Flores Avils Irving

Tpicos Selectos de Biotecnologa II

BIOINSECTICIDA BIFUNCIONAL: GENES Lin EN BACILLUS THURINGIENSIS SUBSP. AIZAWAI, PROTENAS CRY Y DEGRADACIN DE AGROTXICOS OBJETIVO: El objetivo consiste en clonar el gen Lin A de Sphingomonas japonicum UT26, primer paso en la ruta de degradacin de el compuesto organoclorado toxico lindano utilizado como insecticida qumico en Bacillus Thuringiensis Subsp. Aizawai para conferirle una doble funcin; la original como bioinsecticida a travs de las protenas cry y la segunda como degradador del agro toxic objetivo.

Fig 1. Primer paso de la Ruta de degradacin del Lindano en S.Japonicum UT26 (Ngata et al., 2010)

Material y Metodo. PLASMIDO. La razn por la cual se escoge el vector lanzadera E.coli-Bt pHT315 es porque este ha sido construido usando pHT1030 un fragmento de DNA 2.6-kb HpaI-BalI que contiene el origen de replicacin y la regin de estabilidad que fue aislado de un plasmido pHT1035 6.3-kb residente original estable de B.Thuriengiensis al cual se le quito el sitio de restriccin de HindIII previamente. Un fragmento 1.2-kb Kpn1-BamH1 que contiene el gen constitutivo de resitencia a eritromicina de Tn1545 (TrieuCuot et al., 1990). Se prosigui con que cada regin HpaI-BalI fue clonada en el sitio de restriccin SspI de pUC19 con el fragmento que contiene el gen de resistencia a eritromicina atraves de una ligacion conjunta en un solo paso(three-way ligation). (Arantes and Lereclus et al., 1991). Asi disponemos para su utilizacin del Sitio Multiple de Clonacin de pUC19 para introducir nuestro gen de inters.

Flores Avils Irving

Tpicos Selectos de Biotecnologa II

Se ha reportado que este vector funciona mejor en comparacin con otros vectores construidos debido a que presenta un mayor nmero de clonas. (Seker et al.,2005. Y debido a que se ha reportado que se han construido vectores en base a el E.coli/B.Thuringiensis vector lanzadera pHT135 para introducir genes en Bacillus thuringiensis subsp. Aizawai (Wang et al., 2006) y para sobreexpresar el gen cry3Aa11 de Bacillus thuringiensis subs Mm2 (Kurt y Ozcengiz et al. 2009)

Fig 2. Construccion del vector lanzadera E.Coli/B.Thuringiensis pHT135 (Arantes and Lereclus et al., 1991).

FRAGMENTO de DNA
Enzima de inters: gamma-hexaclorociclohexano deshidroclorinasa

LinA
gtgcgaaatg acttccacac actgattacc ccgcgctcac gccagagtac cctcaatggt tgtctacggc tgtctagatc aatgccggcc cccgtcacgg ttcgacgaga aaattccaag gttattggcc ccactctgca aatgagcttg actcat ttatg agcggggtga cgctcatact tttccaagga cgcagattgg aaatcgaggg tcatcccacc tcagagtaga cgccggacgg aatagttcgt catccgtgaa gaaggacgtc ttccataatg cgccttccgg aaatagaagc ggtcctgaat tgcgaaatga gcatgcgttg gaccgcagcg gccaatacca aatacattcg gcccttgtag gagacggccc cgcggcccgg atgccgggcg cgcttagaga ataagaatcg tttaccttgt tgaaacattg gtgccgattc tcttggcgct cttgcaagtc

atg Codon de inicio. tag Codon de paro

PRODUCTO="MSDLDRLASRAAIQDLYSDKLIAVDKRQEGRLASIWWDDAEWTI EGIGTYKGPEGALDLANNVLWPMFHECIHYGTNLRLEFVSADKVNGIGDVLLLGNLVEGNQSILIA AVFTDEYERRDGVWKFSKRNACTNYFTPLAGIHFAPPGIHFAPSGA"

Flores Avils Irving

Tpicos Selectos de Biotecnologa II

METODO: Ligacin por medio de enzimas de restriccin. Analizando los sitios de corte presentes en el fragmento de ADN de inters.

Habiendo identificado 2 enzimas de restriccin que no cortan el gen de inters y que estn presentes en el MCS de pUC19.

Flores Avils Irving

Tpicos Selectos de Biotecnologa II

Pasos:

1.- Incorporar los sitios de restriccin en el 5 terminal de los primers especficos Forward y Reverse para el gen. La amplificacin de LinA del genoma de S.Japonicum UT26 puede llevarse a cabo utilizando los siguientes primers.

FORWARD- 5-GTCGACTTATGCGCCGGACGGTGCGA-3

REVERSE- 5-CTGCAGATGAGTGATCTAGACAGACT-3

Flores Avils Irving

Tpicos Selectos de Biotecnologa II

2.-Realizar la amplificacin de el gen de inters con PCR, purificar el producto y digerir el amplicon del PCR con las enzimas de restriccin Sal y PstI. 3.- Paralelo a esto, digerir el vector lanzadera E.coli/B.Thuringiensis pHT315 con las mismas enzimas de restriccion.

4.- Ligar el producto de PCR y el vector, previamente digeridos.

Flores Avils Irving

Tpicos Selectos de Biotecnologa II

Se utiliza el pUC19 dado que nicamente se requiere asegurar que el gen puede ser introducido en el MCS de este con los primers diseados puesto que pUC19 es parte de el vector lanzadera E.coli/B.Thuringiensis pHT135. Conclusiones: El desarrollo de una nuevas estrategias de clonacin y la construccin de nuevos vectores de expresin en Bacillus Thuringiensis nos permitir ampliar la gama de compuestos organicos persistentes y toxicos para el medio ambiente que Bt podra degradar mientras realiza su funcin principal de bioinsecticida. Como primer acercamiento se introdujo el Gen LinA a Bt en este trabajo, pero se deben de adapatar las tecnologas recientes como MultiSite Gateway Pro Kits para poder clonar hasta 4 o mas fragmentos de DNA de inters que participan en la ruta de degradacin de inters.

Flores Avils Irving

Tpicos Selectos de Biotecnologa II

Comprobando el marco de lectura

Referencias:
Arantes, Lereclus (1991) Gene. 108 115-l 19 Kurt, Ozcengiz (2011) Turk J Biol35 585-592 Lin-Chao, S., Chen, W.-T. and Wong, T.-T. (1992) Mol. Microbiol., 6, 33853393 Sansinenea, Vazquez, Ortiz.(2010) Biotechnol Lett 32:15491557

S. Thamthiankul . W. J. Moar . M. E. Miller .W. Panbangred (2004) Appl Microbiol Biotechnol (2004) 65: 183192 Ginxin Yan, Fuping Song (2009) Biotechnol Lett 31:697703

Guangjun Wang . Jie Zhang . Fuping Song . Jun Wu . Shuliang Feng Dafang Huang (2006) Appl Microbiol Biotechnol 72: 924930