ATLAS de HISTOLOG IA VEGETAL y ANIMAL

TECNICAS HISTOLOGICAS 2. INCLUSION

Pilar Molist Manuel A. Pombal Manuel Meg as Depto. de Biolog Funcional y Ciencias de la Salud a Facultad de Biolog a Universidad de Vigo
(Versin: Noviembre 2011) o

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Tcnicas histolgicas e o

Denominamos proceso histolgico a una serie de mtodos y tcnicas o e e utilizados para poder estudiar las caracter sticas morfolgicas y moleculares o de los tejidos. Hay diversos caminos para estudiar los tejidos, es decir, series de tcnicas que se utilizarn dependiendo de qu caracter e a e stica deseemos observar. En el siguiente esquema se muestran los mtodos y e tcnicas comnmente empleados para el procesamiento de los tejidos. Sin e u embargo, hay que tener en cuenta que existen muchas variantes a estos aminos su eleccin depender del resultado nal que queramos obtener. c o a
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Figura 1: Esquema del proceso histolgico dicotilednea. o o El proceso histolgico comienza con la obtencin del tejido objeto de o o 2

estudio. En el caso de los tejidos vegetales se toman muestras de los distintos rganos que componen el cuerpo de la planta, mientras que para o los tejidos animales podemos optar por dos opciones: coger una porcin de o dicho tejido o procesar una parte, rgano o parte corporal, o el animal o completo. En cualquier caso las muestras son habitualmente jadas con unos soluciones l quidas que contienen unas sustancias denominadas jadores, las cuales mantienen las estructuras celulares y moleculares en sus posiciones iniciales durante el procesamiento posterior. Tambin e podemos jar las molculas de los tejidos por congelacin rpida. Fijar un e o a tejido es como si hicisemos una fotograf del tejido que se e a mantendr hasta su observacin. Sin embargo, el uso de jadores o medios a o de inclusin afectan a veces las caracter o sticas tisulares que queremos observar y por tanto tenemos que recurrir a la congelacin para endurecer o el tejido para despus poder obtener secciones del mismo. e Normalmente, tras la jacin se procede a incluir el tejido para o posteriormente obtener secciones. Cuanto ms delgada queramos que sea a nuestra seccin ms tenemos que endurecer nuestra muestra. Esto se o a consigue embebiendo el tejido con sustancias l quidas que posteriormente polimerizarn (resinas) o se volvern consistentes (ceras). Tambin se a a e puede conseguir el mismo efecto mediante congelacin rpida. Cortes ms o a a gruesos de 40 m se pueden cortar sin necesidad de inclusin usando el o vibratomo. Los medios de inclusin son normalmente no hidrosolubles por o lo que tenemos que sustituir el agua de los tejidos por solventes orgnicos a liposolubles y posteriormente aadir el medio de inclusin. n o Tras la inclusin o la congelacin se procede a cortar los tejidos. Existen o o diferentes aparatos de corte que permiten conseguir secciones ultranas (del orden de nanometros), seminas (de 0.5 a 2 m), nas (entre unas 3 y 10 m) y gruesos (mayores a 10 m). Estas secciones hay que procesarlas para poder observarlas, aunque ciertos tipos de microscop por ejemplo a, con contraste de fase, permiten observar tejidos sin teir. Normalmente las n secciones se tien con colorantes que son hidrosolubles, por lo que hay que n eliminar el medio de inclusin para que los colorantes pueden unirse al o tejido. Las secciones, secciones ultranas, que se observan con el microscopio electrnico se pueden contrastar con metales pesados, opacos a o los electrones, sin eliminar la resina. Los tejidos procesados se observan con los microscopios. Existen dos tipos bsicos de microscopios: electrnico y ptico. Los primeros permiten a o o un gran poder de resolucin, pudindose observar caracter o e sticas ultraestructurales, mientras que los segundos, con menor poder de resolucin, ofrecen una gran versatilidad en cuanto a modos de observar los o 3

tejidos : uorescencia, contraste de fase, polarizacin o contraste de o interferencia diferencial. Como dijimos al comienzo existen mltiples variaciones sobre este u esquema general. Por ejemplo, se pueden observar tejidos con el microscopio electrnico de barrido sin necesidad de incluir ni cortar, pero o slo observaremos supercies. En las siguientes pginas veremos con cierto o a detalle algunas de las tcnicas ms empleadas para la observacin de los e a o tejidos.

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INCLUSION.

Una vez jado el tejido tenemos que procesarlo para su observacin con o el microscopio. Ello implica hacer secciones para teirlas primero y n posteriormente observarlas. Como regla general se procede al endurecimiento de la muestra para poder obtener dichas secciones ya que lo normal es que cuanto ms delgada queramos una seccin ms consistente a o a debe ser la muestra de la que se obtiene. Los tejidos se endurecen a consecuencia de la jacin, pero sta no es muy alta e impide la obtencin o e o de cortes generalmente ms delgados que 20 o 30 mum. Slo en el caso de a o que queramos trabajar con secciones relativamente gruesas (entre 30 y 200 mum) se puede aprovechar el endurecimiento provocado por el jador y obtener dichas secciones con el vibratomo, que se utiliza en ciertas tcnicas e donde es necesaria una buena preservacin molecular. Sin embargo, en o muchos casos necesitamos endurecer ms el tejido para obtener secciones a ms nas y se puede hacer de dos formas: congelacin e inclusin. a o o La congelacin de los tejidos previamente jados permite la obtencin o o de secciones que pueden ir desde unas 50 mum hasta nm, para lo que se utilizan diferentes aparatos: microtomo de congelacin para secciones de o decenas de mum, criostato para secciones de entre 5 y 20 mum y ultracriotomo para secciones ultranas del orden de nm. Para evitar los daos que se producen durante los procesos de congelacin, formacin de n o o cristales de hielo que nos agujerean los tejidos, se han de tener en cuenta dos procesos: a) Anticongelantes que impidan la formacin de cristales. El o crioprotector ms usado es la sacarosa al 30 %, aunque tambin se usa el a e dimetil sulfxido, el glicerol, etiln glicol y otros. La eleccin de uno u otro o e o depende del tipo de muestra y de la tcnica que se vaya a usar. b) Una e congelacin lo ms rpida posible, por ejemplo, con nitrgeno l o a a o quido. Cuanto ms rpida es la congelacin menores son las dimensiones de los a a o cristales de agua formados. La inclusin es el mtodo ms comn de endurecer el tejido y consiste o e a u en inltrar la muestra con sustancias l quidas que tras un proceso de polimerizacin o enfriamiento se solidican, sin afectar a las caracter o sticas del tejido. Con ello se consigue obtener cortes delgados (desde decenas de mum a nm segn el medio de inclusin) sin que el tejido se rompa o se u o deteriore. Adems son un buen mtodo de preservar las muestras durante a e largos periodos de tiempo. Existen diferentes sustancias o medios de inclusin dependiendo del grosor del corte y de la tcnica que necesitemos o e realizar. Cuando se quieren hacer secciones para su observacin con el o microscopio ptico los medios de inclusin ms frecuentemente usados son o o a 5

Figura 2: Se pueden obtener secciones de grosor variable utilizando diferentes mtodos. e

Secciones ms nas se obtienen endureciendo ms el tejido. Esto se puede conseguir mea a diante la congelacin o embebiendo el tejido en sustancias que solidican como la parana o o resinas. Tngase en cuenta que las dimensiones de los cortes y objetos del dibujo no e estn a escala. Una rejilla es mucho ms pequea que un portaobjetos. Las dimensiones a a n en mum y nm se reeren al espesor de las secciones.

la parana o la celoidina, mientras que si vamos a realizar observaciones con el microscopio electrnico la inclusin se realiza con resinas, o o principalmente de tipo acr clicas o epoxy. La mayor de los medios de a inclusin no son hidrosolubles, es decir, no miscibles con el agua, luego si o queremos que la sustancia en la que vamos a incluir ocupe todo el tejido tenemos que eliminar el agua y sustituirla por un l quido miscible con nuestro medio de inclusin. Si una muestra no est completamente o a embebida en el medio de inclusin se deteriorar y la obtencin de o a o secciones homogneas ser imposible. e a

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INCLUSION en PARAFINA.

Para la inclusin de muestras que han de observarse con microscop o a ptica se utiliza sobre todo la parana, y en menor medida la celoidina, o como medio de inclusin. Vamos a describir los pasos para la inclusin en o o parana de muestras de tejido previamente jadas. La parana es una sustancia de aspecto ceroso que est formada por a mezclas de hidrocarburos saturados. A temperatura ambiente es slida y o C seg n su composicin de su punto de fusin puede variar entre 40 y 70 o u o la mezcla de hidrocarburos. Resultan distintos tipos de paranas a temperatura ambiente que se emplean segn las necesidades. As paranas u , ms duras a temperatura ambiente tienen un punto de fusin mayor, a o mientras que las ms blandas uno menor. Es recomendable una dureza a mayor para incluir muestras ms duras. Las paranas ms usadas tienen a a un punto de fusin en torno a los 60 C. Podemos tambin modicar las o e caracter sticas de las paranas aadiendo sustancias para variar su dureza, n viscosidad, fragilidad, etctera. e La parana no es miscible con agua, mientras que todos los tejidos estn formados principalmente por agua. Adems, la mayor de los a a a jadores son soluciones acuosas. Esto implica que para que la parana l quida pueda penetrar completamente en el tejido ha de sustituirse el agua por un solvente orgnico. Esto se consigue mediante la deshidratacin del a o tejido en alcoholes, normalmente metanol, de gradacin creciente hasta o alcohol de 100 . Posteriormente se transere el tejido a un l quido que sea miscible tanto con el alcohol de 100 como con la parana, denominado sustancia intermediaria, como es el benceno, xileno, tolueno o el xido de o propileno, entre otros. Estas sustancias son normalmente aclarantes por lo que comprobando la translucidez de la pieza podemos cerciorarnos de la penetracin de la sustancia intermediaria en el tejido. El tiempo de o incubacin de la pieza algunos de estos l o quidos intermediarios como el tolueno o xileno no debe ser excesivo puesto que estas sustancias endurecen la pieza y provocar problemas hacer las secciones. Por ultimo se pasa el tejido a parana previamente licuada en una estufa regulada a la temperatura apropiada para dicho tipo de parana. Se dan tres pasos por parana para favorecer una buena impregnacin. El o tiempo que duran dichos pasos depende de lo voltil que sea el l a quido intermediario y lo grande que sea nuestra pieza. Ser mayor cuanto menos a voltil es el l a quido intermediario o mayor sea la muestra de tejido. Hay que tener en cuenta que un tiempo excesivo en parana puede endurecer el tejido. Tras el embebimiento completo de la muestra se vierte parana 7

l quida en un molde, se intruduce la muestra y se coloca segn la u orientacin deseada de corte y se deja solidicar a temperatura ambiente. o Un protocolo comn de inclusin en parana es el siguiente: u o

Figura 3: Esquema de la inclusin en parana de una muestra de tejido previamente o

jada. Los tiempos de incubacin en cada sustancia pueden variar en funcin del tamao o o n de la muestra, tipo de tejido o, por ejemplo, el l quido intermediario. Sin embargo, los

9 pasos son comunes a cualquier inclusin en parana. o

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INCLUSION en RESINA.

Para la observacin de la ultraestructura celular es necesario hacer o secciones de tejido muy delgadas denominadas ultranas, del orden de nanometros, y usar un microscopio electrnico de transmisin. La o o obtencin de secciones ultranas implica que tenemos que endurecer o enormemente el tejido. Esto se puede conseguir mediante congelacin, o obteniendo entonces la secciones con un ultracriotomo. Sin embargo, lo ms a frecuente es incluir el tejido en un material de alta dureza como son las resinas las resinas de tipo epoxy, y en menor medida las resinas acr licas, como el metacrilato. Ambas se inltran en el tejido en forma l quida y posteriormente polimerizan sin afectar a la ultraestructura celular. El procedimiento estndar de inclusin en resinas es similar al descrito a o para la parana con algunas modicaciones. As los pasos que se siguen , son jacin de las muestras, por inmersin o perfusin, deshidratacin, o o o o l quido intermediario, inltracin y polimerizacin en el medio de o o inclusin. Algunos medios de inclusin de tipo acr o o lico, por ejemplo la resina LR white, son parcialmente miscibles con el agua por lo que no es necesario pasar la muestra por solventes como el etanol absoluto, acetona o el xido de propileno, y adems polimerizan con luz ultravioleta a bajas o a temperaturas. Estos medios son buenos para estudios citoqu micos. a) Las soluciones jadoras suelen contener glutaraldeh y es necesaria do una postjacin posterior en tetrxido de osmio. Con ello nos aseguramos o o una fuerte jacin para preservar la ultraestructura celular y que no o perderemos los l pidos que forman las membranas celulares durante el proceso de inclusin, gracias al tetrxido de osmio. o o b) Partimos de tamaos de muestras mucho ms pequeas, de unos n a n pocos mil metros, puesto que no nos interesa ver la organizacin general o del tejido sino detalles del mismo. Si queremos observar zonas diferentes de un rgano es conveniente hacer bloques de muestra pequeos e o n independientes de cada una de ellas. c) La resinas ms comnmente usadas para la inclusin no son a u o hidrosolubles, por lo que tenemos que sustituir el agua del tejido por un solvente orgnico que sea miscible con la resina. Para ello se deshidrata el a tejido mediante incubaciones sucesivas en gradaciones crecientes de etanol o acetona, esta ultima es frecuentemente usada. Como l quido y las resinas se suele intermediario entre la acetona pura o etanol de 100 utilizar el xido de propileno. o d) El endurecimiento del medio de inclusin no es por enfriamiento sino o C, como la resinas tipo epoxy, o por polimerizacin, normalmente a 60 o 10

por exposicin a rayos ultravioleta a temperaturas en torno a los 20 C, o con es el caso del metacrilato. e) Al medio de inclusin, la resina, se le aaden aceleradores y o n plasticantes que regulan las caracter sticas de la polimerizacin y la o dureza de la resina polimerizada. El medio de inclusin ms usado para la observacin de la o a o ultraestructura celular son las resinas tipos epoxy puesto que son las que aportan una mayor homogeneidad en las polimerizacin y ms facilidad a o a la hora de obtener secciones regulares. Por el contrario las resinas acr licas presentan algunos inconvenientes y hay que ser muy cuidadosos a la hora de elegir las condiciones de polimerizacin, obtencin y tratamiento de los o o cortes ultranos. A continuacin se muestra un proceso de inclusin habitual en resinas o o de tipo epoxy.

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Figura 4: Esquema de la inclusin en resina de tipo epoxy de una muestra de tejido o

previamente jada. Los tiempos de incubacin en cada sustancia pueden variar en funcin o o del tamao de la muestra o tipo de tejido. n

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