DESENVOLVIMENTO E VALIDAO DE METODOLOGIA ANALTICA

Lopes, Jeane1
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Jeane Cndida Lopes

(Ps-graduao em Controle de Qualidade na Indstria Farmacutica) Resumo Para comprovao da qualidade dos produtos uma srie de ensaios deve ser realizada, incluindo mtodos qumicos, mtodos volumtricos, mtodos gravimtricos, mtodos espectromtricos, mtodos eletroanalticos e mtodos cromatogrficos. Dentre os mtodos de quantificao do ativo, os mais comumente usados so os mtodos espectrofotomtricos de absoro no UV/Vis e a cromatografia lquida. Aps o desenvolvimento do mtodo analtico torna-se necessrio valid-lo. A validao deve garantir, por meio de estudos experimentais, que o mtodo atenda s exigncias das aplicaes analticas, assegurando a confiabilidade dos resultados. Para tanto, deve apresentar especificidade, linearidade, intervalo, preciso, sensibilidade, limite de quantificao, exatido, adequados anlise.
Palavras chave: Desenvolvimento Analtico, Validao Analtica, Espectrometria UV/Vis, Cromatografia Lquida.

O controle de qualidade a parte da indstria farmacutica referente amostragem, especificaes, ensaios, procedimentos de organizao, documentao e procedimentos de liberao que asseguram que os ensaios necessrios e relevantes sejam executados e que os materiais no so liberados para uso, nem os produtos liberados para venda ou fornecimento, at que a qualidade dos mesmos seja julgada satisfatria (RDC n 210, de 04 de agosto de 2003). Para comprovao da qualidade dos produtos uma srie de ensaios deve ser realizada, podendo se basear em reaes qumicas (mtodos qumicos); mtodos volumtricos (mtodo quantitativo para determinar a concentrao desconhecida de um analito, exemplo: titulao); mtodos gravimtricos (determina a quantidade proporcional de um composto presente em uma amostra, exemplo: mtodos precipitao); mtodos espectromtricos (baseados na interao da radiao eletromagntica com o analito para identific-lo ou determinar sua concentrao, exemplo: espectrmetro UV/VIS, ndice de Refrao, Polarmetro); mtodos eletroanalticos (mtodos que empregam as propriedades eletroqumicas de uma soluo para determinar a concentrao do analito, exemplo: Condutimetria, Potenciometria) e mtodos cromatogrficos (mtodos de separao de misturas

complexas cujo objetivo separar os diferentes componentes de uma mistura, permitindo identifica-los e quantific-los). Para definir um mtodo analtico necessita-se primeiramente definir os objetivos do mtodo, focalizando em anlise que envolvem a deteco ou quantificao do ativo, tentando eliminar as impurezas que podem interferir na anlise. Uma pesquisa bibliogrfica abrangente das propriedades fsicas e qumicas do analito (e outros compostos relacionados estruturalmente) essencial para garantir o sucesso do mtodo analtico. Verificando tambm a presena mtodos relacionados ao ativo nos compndios oficiais. Dentre os mtodos de quantificao do ativo, os mais comumente usados so os mtodos espectrofotomtricos de absoro no UV/Vis e a cromatografia lquida. A espectroscopia com deteco UV/Vs menos onerosa, mais facilmente exeqvel no controle de qualidade de matria-prima e produtos farmacuticos, alm de apresentar um valor agregado menor, em vista dos mtodos cromatogrficos (M.P. Siqueira-Moura, Et. al; 2008). A avaliao da presena ou no de grupos cromforos deve ser realizada para metodologias por espectro de absoro no UV-Vis, alm da escolha ser preferencialmente para formas farmacuticas de monofrmacos, deve ser avaliar de composio de placebo ou demais interferentes, absortividade molar versus a menor Dose para verificar a sensibilidade do mtodo, a estabilidade de soluo e a variao do comprimento de onda ao longo do pH. Se todas essas variveis apresentarem-se vlidas, o mtodo espectrofotmetro o mtodo de escolha na anlise quantitativa do ativo. A cromatografia lquida apresenta vantagens na eficincia, sensibilidade, especificidade e rapidez (Naik, 2001). Alm disso, a tcnica de CLAE permite a quantificao de cada composto numa nica corrida cromatogrfica, ou seja, um mtodo prefervel para formas farmacuticas multicomponentes ou com problemas de interferncias de matrix ou ainda em situaes onde uma maior sensibilidade necessria. Deve ser avaliar a escolha do detector (RID, UV-Vis, DAD, FLU, ELSD) em relao aos compostos de interesse, avaliar a composio de placebo ou demais interferentes, a estabilidade de soluo e se o mtodo cromatogrfico apresenta robusto. Se a opo for por uma metodologia alternativa deve se justificar e enumerar pontos crticos a serem testados para o desenvolvimento do mtodo analtico. Aps o desenvolvimento do mtodo analtico torna-se necessrio valid-lo. A validao tem como objetivo principal assegurar que determinado procedimento

analtico fornea resultados reprodutveis e confiveis, que sejam adequados aos fins para os quais tenha sido planejado. A validao deve garantir, por meio de estudos experimentais, que o mtodo atenda s exigncias das aplicaes analticas, assegurando a confiabilidade dos resultados. Para tanto, deve apresentar especificidade, linearidade, intervalo, preciso, sensibilidade, limite de quantificao, exatido, adequados anlise (RE n 899, de 29 de maio de 2003). Para se desenvolver uma validao, os seguintes pontos so primeiramente delineados: o objetivo do mtodo, os parmetros de desempenho e critrios de aceitao, desenvolver o protocolo de validao, os experimentos de validao, executar o protocolo de validao e expressar os resultados encontrados no relatrio de validao. Protocolo (ou Plano) de Validao (PV): documento que descreve as atividades a serem realizadas na validao de um projeto especfico, incluindo o cronograma, responsabilidades e os critrios de aceitao para a aprovao de um processo produtivo, procedimento de limpeza, mtodo analtico, sistema computadorizado ou parte destes para uso na rotina (RDC n 210, de 04 de agosto de 2003). Os parmetros de desempenho de uma validao analtica encontra-se na RE 899, Guia para validao de mtodos analticos e bioanalticos, descrito da seguinte forma: A especificidade e a seletividade a capacidade que o mtodo possui de medir exatamente um composto em presena de outros componentes tais como impurezas, produtos de degradao e componentes da matriz. Para avaliar esses outros componentes emprega-se o uso de padres de produtos de degradao, impurezas padres e amostras armazenadas sob condies de estresse (por ex. luz, calor umidade, hidrlise cida/bsica, oxidao). A linearidade a capacidade de uma metodologia analtica demonstrar que os resultados obtidos so diretamente proporcionais concentrao do analito na amostra, dentro de um intervalo especificado. Obtido atravs de uma curva de calibrao realizada com concentraes diferentes do analito. O intervalo especificado a faixa entre os limites de quantificao superior e inferior de um mtodo analtico. Normalmente derivado do estudo de linearidade e depende da aplicao pretendida do mtodo. A preciso a avaliao da proximidade dos resultados obtidos em uma srie de medidas de uma amostragem mltipla de uma mesma amostra. Esta considerada

em trs nveis: Repetibilidade (preciso intra-corrida): concordncia entre os resultados dentro de um curto perodo de tempo com o mesmo analista e mesma instrumentao, Preciso Intermediria (preciso inter-corridas): concordncia entre os resultados do mesmo laboratrio, mas obtidos em dias diferentes, com analistas diferentes e/ou equipamentos diferentes e a Reprodutibilidade (preciso interlaboratorial): concordncia entre os resultados obtidos em laboratrios diferentes como em estudos colaborativos, geralmente aplicados padronizao de metodologia analtica, por exemplo, para incluso de metodologia em farmacopeias. Limite de deteco a menor quantidade do analito presente em uma amostra que pode ser detectado, porm no necessariamente quantificado, sob as condies experimentais estabelecidas. O limite de deteco estabelecido por meio da anlise de solues de concentraes conhecidas e decrescentes do analito, at o menor nvel detectvel. Limite de Quantificao a menor quantidade do analito em uma amostra que pode ser determinada com preciso e exatido aceitveis sob as condies experimentais estabelecidas. estabelecido por meio da anlise de solues contendo concentraes decrescentes do frmaco at o menor nvel determinvel com preciso e exatido aceitveis. A exatido de um mtodo analtico a proximidade dos resultados obtidos pelo mtodo em estudo em relao ao valor verdadeiro. Pode se avaliada em relao ao frmaco, a Forma Farmacutica e as Impurezas. A robustez de um mtodo analtico a medida de sua capacidade em resistir a pequenas e deliberadas variaes dos parmetros analticos. Indica sua confiana durante o uso normal. Durante o desenvolvimento da metodologia, deve-se considerar a avaliao da robustez. Constatando-se a susceptibilidade do mtodo variaes nas condies analticas, estas devero ser controladas e precaues devem ser includas no procedimento. Basicamente os critrios de aceitao dos parmetros de validao so os seguintes:
Demonstrao dos valores preconizados e obtidos segundo o mtodo analtico Parmetros RE n 899 ANVISA Seletividade/Especificidade 95% e 105% Linearidade r 0,99 Preciso Repetitividade DPR 5,0% Preciso Intermediria DPR 5,0% Exatido 95% e 105% Robustez DPR 5,0%

Se os parmetros da validao analtica se enquadrarem dentro dos valores preconizados, o mtodo analtico desenvolvido pode se utilizar na rotina laboratorial para anlise do analito de interesse. Concluso Atualmente, com a melhoria dos Laboratrios de Controle de Qualidade, diante do aumento da automao, ou seja, do uso de equipamentos sofisticados, a confiabilidade no mtodo analtico torna maior, se o mesmo estiver integrado em um desenvolvimento analtico slido e bem avaliado, atravs de realizao de diversos experimentos e de levantamento bibliogrfico, e de uma validao analtica bem desempenhada, avaliando-se cada parmetro de performance, as incertezas no resultado analtico sero mnimas. Referncias bibliogrficas: M.P. Siqueira-Moura, M.C.B. Lira, N.S. Santos-Magalhes; Validao de mtodo analtico espectrofotomtrico UV; Revista Brasileira de Cincias Farmacuticas; vol. 44, n. 4, out./dez., 2008 NAIK, J. P. Improved high-performance liquid chromatography method to determine theobromine and caffeine in cocoa and cocoa products. J. Agric. Food Chem., Washington, v. 49, p. 3570-3583, 2001. RE 899, Guia para validao de mtodos analticos e bioanalticos; de 29 de maio de 2003. RDC 210, Boas Prticas para a Fabricao de Medicamentos; de 04 de agosto de 2003.