antispticos, antibiticos y otras sustancias qumicas. 3.0 Material y equipo Sesin 1 - 5 cajas de Agar soya tripticasena (Anexo MicrM-01.2) - Cultivo en caldo de E. coli - Campana o lmpara con luz ultravioleta - Hisopos estriles - Tijeras - Cartoncillo - Marcador 4.0 Tcnica 1. Introducir un hisopo estril en el cultivo. 2. Remover el exceso de lquido presionando el hisopo contra la pared del tubo. 3. Tomar una caja de TSA y estriar la superficie del agar hasta cubrirla totalmente. 4. Repetir los pasos 1-3 con las cuatro cajas restantes. 5. Exponer tres de las cajas a luz UV como se indica: a. Remover la tapa de cada una de las 3 cajas y colocar un crculo de cartoncillo con un crculo interior recortado de modo que por ah pase la luz UV. b. Exponer la primera caja durante 3 segundos, la segunda por 10 segundos y la tercera por 60 segundos. c. Tapar de nuevo las cajas e incubar a temperatura ambiente durante 24 horas. 6. En la cuarta caja, dejar la tapa puesta y colocar el cartoncillo sobre ella. 7. Exponerla a luz UV durante 60 segundos e incubarla a temperatura ambiente durante 24 horas. 8. Utilizar la quinta caja como control no irradiado e incubarla con las otras cajas.
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5.0 Resultados Dibuje los resultados en las cinco cajas del experimento con luz UV.
Control no irradiado
Exposicin UV 3 segundos Exposicin UV 10 segundos
Exposicin UV 60 segundos
Exposicin UV 60 segundos con tapa
7.0 Bibliografa Nmero 8 de la seccin de bibliografa de este Manual. 8.0 Anexos 8.1 MicrM-01.2
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REPORTE DE LA PRCTICA Nombre de la prctica: Uso de agentes fsicos y qumicos en el control de microorganismos. Nombre del alumno: Grupo: Grado: 5.0 Resultados Dibuje los resultados en las cinco cajas del experimento con luz UV. Fecha: Carrera:
Equipo:
Control no irradiado
Exposicin UV 3 segundos Exposicin UV 10 segundos
Exposicin UV 60 segundos
Exposicin UV 60 segundos con tapa
71
No
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BIBLIOGRAFA
1. 2. 3.
Agrios, G.N. Fitopatologa. Mxico. Ed. Limusa. 1998. Freggiaro L. E. Atlas de parasitologa on line. Foro bioqumico. Facultad de Medicina. UNAM. Manuales departamentales. Fascculo II Bacteriologa. Mxico. 1996. Frederick L. Schuster. Cultivation of Pathogenic and Opportunistic FreeLiving Amebas. Clinical Microbiology Reviews, 2002; 15: 342-354, Vol. 15. American Society for Microbiology. Giono, C.S., A. Escobar, J.L. Valds. Diagnstico de laboratorio de infecciones gastrointestinales. Mxico.1994. Instituto Geogrfico de Agostini. Ciencias de la naturaleza. Botnica I, Vol. 4. Espaa. Ed. Planeta. 1997. Jawetz, Melnick and Adelberg. Microbiologa mdica.. Naget Arsof. Mxico 17 ed. El manual moderno. 2001. Trad. Ilian
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6.
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9.
10.
73
74
ANEXOS 4.1 Actividades previas a las prcticas: Micro-01 1. Mencione las importancias de la implementacin de medidas de bioseguridad en un laboratorio de microbiologa 2. Mencione qu indumentaria sera la adecuada para trabajar con muestras obtenidas de pacientes con ntrax en un laboratorio de microbiologa. 3. Mencione tres acciones incorrectas que podran conducir a un accidente grae en el laboratorio cuando se trabaja con sangre contaminada por VIH Micro-02 1. A qu se debe la amplia distribucin de los microorganismos en la naturaleza? 2. Cmo se transfierien los microorganismos de un lugar a otro? 3. Qu propiedades de un microorganismo determinan su carcter til o perjudicial? Micro-03 4. Enuncie el fundamento de la tincin de Gram. 5. Explique la causa por la que las clulas Gram positivas retienen el colorante y las Gram negativas lo pierden durante el proceso de decoloracin 6. Describa la utilidad diagnstica de la reaccin a la tincin Gram de las bacterias. Micro-04 1. Mencione las caractersticas nutritivas que debe contener un medio de cultivo 2. Qu importancia tiene la correcta preparacin de un medio de cultivo? 3. Mencione cundo utilizara un caldo, un agar inclinado y un agar semislido. Micro-05 1. Mencione que debe hacer al inspeccionar una placa para que no pasen inadvertidas las colonias de bacterias de desarrollo lento. 2. Explique la utilidad y/o importancia del estudio de la morfologa colonial bacteriana en el diagnostico clnico. Micro-06 1. Si una bacteria es capaz de fermentar azcares qu tipo de metabolismo realiza? y qu significa esto, en trminos bioqumicos? Explique. 2. Cules son las implicaciones de que una bacteria realice metabolismo oxidativo? 3. Mencione tres bacterias fermentativas 4. Explique en qu consiste el proceso de descarboxilacin de ornitina y lisina y qu enzimas intervienen.
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Micro-07 1. Cmo se clasifican las algas?. Esquematiza cada grupo 2. Cul es la importancia de este grupo de microorganismos? 3. Qu medios de cultivo se utilizan para el cultivo y aislamiento de algas? Micro-08 1. Qu diferencias existen en la morfologa microscpica de los hongos filamentosos (mohos) y los levaduriformes (levaduras)? 2. En qu ambientes se encuentran este tipo de microorganismos? 3. Cules son las condiciones ptimas para el crecimiento de hongos y levaduras? Micro-09 1. Mencione tres medios de uso general en el laboratorio 2. Qu tipo de medio es el medio PDA? 3. Por qu se utiliza papa, qu sustancias o nutrientes cree que aporta el medio? Explique. Micro-10 1. Mencione las diferencias entre la morfologa colonial bacteriana y la morfologa colonial de hongos. Micro-11 1. Qu tipos de locomocin presentan los protozoarios? Esquematiza cada grupo 2. Qu condiciones se necesitan para el crecimiento saprofito de un microorganismo? Micro-12 1. Investigar la clasificacin de los protozoarios. 2. Mencione las diferencias que existen entre el quiste de Giardia lamblia y el de Entamoeba coli? 3. En qu tipo de muestras podemos ver los trofozoitos? 4. Cul es la utilidad de la solucin salina y el lugol en la observacin de amibas? Micro-13 1. En qu grupos o subphyla se encuentran los protozoarios que causan enfermedades extraintestinales en el hombre? 2. Cmo se transmiten estas enfermedades? 3. Mencione las caractersticas ms importantes del ciclo de vida de estos protozoarios Micro-14 1. Explique cmo la longitud de onda y el tiempo de exposicin influyen en el efecto bactericida de luz ultravioleta. 2. Describa especficamente cmo la luz UV mata a los microorganismos 3. Explique por qu la luz UV es til solamente en el control de contaminantes superficiales y mencione varias aplicaciones prcticas.
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4. Investigue de qu manera la radiacin ionizante mata a los microorganismos y mencione algunas aplicaciones prcticas. 5. Defina los siguientes trminos desinfeccin, desinfectante y antisptico 6. Mencione por qu los agentes qumicos no son efectivos para esterilizar 7. Mencione cinco factores que pueden afectar la accin antimicrobiana de desinfectantes y antispticos 8. Describa los modos de accin de desinfectantes y antisptico 9. Explique por qu los resultados para una prueba in vitro para evaluar agentes qumicos no necesariamente funcionar in vivo
4.2 Preparacin de medios de cultivo MicrM-01.1 Medio enriquecido MicrM-01.2 Medio soya tripticasena (TSA) - Suspender 40 g del medio deshidratado en un litro de agua destilada - Calentar agitando frecuentemente durante 1 minuto hasta disolver - Esterilizar en autoclave entre 118 y 121 C durante 15 minutos - Enfriar y vaciar en placas petri MicrM-01.3 Medio PDA - Disolver 39 g en un litro de agua destilada - Esterilizar en autoclave durante 15 minutos a 121 C - pH final: 3.5 MicrM-04.1 Caldo nutritivo - Disolver 8 g en un litro de agua destilada - Distribuir en tubos de 13 x 100 - Esterilizar en autoclave a 121 C durante 15 minutos MicrM-04.2 Agar nutritivo inclinado - Disolver 20 g en un litro de agua destilada - Distribuir en tubos de 13 x 100 - Esterilizar en autoclave a 121 C durante 15 minutos - Dejar solidificar en posicin inclinada MicrM-04.3 Agar nutritivo semislido - Disolver 10 g en un litro de agua destilada - Distribuir en tubos de 13 x 100 - Esterilizar en autoclave a 121 C durante 15 minutos - Dejar solidificar en posicin vertical MicrM-06.1 Agar citrato de Simmons - Suspender 24.2 g del medio deshidratado en 1 litro de agua destilada - Calentar agitando frecuentemente hasta ebullicin y completa disolucin. - Distribuir en volmenes de 3 mL en tubos de 13 x 100 mm. - Esterilizar a 121C durante 15 minutos. - Dejar enfriar los tubos en posicin inclinada de manera que el medio de cultivo en el fondo del tubo alcance una profundidad de 1 a 1.5 cm.
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MicrM-06.2 Agar hierro y lisina - Suspender 33 g del medio deshidratado en 1 litro de agua destilada - Calentar cuidadosamente agitando con frecuencia hasta hervir por 1 minuto - Distribuir el medio en volmenes de 3 mL, en tubos con tapn de rosca de 13 x 100 - Esterilizar a 121C durante 12 minutos - Dejar solidificar en posicin inclinada y cerrar con cuidado las tapas para evitar prdida de agua por evaporacin pH final: 6.5 +/- 0.2 MicrM-06.3 Medio MIO - Disolver 31 g del medio deshidratado en un litro de agua destilada - Calentar hasta ebullicin - Distribuir volmenes de 2 - 2.5 mL en tubos de 13 x 100 mm. - Esterilizar en autoclave a 121C durante 15 minutos. - Dejar solidificar en posicin vertical. MicrM-06.4 Rojo de fenol con sacarosa - Suspender y disolver completamente 20 g del polvo en un litro de agua destilada (en caso de que el medio sea para cultivo de anaerobios, agregar 0.5 a1.0 g de agar) - Envasar volmenes de 2.5 mL en tubos de ensaye de 13x 100 - Esterilizar de 116-118 C durante 15 minutos. No sobrecalentar 4.3 Preparacin de soluciones y reactivos MicrR-03.1 Cristal violeta Cristal violeta............................2 g Alcohol etlico al 95%...............20 mL Oxalato de amonio.....................0.8 g Agua destilada............................80 mL Disolver el cristal violeta en el alcohol etlico al 95% y filtrar en papel filtro. Disolver el oxalato de amonio en el agua destilada. Mezclar estas soluciones en partes iguales 24 horas antes de su uso MicrR-03.2 Solucin de lugol Yoduro de potasio.......................2 g Yodo (cristales)............................1.0 g Agua destilada..............................300 mL Disolver el yoduro de potasio (KI) en el agua destilada. Adicionar los cristales de yodo a la solucin de yoduro de potasio y agitar hasta que el yodo se disuelva. Adicionar agua destilada hasta completar el volumen de 300 mL MicrR-03.3 Alcohol acetona Alcohol etlico al 95% Acetona Mezclar el alcohol etlico al 95% y acetona en partes iguales
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MicrR-03.4 Safranina Safranina.......................................2.5 g Alcohol etlico al 95%..................1000 mL Disolver la safranina en el alcohol etlico al 95%. Esta solucin constituye la solucin stock. En el momento de usarla se diluyen 10 mL de esa solucin en 100 mL de agua destilada. MicrR-08 Solucin salina al 0.85% Cloruro de sodio...........................0.85 g Disolver el cloruro de sodio en 100 mL de agua destilada.
79
Anexo Imgenes Fig. 1 Cocos Fig. 2 Bacilos
Fig. 3. Etreptococos
Fig. 4 Estreptococos
Fig. 5. Estreptobacilos
Fig. 6. Estafilococos
Fig. 7 Reaccin Gram positiva
Fig. 8 Reaccin Gram negativa
80
Fig. 9 Medios de cultivo lquidos
Fig. 10 Medios de cultivo inclinados
Fig. 11 Medios de cultivo semislidos
Fig. 12 Medios de cultivo en placa
Fig. 13 Morfologa colonial bacteriana
81
Fig. 14 Hemlisis Beta
Fig. 15 Hemlisis alfa
Fig. 16 Hemlisis Gamma
Fig. 17 Citrato de Simmons
Fig. 18 Agar hierro y lisina
Fig. 19 Medio MIO
Fig. 20 Rojo de fenol con sacarosa
Fig. 21 Prueba de oxidasa
82
Fig. 22 Euglenfitos y crisfitos pertenecientes a distintos rdenes
83
Fig. 23 Pirrfitos pertenecientes a rdenes y clases distintas
84
Fig. 24 Diseos aerodinmicos de Diatomeas.
Fig. 25 Porphyrium spp, alga roja de agua dulce.
Fig. 26 Phacus longicauda euglenfito de agua dulce.
85
Fig. 27 Cuerpos fructfero de Aspergillus spp
Fig. 28 Cuerpos fructferos de Penicillium spp
Fig. 29 Esporangios, esporangiforos y esporangiosporas
86
Fig. 30 Esporas de Alternaria spp
Fig. 31 Esporas de Fusarium spp
Fig. 32 Micrografa electrnica de barrido de esporas de Penicillium spp.
Fig. 33 Micrografa electrnica de barrido de Aspergillus spp.
Fig. 34 Unin de hifas para formar Zigosporas
Fig. 35 Micrografa electrnica de barrido de un esporangio de Rhizopus spp
87
Fig. 36 Morfologa colonial de hongos ( cultivos de Penicillium spp).
Fig. 37 Euplotes spp.
Fig. 38 Paramecium
88
Fig. 39 Trofozoito de Giardia duodenalis
Fig. 40 Trofozoitos de Entamoeba histolytica
Fig. 41 Quiste de Entamoeba histolytica
Fig. 42 Quiste de Entamoeba coli
89
Fig. 43 Chilomastix mesnili
Fig. 44 Plasmodium spp en frote sanguneo
Fig. 45 Trypanosoma cruzi
90

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Culiacn, Sinaloa, Septiembre de 2009

Manual de Prcticas de Microbiologa

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3. BIBLIOGRAFA ................................................................................................73 4. ANEXOS ............................................................................................................75

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Desarrollo en medio estril

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Cultivo de hongo esterilizado

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Nombre del alumno: Grupo: Grado: 5.0 Resultados

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Cultivo de hongo esterilizado 9

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6.0 Conclusiones y comentarios

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10X SUSPENSIN DE TIERRA:

40X ALIMENTO CONTAMINADO POR HONGOS:

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6.0 Conclusiones y comentarios

7.0 Bibliografa Nmeros 3 y 9 de la seccin de bibliografa de este Manual.

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