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CURSO DE CONTROL DE CALIDAD DE FITOFARMACOS, DICIEMBRE 3 AL 7, 2001

UNIVERSIDAD DE ANTIOQUIA FACULTAD DE QUMICA FARMACUTICA DEPARTAMENTO DE FARMACIA

GUIA PARA EL RECONOCIMIENTO DE DROGAS VEGETALES POR CROMATOGRAFA EN CAPA FINA

Elaborado por: GLORIA AMPARO VALENCIA P. ALEJANDRO MARTINEZ M.

Medelln, Diciembre de 2001

Gloria Amparo Valencia P., y Alejandro Martnez M.

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Prctica 1 RECONOCIMIENTO CROMATOGRFICO DE PLANTAS MEDICINALES APROBADAS EN COLOMBIA

RECONOCIMIENTO POR CROMATOGRAFA EN CAPA FINA DE AJENJO, Artemisia absinthium L., Asteraceae

Introduccin La droga la constituyen las hojas y flores. Las hojas contienen 0.3% de principios amargos (absinthina y anabsinthina), mientras que las flores contienen un 0.15%.

Extraccin 1 g. de droga pulverizada se extrae durante 10 minutos con 10 ml de Metanol a 60C sobre un bao de agua. La mezcla se filtra y el filtrado se evapora hasta un volumen aprox. de 2 ml. Fase estacionaria: Fase mvil: Revelador: Rf 0.3-0.4 Slica gel 60F-254 Cloroformo:Metanol 95:5 Liebermann-Burchard/UV 365 nm SIJSTANCIA Absinthina COLOR amarillo ocre

RECONOCIMIENTO POR CROMATOGRAFA EN CAPA FINA DEL AJO, Allium sativum, Liliaceae Introduccin El bulbo o diente contiene cistena, cistina, sulfxido de metionina, cicloalina, alina (= sulfxido de S-alilcistena), y deoxialina (=S-alil-cistena), junto con otros aminocidos azufrados y sulfxidos de cistena. Extraccin 25 g. de dientes frescos finamente desmenuzados se extraen en fro (con ayuda de hielo seco) con 2 porciones de 100 ml de metanol al 80%. Se purifica por cromatografa en columna, controlando las fracciones con Reactivo de Ninhidrina.
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Fase estacionaria: Fase mvil: Revelador:

Slica gel 60 n-Butanol : n-Propanol : Acido actico glacial : Agua 30 : 10 : 10 : 10 Ninhidrina

Rf 0.5 0.7

SUSTANCIA Alicina Alina

COLOR Naranja Azul-violeta

RECONOCIMIENTO DE LA ALCACHOFA POR CROMATOGRAFA EN CAPA FINA Introduccin La droga la constituyen las hojas, las cuales contienen sesquiterpenlactonas como cinaropicrina, grossheimina y cinarina; cidos fenolcarboxilicos como 1,3dicafeoilqunico, clorognico y neoclorognico; y luteolina-7-O-glucsido, un flavonoide. Extraccin 1 g. de droga pulverizada se extrae durante 10 minutos con 10 ml de metanol a 60C sobre un bao de agua. La mezcla se filtra y se evapora hasta un volumen de aprox. 2 ml Fase estacionaria: Fase mvil: Revelador: Slica gel 60F-254 Acetato de etilo:Acido frmico:Acido actico:Agua 100 : 11 : 11 : 27 Polietilnglicol para productos naturales/UV 365 nm

Rf 0.7 0.6 0.45 0.4

SIJSTANCIA Cinarina Luteolina-7-0-gluc. Acido clorognico Rutina

COLOR Azul fluorescente Amarillo Azul fluorescente Amarillo

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RECONOCIMIENTO POR CROMATOGRAFA EN CAPA FINA DE LA ALBAHACA, Ocimum basilicum, Lamiaceae Introduccin La droga la constituyen las hojas, las cuales contienen 0.1-0.45% de aceite esencial. El aceite esencial contiene principalmente metilchavicol 55% y linalool. Extraccin a) Por arrastre con vapor de agua Mtodo oficial de la Farmacopea Europea III, pg. 62. b) Con Diclorometano 1 g. de droga pulverizada se extrae por agitacin durante 15 minutos con 10 ml de diclorometano. El filtrado obtenido se evapora a sequedad. El residuo se disuelve en 1 ml de Tolueno, y se aplican 50-100 mL. en la placa cromatogrfica. Fase estacionaria: Fase mvil: Revelador: Rf 0.3 0.9 Slica gel 60 Tolueno : Acetato de Etilo 93 : 7 Vainillina- Acido sulfrico SUSTANCIA Linalool Metilchavicol COLOR Azul intenso Rojo violeta

RECONOCIMIENTO POR CROMATOGRAFA EN CAPA FINA DE LA HIERBABUENA, Mentha viridis L., Lamiaceae Introduccin La droga la constituyen las hojas y ramas jvenes, las cuales contienen 1.2% de aceite esencial. El aceite contiene principalmente L-carvona 42-67%, mentol, acetato de dihidrocarveol, alcohol dihidrocuminlico, pineno, limoneno y felandreno.

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Extraccin 1) Destilacin por arrastre con vapor de agua Se utiliza el mtodo oficial de la Farmacopea Europea III pg. 62 con 50 g de muestra, 500 ml de agua, 2 horas de destilacin a un flujo de 3-3.5 ml /min. 2) Extraccin con diclorometano Como se describi para la albahaca Fase estacionaria: Fase mvil: Revelador: Rf 0.25 0.46 0.7 Slica gel 60 Tolueno : Acetato de Etilo 93 : 7 Vainillina-Acido sulfrico SUSTANCIA Alcohol dihidrocumnico Carvona Acetato de dehidrocarveol COLOR Azul intenso Rojo-Violeta Azul intenso

RECONOCIMIENTO POR CROMATOGRAFA EN CAPA FINA DE HINOJO, Foeniculum vulgare, Apiaceae Introduccin La droga la constituyen los frutos, los cuales contienen 2-7% de aceite esencial. El aceite esencial contiene principalmente anetol (50-80% en la variedad dulce, 60-80% en la variedad vulgare), metilchavicol, safrol, anisaldehdo y fenchona (0.4-0.8% en la variedad dulce, 12-22% en la variedad vulgare). Extraccin 1) Destilacin por arrastre con vapor de agua Segn el mtodo oficial de la Farmacopea Europea III, pg. 62, utilizando 10 g. de muestra, 200 ml de agua, 2 horas de destilacin a una rata de 2-3 ml /min. 2) Extraccin con diclorometano Tal como se describi para la albahaca. Fase estacionaria: Slica gel 60 Fase mvil: Tolueno : Acetato de Etilo 93 : 7 Reveladores: 1.Vainillina-Acido sulfrico 2. PMA-Permanganato de potasio 3. Acido sulfrico concentrado

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Rf 0.6 0.9

SUSTANCIA Fenchona Anetol

REVELADOR 3 1 2 3

COLOR Azul oscuro Rojo-Violeta Rojo-Pardo Azul oscuro

Nota: La fenchona no se detecta en estas condiciones para el ans, lo que permite diferenciar las dos plantas. RECONOCIMIENTO POR CROMATOGRAFA EN CAPA FINA DE LA MALVA, Malva sylvestris, Malvaceae Introduccin La flor contiene la malvina, un pigmento que le confiere el color caracterstico. Extraccin 1 g. de droga pulverizada se extrae por agitacin durante 15 minutos con 6 ml de Metanol:Acido Clorhdrico (9 partes de metanol, 1 parte de cido al 25%). Se utilizan 25 ml del filtrado para la cromatografa. Fase estacionaria: Fase mvil: Reveladores: Slica gel 60F-254 n-Butanol : Acido actico glacial : Agua 40 : 10 : 20 Ninguno

Rf 0.4

SUSTANCIA Malvina (=Malvidin-3,5-diglucsido

COLOR Violceo

RECONOCIMIENTO POR CROMATOGRAFA EN CAPA FINA DE LA MANZANILLA MATRICARIA, Matricaria chamomilla, Asteraceae Introduccin La droga la constituyen las flores, las cuales contienen 0.5-1.5% de aceite esencial. El aceite esencial a su vez contiene chamazuleno 0-15%, bisabolol 10-25%, bisabolol xidos A y B (ambos 10-25%), polinas 1-40%, farneseno 15%.

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Extraccin a) Destilacin por arrastre con vapor de agua Segn mtodo oficial de la F. Eur. III pg. 62 con: 50 g de muestra, 500 ml de agua destilada de una solucin de cloruro de sodio al 1%, 4 horas de destilacin a 3-4 ml/minuto. b) Extraccin con Diclorometano Tal como se ha descrito para la albahaca. Fase estacionaria: Fase mvil: Revelador: Rf 0.2 0.25 0.35 0.5-0.6 0.95 0.99 Slica gel 60 Tolueno : Acetato de Etilo 93 : 7 Vainillina-Acido sulfrico SUSTANCIA Oxidos A y B de bisabolol Alcohol terpenoide Bisabolol Polinas Azuleno Farneseno COLOR Amarillo/Verde Violeta Violeta Pardo Rojo violeta Azul-Violeta

RECONOCIMIENTO POR CROMATOGRAFA EN CAPA FINA DEL ROMERO, Rosmarinus officinalis, Lamiaceae Introduccin Las hojas contienen 1-2% de aceite esencial, el cual contiene principalmente 1,8-cineol 15-30%, borneol 10-20%, acetato de bornilo, camfeno 5-10%, alfa- y beta-pineno. Extraccin a) Destilacin por arrastre con vapor de agua Segn mtodo oficial de la Farm. Eur. III pg. 62. b) Extraccin con diclorometano Tal como se describi para la albahaca. Fase estacionaria: Fase mvil: Revelador: Slica gel 60 Tolueno : Acetato de Etilo 93 : 7 Vainillina-Acido sulfrico

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Rf 0.25 0.45 0.7 0.99

SUSTANCIA Borneol Cineol Acetato de bornilo Alfa- y beta-pineno

COLOR Azul oscuro Azul intenso Azul intenso Violeta

RECONOCIMIENTO POR CROMATOGRAFA EN CAPA FINA DE LA SABILA, Aloe vera, Liliaceae Introduccin La droga la constituye el jugo desecado de las hojas el cual contiene 14-28% de principios antracnicos tales como alona, aloesinas A y B, aloinsidos A y B, etc. Extraccin 0.5 g. de droga pulverizada se extraen con 5 ml de Metanol, calentando durante 5 minutos sobre un bao de agua. El filtrado se aplica directamente sobre la placa cromatogrfica. Fase estacionaria: Fase mvil: Slica gel 60F-254 Acetato de etilo : Metanol : Agua 100 : 13.5 : 10 1) Hidrxido de potasio/UV 365 nm 2) Poiietilnglicol PN/UV 365 nm

Reveladores:

Rf 0.3 0.47 0.95 ---

SUSTANCIA Aloinsidos A y B Alona Alo-emodina Aloesinas A y B

REVELADOR 1y2 1y2 1 1

COLOR Amarillo Amarillo Rojo Azul fluorescente

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RECONOCIMIENTO POR CROMATOGRAFA EN CAPA FINA DE FLORES DE SAUCO, Sambucus nigra, Caprifoliaceae Introduccin La droga la constituyen las flores, las cuales contienen glicsidos de quercetina 1.5-3% como hipersido, isoquercitrina y rutina. Extraccin 1 g. de droga pulverizada se extrae con 10 ml de metanol durante 5 minutos sobre un bao de agua a aproximadamente 60 C. El filtrado se utiliza para la cromatografa. Fase estacionaria: Fase mvil: Slica gel 60F-254 Acetato de etilo : Acido frmico : Acido actico : Agua 100 : 11 : 11 : 27 1) R. productos naturales/UV 365 nm 2) Polietilnglicol para productos naturales/UV 365 nm

Reveladores:

Rf 0.4 0.7 0.9

SUSTANCIA Rutina Isoquercitrina Acido cafeico

COLOR Amarillo Amarillo Azul fluorescente

RECONOCIMIENTO POR CROMATOGRAFA EN CAPA FINA DE HOJAS DE TORONJIL, Melissa officinalis, Lamiaceae Introduccin Las hojas contienen 0.01-0.25% de aceite esencial, el cual est constituido principalmente de citronelal 39%, citral 30%, citronelol, linalool, geraniol y cariofileno. Extraccin a) Por arrastre con vapor de agua Segn el mtodo oficial de la Farmacopea Europea III pg. 62, con: 40 g. de muestra, 400 ml de agua, destilando a 2-3 ml/min durante 2 horas.

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b) Extraccin con Diclorometano Como se describi para la albahaca. Fase estacionaria: Slica gel 60 Fase mvil: Cloroformo Revelador: Anisaldehdo/Acido sulfrico Rf 0.7 0.45 0.25-0.4 SUSTANCIA Citronelal Citral Geraniol, linalool y Citronelol COLOR Azul intenso Azul violceo Azul violceo

RECONOCIMIENTO POR CROMATOGRAFA EN CAPA FINA DE RAICES DE VALERIANA, Valeriana officinalis, Valerianaceae Introduccin La droga la constituyen las races o rizomas que contienen los valepotriatos como: valtrato, isovaltrato, IVDH_valtrato, didrovaltrato y acevaltrato, cuya concentracin cambia de una variedad a otra. Adems contiene 0.25% de aceite esencial en los rizomas frescos, el cual contiene valerenal, valeranona y cido valernico. Extraccin 0.2 g. de droga pulverizada se extraen con 5 ml de diclorometano durante 5 minutos a unos 60 0C con agitacin ocasional. El residuo de la filtracin se lava con otros 2 ml de diclorometano. Los extractos combinados se evaporan a sequedad, y el residuo de disuelve en 0.2 ml de acetato de etilo. Se aplican en la cromatoplaca 10 microlitros de esta solucin. Fase estacionaria: Slica gel 60 Fase mvil: Tolueno : Acetato de etilo 75 : 25 Revelador: HCl concentrado : Acido actico glacial 2 : 8 Rf SUSTANCIA COLOR 0.73 Valtrato/Isovaltrato Azul 0.65 0.55 0.4 <0.4 Origen Didrovaltrato Acevaltrato IVDH-Valtrato Valtrahidrinas Productos de degradacin Pardo Azul Azul Azul

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Bibliografa 1. Domnguez, X. A., Mtodos de Investigacin Fitoqumica, Edit. Limusa, Mexico, 1973. 2. Wagner, H., Bladt, S., Zgainski, E. M., Plant Drug Analysis. A Thin Layer Chromatography Atlas, Springer-Verlag, Berlin-Heidelberg-New York-Tokyo, 1984. 3. Evans, W. C., Farmacognosia Trease-Evans, 13 edic., Interamericana McGraw-Hill, Madrid-Auckland-Bogot, 1991. 4. Harborne, J. B., Phytochemical Methods. A Guide to Modern Techniques of Plant Analysis, Chapman & Hall, London-Weinheim-New York, 1998. 5. Gattuso, M. A., Gattuso, S. J., Manual de Procedimientos para el Anlisis de Drogas en Polvo, UNR Editora, Cyted, Rosario (Argentina), 1999. 6. Ramrez, S., Fonnegra, R., Plantas Medicinales Aprobadas en Colombia, Universidad de Antioquia, Medelln, 1999. 7. http://matematicas.udea.edu.co/~carlopez/laboratorio/pagelab.html 8. http://muiscas.udea.edu.co/~amart/indice.html 9. http://matematicas.udea.edu.co/~carlopez 10. Stahl, E., Thin Layer Chromatography 11. Martnez, A., Farmacognosia y Fitoqumica Experimental, Universidad de Antioquia, Medelln, 1991. 12. Revistas especializadas: Phytochemistry, Planta Medica, Journal of Natural Products, Journal of Food and Agricultural Chemistry, etc. 13. Bases de datos: Napralert 14. Repblica de Colombia, Ministe rio de Salud, Decreto ley N 677, Ley del medicamento de 1994. 15. Quality Control Methods for Medicinal Plant Materials, World Health Organization, Geneva, 1998. 16. Sharapin, N., Fundamentos de Tecnologa de Productos Fitoterapeticos, Roberto Pinzn ed., Programa Iberoamericano de Ciencia y Tecnologa para el Desarrollo, Cyted, Santaf de Bogot D. C., 2000. 17. CD Farmacognosia y Fitoqumica, versin 2.0, Alejandro Martnez y Gabriel J. Arango, Universidad de Antioquia, Medelln, 2001.

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Prctica 2 DESARROLLO DE UN METODO CUANTITATIVO POR CCF-UV

CUANTIFICACION DE RUTINA EN FLORES DE SAUCO Y EN PARTES AEREAS DE PENSAMIENTO Introduccin La rutina es un glicsido flavonoide que se encuentra ampliamente distribuido en plantas y productos fitofarmacuticos. Esta amplia distribucin, junto con la facilidad en su deteccin a nivel de laboratorio mediante la cromatografa en capa fina (CCF) y la espectroscopia Ultravioleta (UV), la hacen un indicador adecuado para el reconocimiento y el control de calidad de productos fitofarmacuticos terminados o sus materias primas vegetales correspondientes. Procedimiento Preparar una solucin estndar de rutina en metanol de concentracin 100 ppm Tomar 1.2 ml de solucin completar a 10 ml y determinar el espectro UV entre 200 y 400 nm. Seleccionar la longitud de onda de trabajo. Para obtener la curva de calibracin, tomar alcuotas de la solucin estndar y llevar a 10 ml segn la tabla siguiente. Leer absorbancias de cada solucin a la longitud de onda de trabajo. Realizar una curva de Absorbancia vs. Concentracin en ppm. Alcuota (ml) 0.6 0.9 1.2 1.5 1.8 Volumen final (ml) 10.0 10.0 10.0 10.0 10.0 Absorbancia a 360 nm Concentracin de rutina (ppm)

La grfica muestra una curva de calibracin obtenida experimentalmente con una solucin estndar de rutina de concentracin aproximada a 100 ppm.

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Curva de calibracin de estndar de rutina
0,9

13

0,8

Absorbancia a 360 nm

0,7

0,6

0,5

y = 0,0352x + 0,037 2 R = 0,9906

0,4

0,3

0,2

0,1

0 0 5 10 15 20 25

Concentracin en metanol (ppm)

2. Extraccin de la droga 1 g de droga seca y en polvo (pesar con balanza de precisin 1 diezmilsima de gramo), se extrae con 10 ml de metanol, con agitacin, calentamiento en bao de agua a 60C, durante 10 minutos. Filtrar, lavar el filtrado dos veces con 10 ml de metanol (preferiblemente caliente), evaporar a sequedad y pesar el extracto obtenido. 3. Separacin mediante CCF Redisolver el extracto en 2 ml de metanol caliente y sembrar una banda en una cromatoplaca de slica gel GF-254 (20x10 cm, 1 mm espesor de capa), colocando al lado una aplicacin del estndar de rutina disuelto en metanol. Evaporar a sequedad el resto de extracto y pesar para determinar por diferencia el peso de extracto sembrado en CCF. Desarrollar en la mezcla Acetato de etilo/Acido frmico/Acido actico/Agua 100:11:11:2.7. La rutina se observa con un rf aproximado de 0.3, de color amarillo. Retirar la placa luego de desarrollar, dejarla secar en un extractor de vapores y analizarla con una lmpara UV a 254 nm. Demarcar la banda correspondiente a la rutina en la muestra, raspar y extraer con metanol caliente 3 veces (porciones de 5 a 10 ml). Los filtrados se concentran a sequedad y se redisuelven en 3 ml de metanol, medidos con exactitud.

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4. Lectura espectrofotomtrica y cuantificacin Leer absorbancia a 360 nm y determinar concentracin mediante interpolacin con la curva de calibracin. Determinar el porcentaje de rutina en la muestra y comparar con lo reportado para muestras autnticas.

CUANTIFICACION DE RUTINA EN UN JARABE DE SAUCO Introduccin La rutina es un glicsido flavonoide que se encuentra ampliamente distribuido en plantas y productos fitofarmacuticos. Esta amplia distribucin, junto con la facilidad en su deteccin a nivel de laboratorio mediante la cromatografa en capa fina (CCF) y la espectroscopia Ultravioleta (UV), la hacen un indicador adecuado para el reconocimiento y el control de calidad de productos fitofarmacuticos terminados o sus materias primas vegetales correspondientes. En este caso se propone un mtodo de cuantificacin en un jarabe. Procedimiento Preparar una solucin estndar de rutina en metanol de concentracin 100 ppm Tomar 1.2 ml de solucin completar a 10 ml y determinar el espectro UV entre 200 y 400 nm. Seleccionar la longitud de onda de trabajo. Para obtener la curva de calibracin, tomar alcuotas de la solucin estndar y llevar a 10 ml segn la tabla siguiente. Leer absorbancias de cada solucin a la longitud de onda de trabajo. Realizar una curva de Absorbancia vs. Concentracin en ppm. Alcuota (ml) 0.6 0.9 1.2 1.5 1.8 Volumen final (ml) 10.0 10.0 10.0 10.0 10.0 Absorbancia a 360 nm Concentracin de rutina (ppm)

2. Extraccin de la droga A partir de la informacin dada en la etiqueta por el fabricante tomar un volumen equivalente a 1 g de droga seca y en polvo (medir exactamente con material volumtrico). Evaporar a sequedad con ayuda de vaco y calentando a 60C. El residuo se extrae con 10 ml de metanol, con agitacin, calentamiento en bao

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de agua a 60C, durante 10 minutos. Filtrar, lavar el filtrado dos veces con 10 ml de metanol (preferiblemente caliente), evaporar a sequedad y pesar el residuo obtenido. 3. Separacin mediante CCF Redisolver el residuo en 2 ml de metanol caliente y sembrar una banda en una cromatoplaca de slica gel GF-254 (20x10 cm, 1 mm espesor de capa), colocando al lado una aplicacin del estndar de rutina disuelto en metanol. Desarrollar en la mezcla Acetato de etilo/Acido frmico/Acido actico/Agua 100:11:11:2.7. La rutina se observa con un rf aproximado de 0.3, de color amarillo. Retirar la placa luego de desarrollar, dejarla secar en un extractor de vapores y analizarla con una lmpara UV a 254 nm. Demarcar la banda correspondiente a la rutina en la muestra, raspar y extraer con metanol caliente 3 veces (porciones de 5 a 10 ml). Los filtrados se concentran a sequedad y se redisuelven en 3 ml de metanol, medidos con exactitud. 4. Lectura espectrofotomtrica y cuantificacin Leer absorbancia a 360 nm y determinar concentracin mediante interpolacin con la curva de calibracin.

Figura 1. Espectro UV de rutina en metanol

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CUANTIFICACION DE ANETOL EN SEMILLAS DE ANIS E HINOJO Introduccin El anetol es un fenilpropano que se encuentra distribuido en varias plantas aromticas. Esta amplia distribucin, junto con la facilidad en su deteccin a nivel de laboratorio mediante la cromatografa en capa fina (CCF) y la espectroscopia Ultravioleta (UV), la hacen un indicador adecuado para el reconocimiento y el control de calidad de productos fitofarmacuticos terminados o sus materias primas vegetales correspondientes. Procedimiento Preparar una solucin estndar de anetol en metanol de concentracin 100 ppm Tomar 1.2 ml de solucin completar a 10 ml y determinar el espectro UV entre 200 y 400 nm. Seleccionar la longitud de onda de trabajo. Para obtener la curva de calibracin, tomar alcuotas de la solucin estndar y llevar a 10 ml segn la tabla siguiente. Leer absorbancias de cada solucin a la longitud de onda de trabajo. Las absorbancias deben estar en el rango de 0.3 a 0.8, si no es as se debern preparar diluciones calculando absorbancias de 0.3, 0.4, 0.5, 0.6 y 0.7. Realizar una curva de Absorbancia vs. Concentracin en ppm. Alcuota (ml) Volumen final (ml) 10.0 10.0 10.0 10.0 10.0 Absorbancia a 360 nm Concentracin de rutina (ppm)

2. Extraccin de la droga 1 g de droga seca y en polvo (pesar con balanza de precisin 1 diezmilsima de gramo), se extrae con 10 ml de diclorometano, con agitacin, durante 15 minutos. Filtrar, lavar el filtrado dos veces con 10 ml de diclorometano, evaporar a sequedad y pesar el extracto obtenido.

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3. Separacin mediante CCF Redisolver el extracto en 1 ml de tolueno y sembrar una banda en una cromatoplaca de slica gel GF-254 (20x10 cm, 1 mm espesor de capa), colocando al lado una aplicacin del estndar de anetol disuelto en tolueno diclorometano. Evaporar a sequedad el resto de extracto no sembrado y pesar. Por diferencia determinar el peso de extracto sembrado. Desarrollar en la mezcla Tolueno/Acetato de etilo 93:7. Retirar la placa luego de desarrollar, dejarla secar en un extractor de vapores y analizarla con una lmpara UV a 254 nm. El anetol se observa a un Rf aproximado de 0.95. Demarcar la banda correspondiente al anetol en la muestra, raspar y extraer con diclorometano 3 veces (porciones de 5 a 10 ml). Los filtrados se concentran a sequedad y se redisuelven en 3 ml de metanol, medidos con exactitud. 4. Lectura espectrofotomtrica y cuantificacin Leer absorbancia a 360 nm y determinar concentracin mediante interpolacin con la curva de calibracin. Determinar el porcentaje de anetol en la muestra y comparar con lo reportado para muestras autnticas.

Figura 2. Espectro UV de anetol en metanol

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