Bioqumica Experimental II, PL2, 2011/2012, Professor: Carlos Farinha

Grupo 1: Alexandra Salvado 40267, Ana Lamy 40279, Andreia Sousa 40261 e Telmo Paiva 40243

Objectivos
Demonstrar a extenso da fosforilao obtida com diferentes substratos atravs do clculo da razo ADP/O; Demonstrar o grau de controlo respiratrio.

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Resumo
Clculo das
razes ADP/O

Calculou-se o controlo respiratrio

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Ensaios Razes ADP/O

O2 consumido para fosforilar uma mole de ADP a ATP

Razo ADP/O
Menos O2 consumido

Maior razo

Calculando a razo ADP/O podemos sequenciar os complexos da

cadeia transportadora de electres

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Ensaios Razes ADP/O

Complexo I ADP/O 3 So transportados da matriz 10 H+ Maior fora protomotriz; menor consumo de O2

Complexo II ADP/O 2

So transportados da matriz 6 H+

Complexo III ADP/O 1

So transportados da matriz 2 H+

Menor fora protomotriz; maior consumo de O2

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Ensaios Razes ADP/O

= = = 427,2 2 10 103 = 0,04272 A soluo de ADP tinha uma concentrao de 9,97 mM:

= 0,0426
Clculo da razo ADP/O: 1. Contar o nmero de quadrculas correspondente entre 100% e 0% de O2;

2. Sabendo a quantidade de O2 que se consome e o valor mximo (saturao a 25C), podemos calcular que quantidade de O2 se consome por quadrcula.
3. Saber as quantidades de O2 consumido em cada ensaio que se adiciona ADP

4. Dividir a quantidade de ADP que se adicionou por 2 vezes a quantidade de O2 consumido, obtendo a razo ADP/ O
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Ensaios Razes ADP/O

T (C) 0 5 10 15 20 14,16 14,37 10,92 9,76 8,84 0,442 0,386 0,341 0,305 0,276

25
30 35

8,11
7,52 7,02

0,253
0,230 0,219

Valor utilizado

0,253 106 () 0,253 = = 2,53 104 3 () 1 10 = 2,53 104 = 1,6 = 1,6 103 =
7

= 2 = 2,53 104 1,6 103 = ,

[O2]/mol

O2 (ppm)

O2 (mol/ml)

100% O2

0% O2 Vpapel/mm min-1
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Ensaios Razes ADP/O

[O2]/mol
4,048 10-7 mol O2 81 404,8 2 1 = 4,997 2 81 quadrculas Grupos 1 e 2

= 4,707 2
Grupos 3 e 4 0 mol O2 Vpapel/mm min-1
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NADH
Substrato do complexo I

NADH citoslico

Oxida-se na cadeia respiratria

Passagem para o interior do mitocndrio

Shuttle de malatoglutamato

http://pt.wikipedia.org/wiki/Ficheiro:NADH_Dehydrogenase_El ectron_Carriers_Unlabeled.png, consultado em 14-05-2012

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ADP
Com ADP Ocorre respirao

Mitocndrios acoplados

Sem ADP

Se h respirao
http://pt.wikipedia.org/wiki/Ficheiro:Adenosindiphosphat_proto niert.svg, consultado em 14-05-2012

Mitocndrios desacoplados
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CCP

Desacoplador

Dissipao do potencial de membrana

Maior Consumo de O2

No h gradiente protnico

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Razo ADP/O - NADH

Figura 1. Ensaio de NADH (G3).

ADP
NADH [O2]/mol

17 quadrculas
CCP

Vpapel/mm min-1 = 9,97 103 = 20 = 20 106 = = = 20 106 9,97 103 = 199,4 17 = 17 4,707 2 = 80,02 2

199,4 = = 1,25~1 2 80,02

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Malato-Glutamato
Substrato do complexo I
Malato-Glutamato

Lanadeira

NADH no interior da matriz mitocondrial

Aulas Tericas de Processos de Oxidao Reduo em Bioqumica 2011/2012

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Razo ADP/O Malato/Glutamato

Figura 2. Ensaio de malato-glutamato (G1).

[O2]/mol

Malato- ADP Glutamato

7 quadrculas

Vpapel/mm min-1

= 9,97 103 = 20 = 20 106 = 1,994 107 =

7 4,997 = 34,97 2 199,4 = 2,85~3 2 34,97

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Succinato
Substrato do complexo II

Succinato

e-

FAD e-

Consumo de O2

Cadeia respiratria

http://pt.wikipedia.org/wiki/Ficheiro:SuccDeh.svg, consultado em 14-05-2012

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Razo ADP/O - Succinato

Figura 3. Ensaio de succinato (G1). 8 quadrculas

[O2]/mol

Succinato ADP (20 L)

ADP (40 L)

16 quadrculas

Vpapel/mm min-1

= 20 = 20 106 = 199,4

= 9,97 103 = 40 = 40 106 = 399,8

8 4,997 109 = 399,8 16 4,997 = 79,95 2 2 199,4 199,4 = = = 2,45~2 2 39,98 2 79,95
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Ascorbato citocromo c
Substratos do complexo IV
Ascorbato: Actua na desintoxicao do perxido
de hidrognio, nas plantas
Ascorbato - http://pt.wikipedia.org/wiki/Ficheiro:LAscorbic_acid.svg, consultado em 14-05-2012

Citocromo c: Protena hmica solvel associada

membrana interna dos mitocndrios

Transfere
complexo

electres

entre

ubiquinol-citocromo C e o citocromo c
Citocrmo c http://pt.wikipedia.org/wiki/Ficheiro:Cytochrome_c.png, consultado em 14-05-2012 DQB-Licenciatura em Bioqumica

oxidoredutase oxidase
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Razo ADP/O Ascorbato-Citocromo c

Figura 4. Ensaio de ascorbato-citocromo c (G1).
ADP Ascorbato citocromo c

[O2]/mol

Vpapel/mm min-1

= 9,97 103 = 20 = 20 106 = 199,4

Os declives parecem coincidir

no se pode tirar concluses

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Razes ADP/O
Tabela 1. Razes ADP/O para cada um dos substratos utilizados.

Substrato NADH Malato/ Glutamato

Complexo I

Razo ADP/O 1,25 2,85 3

Succinato Ascorbato/ citocromo c

II IV

2,45

2 1

Quanto maior a razo ADP/O mais inicial o complexo na sequncia da cadeia respiratria Com base nas razes ADP/O obtidas experimentalmente, a sequncia da cadeia :

Malato-Glutamato
Complexo I
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Succinato
Complexo II

NADH
Complexo IV
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Razes ADP/O
A sequncia correcta da cadeia : NADH Malato-Glutamato
Complexo I

Succinato
Complexo II

AscorbatoCitocromo c
Complexo IV

Apenas a razo ADP/O para o NADH no coincide com o esperado

(3) O NADH no entra no mitocndrio e usado numa das desidrogenases alternativas ao complexo I que tm a capacidade de receber electres do NADH, havendo apenas a passagem de 6 H+ para o espao intermembranar, ao invs de 10 H+ Razo ADP/O 1

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Controlo Respiratrio
Estado 1 Mitocndrios na presena de Pi (fosfato inorgnico); Estado 2 Adio de substrato, respirao baixa devido falta de ADP; Estado 3 uma quantidade limitada de ADP adicionada, permitido uma respirao rpida; Estado 4 Todo o ADP foi convertido em ATP e a respirao torna-se lenta.

Permite saber se os mitocndrios se encontram ou no acoplados

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Controlo Respiratrio
Para o succinato:

Para o estado 3 tem-se: 10 1 30 = 3

3 8 4,997 2 1 = 13,3 2
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Controlo Respiratrio
Para o estado 4 tem-se: 10 1 29 = 2,9 O controlo respiratrio dado por: = 3 13,3 = = 3,87 > 1 4 3,45 2,9 2 4,997 109 1 = 3,45 2

Controlo Respiratrio > 1

Mitocndrios acoplados

No incio e no fim
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Ensaios Razes ADP/O - CONCLUSO

A razo ADP/O para complexos mais frente na cadeia transportadora de electres menor Para o mesmo volume de ADP adicionado, consome-se cada vez mais oxignio medida que se avana na cadeia Nos complexos mais frente na cadeia a fora protomotriz menor e, por isso, h menos energia para sintetizar ATP

necessrio consumir maior quantidade de oxignio para sintetizar a mesma quantidade de ATP

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Referncias
Nelson, D., Cox, M. (2008). Lehninger, Principles of Biochemistry, Fifth Edition. New York: W. H. Freeman and Company.

Cain, K. & Skilleter, D.N. (1987) Preparation and use of mitochondria in toxicological
research. In Biochemical Toxicology a practical approach (Snell, K. & Mullock, B., eds.), pp. 217-254, Oxford: IRL Press. Moore, A.L. & Whitehouse, D.G. (1997) Isolation and purification of functionally intact

mitochondria and chloroplasts from plant cells. In Subcellular fractionation a practical

approach (Graham, J.M., Rickwood, D., eds.), pp. 243-270, Oxford: IRL Press. Rickwood, D., Wilson, M.T., Darley-Usmar, V. (1987) Isolation and characteristics of intact mitochondria. In Mitochondria a practical approach (Darley-Usmar, V., Rickwood,

D., Wilson, M.T., eds.), pp. 1-16, Oxford: IRL Press.

Verleur, J.D. (1965) Studies on the Isolation of Mitochondria from Potato Tuber Tissue, Plant Physiol 40, pp.1003-1007.
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